Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.

1. Condizioni di crescita SCV e attivazione fisiologica del percorso di salvataggio
<ol><li>Rilevamento di SCV.<ol>
<li>Streak il P. aeruginosa ceppi PAO1, PAO1pyrD, PAO581, e PAO581pira su preriscaldato Pseudomonas agar (PIA) e crescere a 37 gradi centigradi per 48 h. Sulla piastra di crescita identificare un singolo isolato colonia che ha il fenotipo SCV (dimensione della colonia di 1,3 mm in contrapposizione alla dimensione normale della colonia 3-5 mm).</li>
		<li>Ripetere il pas...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Sia SCV che algerato sono importanti marcatori di malattia implicati in diverse infezioni croniche. Pertanto, la capacità di far crescere sCV e di studiare la regolazione e la produzione di alginato da P. aeruginosa è parte integrante della scoperta di nuovi trattamenti per queste malattie croniche.
I ceppi DiCV sono notoriamente difficili da coltivare a causa del loro tasso di crescita lento4 rispetto ad altri ceppi P. aeruginosa, che aiuta nella lo...

Le infezioni polmonari croniche con Pseudomonas aeruginosa sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con fibrosi cistica (CF). Durante la prima infanzia, i pazienti sono colonizzati da più patogeni batterici tra cui isolati non mucoidi di P. aeruginosa1,2. L'emergere della variante della piccola colonia (SCV) isola così come gli isolati mucoidi è un marcatore per l'insorgenza delle infezioni croniche. Gli isolati di SCV sono altamente resistenti ai farmaci3 a causa dei loro lenti tassi di crescita4, il che li rende un grave deterrente nei reggimenti di trattamento e altre infezioni croniche5 da P. aeruginosa. Il lavoro di Al Ahmar et al.6 ha mostrato un legame tra SCV e mucoidy collegato dalla biosintesi della pirimofina de novo. La fame di pirimidine, a causa di mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di pirimidine, ha portato al fenotipo SCV nel ceppo di riferimento non mucoide PAO1 e alla derivata mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
Anche se la sovrapproduzione algerata è un importante marcatore di malattia per le infezioni polmonari croniche nella CF, non è chiaro se esista una correlazione diretta tra la quantità di patologia alginata e polmonare, e non è chiaro se l'alginato possa essere utilizzato come marcatore di prognosi per il trattamento7. La produzione di alginati è regolata principalmente da due operoni, un operone normativo (algUmucABCD)8,9 e l'operone biosintetico ( operonealgD) 10,11. La produzione di algerino è strettamente regolata dal fattore sigma AlgU9,12 (noto anche come AlgT) e dalla degradazione del fattore anti-sigma MucA13. La capacità di monitorare la produzione di algerino in situ dai campioni di espettorato dei pazienti può aiutare nello sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.
Qui, descriviamo una condizione di crescita che rileva la presenza di SCV causata da mutanti che non possono sintetizzare la pirimidine de novo. Il completamento dell'uracile e/o della citosina, la base azotata del nucleotide pirimidine, a medio attiva il percorso di recupero, ripristinando così la normale crescita nei mutanti. Questo metodo di crescita per questi specifici mutanti SCV può essere utilizzato come metodo di screening per identificare le mutazioni della pirimofina nei campioni di pazienti. Inoltre, discutiamo due metodi per il rilevamento e la misurazione di alginato prodotto e secreto da P. aeruginosa. Il primo è il metodo tradizionale14,15,16 di degradare il polisaccaluro utilizzando un'alta concentrazione di acido e quindi l'aggiunta di un indicatore colorimetrico per quantificare la concentrazione nel campione. Il secondo metodo, sviluppato nel nostro laboratorio, utilizza l'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-alginato (mAb) sviluppato da QED Biosciences. Il metodo ELISA si dimostra più specifico e sensibile rispetto all'acido uronico e consente un uso più sicuro a causa dell'evitamento dell'acido solforico altamente concentrato. Con la capacità dell'ELISA di essere utilizzato direttamente su campioni di espettorato del paziente per misurare l'alginato, può essere sviluppato come strumento diagnostico di monitoraggio per seguire la quantità di alginato presente nei polmoni in diversi periodi dell'infezione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico, può sovraprodurre un algiato esopolisaccare risultante in un fenotipo unico chiamato mucoidy. L'alginato è collegato a infezioni polmonari croniche con conseguente prognosi infagnata in pazienti con fibrosi cistica (CF). Comprendere i percorsi che regolano la produzione di alginato può aiutare nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla formazione altata. Un altro fenotipo correlato alla malattia è la variante della piccola colonia (SCV). SCV è dovuto alla lenta crescita di batteri e spesso associato ad una maggiore resistenza agli antimicrobici. In questo articolo, mostriamo per la prima volta un metodo per coltivare una forma geneticamente definita di P. aeruginosa SCV a causa di mutazioni della biosintesi pirimofina. Il completamento di basi azotate, uracil o citosina, restituisce la normale crescita a questi mutanti, dimostrando la presenza di un percorso di recupero che sbircia basi libere dall'ambiente. Successivamente, discutiamo due metodi per la misurazione dell'alginato batterico. Il primo metodo si basa sull'idrolisi del polisaccharide al suo monomero acido uronico seguito dalla derivazione con un reagente cromogenico, il carbazole, mentre il secondo metodo utilizza un ELISA basato su un mAb commercialmente disponibile, specifico per algerino. Entrambi i metodi richiedono una curva standard per la quantificazione. Dimostriamo anche che il metodo immunologico è specifico per la quantificazione alginata e può essere utilizzato per la misurazione dell'alginato nei campioni clinici.

La figura 1 mostra piastre di PAO1 e PAO581 con o senza delezione in-frame nel gene pyrD (un gene nel percorso di biosintesi pirimidina) che si traduce in SCV6. Il mutante PAO1 SCV è stato riportato alla normale crescita in risposta al completamento dell'uracile (Figura 1A,B). Inoltre, il mutanteSCVPAO581 è stato restituito alla mucoidy con lo stesso trattamento dell'ur...

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Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Qui, descriviamo una condizione di crescita alla cultura la piccola variante colonia di Pseudomonas aeruginosa. Descriviamo anche due metodi distinti per il rilevamento e la quantificazione dell'algerino exopolysaccharide prodotto da P. aeruginosa utilizzando un tradizionale saggio di carbazole di acido uronico e un anticorpo monoclonale specifico algerino (mAb) a base di ELISA.

Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

La variante di piccola colonia o tecnica SCV consente la selezione e la crescita di piccole varianti di colonia di Pseudomonas aeruginosa. Il metodo è molto definitivo e consente una selezione più semplice rispetto ai metodi normali. Questo protocollo descrive inoltre un metodo ELISA più sicuro e sensibile per la quantificazione degli alginati rispetto al metodo standard del carbazolo dell'acido uronico, consentendo la quantificazione diretta dell'alginato nei campioni senza cautery o manipolazione del campione.A dimostrare la procedura saranno Brandon Kirby, un tecnico di laboratorio, e Roy Al Ahmar, uno studente laureato del mio laboratorio. Per rilevare la variante di piccola colonia o SCV, prima striscia il ceppo P.aeruginosa PAO1 delta PYRD su piastre PIA prerifodate. Far crescere i ceppi a 37 gradi Celsius per 48 ore.Sulla piastra di crescita, identificare una singola colonia isolata che ha il fenotipo SCV caratterizzato da una dimensione della colonia da uno a tre millimetri rispetto alla normale dimensione della colonia da tre a cinque millimetri. Ristriature le colonie selezionate per ottenere un isolato puro della SCV. Per eseguire l'attivazione fisiologica della via di recupero, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per preleviare la colonia SCV dalla piastra PIA.Striare la colonia selezionata su una piastra PIA pre-riscaldata integrata con 0,1 millimolare di uracile. Far crescere il piatto a 37 gradi Celsius per 24-48 ore. Per iniziare il saggio di carbazolo dell'acido uronico, identificare una singola colonia da una coltura pura del ceppo desiderato da testare e raccogliere la colonia usando uno stuzzicadenti sterile.Posizionare lo stuzzicadenti in una provetta di coltura contenente cinque millilitri di PIB. Crescere in un incubatore shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere un'aliquota del brodo PIB coltivato su una piastra PIA preri warmed.Utilizzando uno spargitore di cellule sterile, stendere il brodo sul piatto e crescere a 37 gradi Celsius per 24 ore. Utilizzando un controller di pipetta e una pipetta sterile da 50 millilitri, aggiungere lo 0,85% di cloruro di sodio al prato adulto e raccogliere il campione raschiando la piastra utilizzando uno spargitore di cellule. Aspirare il campione utilizzando una pipetta fresca da 50 millilitri e trasferirlo in un tubo di raccolta da 50 millilitri.Vortice il campione in alto per mescolare e posizionare i campioni sul ghiaccio. Per misurare l'OD600 dei campioni, prima spegnete lo spettrofotometro utilizzando un millilitro di cloruro di sodio allo 0,85%. Quindi aggiungere un millilitro del campione a una nuova cuvetta usa e getta e leggere l'OD. Ripetere questo passaggio due volte per ottenere un triplice di letture per ogni campione.Ora aggiungi tre millilitri della soluzione di borato di acido solforico in tubi di coltura e lascia riposare sul ghiaccio. Aggiungere lentamente 350 microlitri del campione raccolto alla miscela acida nelle provette. Dopo aver brevemente vortice basso, aggiungere 100 microlitri di soluzione allo 0,1% di carbazolo ed etanolo alla miscela di campioni acidi.Fissare il tubo e il vortice sull'impostazione media per cinque secondi. Quindi mettere in un bagno asciutto a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, vortice i tubi brevemente in alto e lasciare raffreddare per cinque minuti.Utilizzare il tubo con cloruro di sodio allo 0,85% come vuoto per lo spettrofotometro. Quindi aggiungere un millilitro della miscela a una cuvetta pulita e leggere l'OD dei campioni a 530 nanometri su uno spettrofotometro. Preparare una curva standard misurando l'OD530 delle diluizioni seriali di concentrazioni note di acido d-mannuronico.Ripetere due volte ed estrarre un'equazione lineare da queste letture. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione usando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD600 per ottenere la quantità totale di alginato per OD600. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 50 microlitri del campione raccolto a una piastra non trattata da 96 potte.Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di rivestimento ELISA ai pozzi. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore. Utilizzando un flacone di schizzi, lavare i poggiale due volte con PBS-T riempiendo i pozzi e quindi drenandoli capovolgendo la piastra.Aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco ai pozzi con una micropipetta e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare il piatto due volte con PBS-T come prima. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario diluito ai pozzi e incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore.Dopo l'incubazione, lavare i pozzi della piastra tre volte con PBS-T come prima. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito ai pozzi e incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore. Dopo aver lavato di nuovo la piastra tre volte, utilizzare una micropipetta per aggiungere 100 microlitri di soluzione TMB ELISA.Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al buio posizionando la piastra in un cassetto o avvolgendo in un foglio. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'OD a 450 nanometri.Produrre una curva standard misurando l'OD450 di diluizioni seriali di concentrazioni note di acido d-mannuronico. Ripetere le misurazioni due volte ed estrarre un'equazione lineare. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione usando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD600 per ottenere la quantità totale di alginato per OD600.Qui sono mostrati campioni di PAO581 e PAO581 con mutazioni in geni che regolano la biosintesi della pirimidina de novo coltivata su PIA e PIA integrata con 0,1 millimolare di uracile. I dati mostrano che la presenza di uracil nei media si traduce nella conversione del ceppo mutante in mucoidia come visto dalla produzione di alginato restaurata. Qui vengono mostrati i risultati per l'ELISA a base di anticorpi monoclonali anti-alginato.Le colonie sono coltivate su piastre PIA con arabinosi per l'induzione del promotore PBAD e del plasmide pHERD-20T. Sono mostrati PAO1, PAO1 che porta l'espressione pHERD-20T con il principale algU del fattore sigma specifico alginato, e PAO1 con una cancellazione in-frame del gene algD nella codifica dell'enzima biosintetico alginato chiave GDP-mannosio deidrogenasi. Questi dati confrontano i livelli non mucoidi di alginato misurati per pao1 e pao1 delta algD rispetto ai livelli mucoidi di alginato misurati per PAO1 con algU pHERD-20T.L'ELISA anti-alginato è stato testato anche su campioni di espettorato del paziente senza crescita preventiva sulle piastre. Tre campioni di espettorato di CF che hanno avuto una crescita di P.aeruginosa mucoide hanno mostrato alginato rilevabile rispetto a due campioni di espettorato del paziente che contenevano P.aeruginosa non mucoide o nessuna crescita di P.aeruginosa. La preparazione delle curve standard per la quantificazione dell'alginato è molto cruciale in quanto ciò consentirà una misurazione precisa e accurata dell'alginato all'interno del campione.La soluzione acida utilizzata nel metodo carbazolo è molto pericolosa, per cui devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale e precauzioni per garantire la sicurezza. Dopo aver isolato gli SPV, è possibile fare un ulteriore profilo genetico per comprendere meglio le mutazioni che si verificano e la patogenicità associata a tali mutazioni. Il metodo ELISA può essere adattato per monitorare l'infezione polmonare cronica nei pazienti con fibrosi cistica.Inoltre, il nostro metodo di crescita potrebbe aiutare a diagnosticare le infezioni causate da specifici SPV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...