Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
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この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545とP20GM103434によってサポートされました。

1. SCVの成長条件とサルベージ経路の生理的活性化
<ol><li>SCV の検出。<ol>
<li>P.エルギノーサ株株PAO1、PAO1Δ pyrD、PAO581、PAO581、PAO581ΔpyrDをプレウォームドシュードモナス分離寒天(PIA)プレート上にストリークし、37°Cで48時間成長する。成長プレート上で、SCV表現型(通常の3〜5mmのコロニーサイズとは対照的に1〜3mmのコロニーサイズ)を有する単一コロニー分離物を特定?...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

SCVおよびアルギン酸は、いずれもいくつかの慢性感染症に関与する重要な疾患マーカーである。したがって、SCVを成長させる能力だけでなく、P.エルギノーサによるアルギネートの調節と生産を研究することは、これらの慢性疾患に対する新しい治療法の発見に不可欠です。
SCV株は、その他のP.エルギノーサ株と比較して成長速度4が遅いた...

緑膿菌による慢性肺感染症は、嚢胞性線維症(CF)患者における罹患率および死亡率の主な原因である。幼児期には、患者はP.エルギノーサ1、2の非粘性分離株を含む複数の細菌病原体によって植民地化される。小コロニー変異体(SCV)分離株の出現は、ムコイド分離株と同様に、慢性感染症への発症のマーカーである。SCV分離株は、その遅い成長率4のために非常に薬剤耐性3であり、P.アルギノーサによる治療連隊および他の慢性感染症5で重度の抑止力を与える。Al Ahmar et al.6の研究は、デノボピリミジン生合成によって連結されたSCVとムコイドとの間のリンクを示した。ピリミジン飢餓は、ピリミジン産生に関与する遺伝子の変異に起因して、非粘性体参照株PAO1および粘液誘導体PAO581(PAO1mucA25)におけるSCV表現型をもたらした。
CFにおける慢性肺感染症の重要な疾患マーカーであるアルギン酸過剰産生が重要な疾患マーカーであるにもかかわらず、アルギン酸の量と肺病理との間に直接的な相関関係があるかどうかは明らかではなく、また、アルギン酸塩を治療7の予後マーカーとして用いることができるかどうかは不明である。アルギン酸産生は主に2つのオペロンによって調節され、調節性オペロン(algUmucABCD)8、9および生合成オペロン(algDオペロン)10、11。アルギン酸産生は、シグマ因子AlgU9、12(別名AlgT)および抗シグマ因子MucA13の分解によって厳しく調節される。患者の痰標本からのその中のアルギン酸塩の産生を監視する能力は、新しい治療オプションの開発に役立つ可能性があります。
ここで、ピリミジン・デ・ノボを合成できない変異体によって引き起こされるSCVの存在を検出する増殖条件を説明する。ウラシルおよび/またはシトシンの補充は、ピリミジンヌクレオチドの窒素塩基を、培地に対して、サルベージ経路を活性化し、したがって突然変異体における正常な増殖を回復させる。この特定のSCV変異体の増殖方法は、患者試料中のピリミジン変異を同定するスクリーニング方法として用いることができる。また、P. eeruginosaによって生成され分泌されるアルギン酸塩の検出と測定の2つの方法について議論する。最初は、高濃度の酸を用いて多糖類を分解し、次いで、サンプル中の濃度を定量するために測色指標を加える従来の方法14、15、16である。2つ目の方法は、当社の研究室で開発された、QEDバイオサイエンスが開発した抗アルギン酸モノクローナル抗体(mAb)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を利用しています。ELISA法は、ウロン酸アッセイよりも特異的で感度が高く、高濃度硫酸の回避により、より安全な使用を可能にします。ELISAの能力を、患者痰サンプルに直接使用してアルギン酸を測定し、感染の異なる期間に肺に存在するアルギネートの量に従うモニタリング診断ツールとして開発することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

日和見グラム陰性細菌病原体である緑膿菌は、無菌性アルギン酸を過剰産生し、粘性イチと呼ばれる独特の表現型を生じさせる。アルギン酸は、嚢胞性線維症(CF)患者の予後不良をもたらす慢性肺感染症に関連している。アルギン酸の産生を調節する経路を理解することは、アルギン酸形成を標的とする新しい治療戦略の開発に役立つ可能性がある。もう1つの疾患関連表現型は小コロニー変異体(SCV)である。SCVは、細菌の増殖が遅いため、しばしば抗菌薬に対する耐性の増加に関連しています。本論文では、まずピリミジン生合成変異による遺伝子的に定義された形態のP.エルギノーザSCVを培養する方法を示す。窒素塩基、ウラシルまたはシトシンの補充は、これらの突然変異体に正常な成長を戻し、環境から遊離塩基を清掃するサルベージ経路の存在を実証する。次に、細菌性アルギン酸の測定方法を2つ検討する。第1の方法は、そのウロン酸モノマーに多糖類の加水分解に依存し、続いて発色試薬、カルバゾールによる誘導体化を行い、第2の方法は市販のアルギン酸特異的mAbに基づくELISAを使用する。どちらの方法でも、定量に標準曲線が必要です。また、免疫学的方法はアルギン酸定量に特異的であり、臨床検体におけるアルギン酸塩の測定に使用することができることも示した。

図1は、PyrD遺伝子(ピリミジン生合成経路の遺伝子)中でフレーム内欠失の有無に関するPAO1およびPAO581のプレートを示す。このPAO1 SCV変異体は、ウラシル補給に応答して正常な成長に回復した(図1A、B)。さらに、PAO581ΔのsCV変異体は、同じウラシル処理で粘膜に戻されたが、親株PAO581...

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Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

ここで、緑膿菌の小コロニー変異体を培養する成長条件について説明する。また、従来のウロン酸カルバゾールアッセイとアルギン酸特異的モノクローナル抗体(mAb)ベースのELISAを用いて、P.アルギノーサが産生するエキソ多糖アルギン酸塩の検出と定量の2つの方法についても説明する。

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

小コロニー変異体またはSCV技術は、緑膿菌の小コロニー変異体の選択および成長を可能にする。この方法は非常に決定的であり、通常の方法よりも簡単に選択できます。このプロトコルはまた、標準的なウロン酸カルバゾール法と比較して、より安全で、より敏感なELISA定量法を詳述し、焼灼またはサンプル操作を行わずにサンプル中の直接アルギン酸定量を可能にする。この手順のデモンストレーションは、ラボ技術者のブランドン・カービーと、私の研究室の大学院生であるロイ・アル・アフマーです。小コロニー変異体またはSCVを検出するために、最初にP.aeruginosa株PAO1デルタPYRDを事前に温められたPIAプレートにストリークする。48時間摂氏37度で株を成長させます。成長プレート上で、通常の3〜5ミリメートルのコロニーサイズとは対照的に、1〜3ミリメートルのコロニーサイズを特徴とするSCV表現型を有する単一コロニー分離株を同定する。選択したコロニーを再ストリークして、SCVの純粋な分離物を得る。サルベージ経路の生理的活性化を行うために、滅菌接種ループを使用してPIAプレートからSCVコロニーをピックする。選択したコロニーを、0.1ミリモルウラシルを補った事前に温めたPIAプレートに付ける。24〜48時間摂氏37度でプレートを成長させます。ウロン酸カルバゾールアッセイを開始するには、試験対象の株の純粋な培養物から単一コロニーを同定し、滅菌爪楊枝を使用してコロニーを選ぶ。5ミリリットルのPIBを含む培養試験管に爪楊枝を入れる。24時間摂氏37度でシェーカーインキュベーターで成長します。インキュベーションに続いて、培養PIBスープのアリコートを事前に温めたPIAプレートに加えます。無菌細胞スプレッダーを使用して、プレート上にスープを広げ、24時間摂氏37度で成長させます。ピペットコントローラと無菌50ミリリットルピペットを使用して、大人の芝生に0.85%塩化ナトリウムを加え、セルスプレッダーを使用してプレートを削ってサンプルを収集します。新鮮な50ミリリットルピペットを使用してサンプルを吸引し、50ミリリットルの回収管に移す。サンプルを高く渦を混ぜて混合し、氷の上に置きます。試料のOD600を測定するために、まず0.85%塩化ナトリウムの1ミリリットルを用いて分光光度計をブランクにする。次に、サンプルの1ミリリットルを新しい使い捨てキュベットに加え、ODを読み取ります。この手順を 2 回繰り返して、サンプルごとに読み取りの三重を取得します。硫酸ホウ酸溶液を培養管に3ミリリットル加え、氷の上に座らせます。採取したサンプルの350マイクロリットルを試験管の酸混合物にゆっくりと加えます。低い上で短時間ボルテックスした後、酸サンプル混合物に0.1%カルバゾールとエタノール溶液の100マイクロリットルを加えます。中程度の設定にチューブと渦を5秒間キャップします。その後、30分間摂氏55度の乾燥した風呂に入れます。インキュベーションの後、チューブを一時的に高く渦を出し、5分間冷却します。分光光度計にブランクとして0.85%塩化ナトリウムを有するチューブを使用してください。その後、混合物の1ミリリットルをきれいなキュベットに加え、分光光度計で530ナノメートルのサンプルのODを読み取ります。既知濃度のd-マンロン酸のOD530の連続希釈を測定して標準曲線を調製する。2回繰り返し、これらの測定値から線形方程式を抽出します。標準曲線を用いて各試料中のアルギン酸塩の濃度を計算し、OD600で直鎖式からアルギン酸濃度を割り出し、OD600当たりのアルギン酸の総量を求める。マイクロピペットを使用して、回収したサンプルの50マイクロリットルを未処理の96ウェルプレートに加えます。その後、ウェルにELISAコーティングバッファーの50マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。ホヤボトルを使用して、井戸を充填し、プレートをひっくり返してそれらを排出することによってPBS-Tでプレートウェルを2回洗います。マイクロピペットでウェルに200マイクロブロッキングバッファーを加え、一晩で摂氏4度でインキュベートします。翌日、皿を前のようにPBS-Tで2回洗います。その後、希釈された一次抗体の100マイクロリットルを井戸に加え、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。インキュベーションに続き、プレートウェルを以前のようにPBS-Tで3回洗浄します。次に、希釈した二次抗体を100マイクロリットルのウェルに加え、摂氏37度で1~2時間インキュベートします。プレートを再度3回洗浄した後、マイクロピペットを使用して100マイクロリットルのTMB ELISA溶液を添加する。プレートを引き出しに入れるか、ホイルで包むことによって、暗闇の中で30分間室温でプレートをインキュベートします。その後、100マイクロリットルのストップ溶液を加えます。プレートリーダーを使用して、450ナノメートルでODを測定します。既知濃度のd-マンロン酸の直列希釈液のOD450を測定することにより、標準曲線を生成します。測定を2回繰り返し、線形方程式を抽出します。標準曲線を用いて各試料中のアルギン酸塩の濃度を計算し、その線形方程式からアルギン酸濃度をOD600で割って、OD600当たりのアルギン酸の総量を求める。ここに示されているのは、PIAおよびPIAで成長したピリミジン・デ・ノボ生合成を調節する遺伝子の突然変異を伴うPAO581およびPAO581のサンプルであり、ウラシルの0.1ミリモルを補った。データは、媒体中のウラシルの存在が、復元されたアルギン酸生産によって見られるように変異株を粘膜に戻すことを示している。ここで、抗アルギン酸モノクローナル抗体ベースELISAに関する結果が示されている。コロニーは、PBADプロモーターおよびpHERD-20Tプラスミドの誘導のためにアラビノースを有するPIAプレート上で成長する。示されているPAO1、PAO1は、主要なアルギン酸特異的シグマ因子algUを有する発現プラスミドpHERD-20T、および主要なアルギン酸生合成酵素GDP-マンノース脱水素酵素をコードする際のalgD遺伝子のフレーム内欠失を有するPAO1である。このデータは、PAO1およびPAO1デルタalgDについて測定されたアルギネートの非粘液レベルと、PHERD-20T algUとPAO1について測定されたアルギネートの粘液レベルを比較する。抗アルギン酸ELISAは、プレート上での事前成長を伴わない患者痰サンプルでも試験した。粘膜P.aeruginosaの成長を有する3つのCF痰サンプルは、非粘液P.aeruginoaまたはP.aeruginosa成長を含む2つの患者痰サンプルと比較して検出可能なアルギン酸塩を示した。アルギン酸定量のための標準曲線の調製は、サンプル内のアルギン酸塩の正確かつ正確な測定を可能にするため、非常に重要です。カルバゾール法で使用される酸溶液は非常に危険であるため、適切な個人用保護具と予防措置を使用して安全性を確保する必要があります。SCVを単離した後、さらに遺伝子プロファイリングを行い、発生する突然変異およびそのような突然変異に関連する病原性をよりよく理解することができる。ELISA法は嚢胞性線維症の患者の慢性肺感染をモニターするように適合することができる。さらに、我々の成長方法は、特定のSCVによって引き起こされる感染症を診断するのに役立つ可能性がある。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

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のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

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長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...