Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.

1. SCV 성장 조건 및 인양 통로의 생리적 활성화
<ol><li>SCV 감지.<ol>
<li>P. aeruginosa 균주 PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581 및 PAO581ΔpyrD를 미리 온난한 슈도모나스 격리 한천(PIA) 플레이트에 연속하고 48시간 동안 37°C에서 성장한다. 성장 판상에서 SCV 표현형을 가지는 단일 콜로니 분리(통상의 3−5 mm 콜로니 크기와 는 반대로 1−3 mm의 콜로니 크기)를 식별한다.</li>
		<li>1.1.1 단계를 반복하여...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

SCV와 알긴산은 모두 몇몇 만성 감염에서 연루된 중요한 질병 마커입니다. 따라서, SCV를 성장시킬 뿐만 아니라 P. aeruginosa에 의한 알긴산의 조절 및 생산을 연구하는 능력은 이러한 만성 질환에 대한 새로운 치료법의 발견에 필수적이다.
SCV 균주는 다른 P. aeruginosa 균주에 비해 느린 성장속도 4로 인해 성장하기가 악명 이어, 이는 그들의 항균 저항...

녹농균을 가진 만성 폐 감염은 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 이환율 그리고 사망의 중요한 원인입니다. 초기 유년기 도중, 환자는 P. aeruginosa1,2의비 점막 격리를 포함하여 다중 세균성 병원체에 의해 식민지화됩니다. 작은 식민지 변이체 (SCV)의 출현은 점막 분리뿐만 아니라 분리만성 감염에 발병을위한 마커이다. SCV 분리제는 그들의 느린 성장 속도4때문에 높게 약 저항하는3, 그(것)들을 치료 연대 및 그밖 만성 감염에 있는 가혹한 억지력을 렌더링합니다5 에 의하여 P. aeruginosa. Al Ahmar 외6에 의한 작업은 de novo 피리미딘 생합성에 의해 연결된 SCV와 점막 사이의 연관성을 보여주었다. 피리미딘 기아는, 피리미딘 생산과 관련된 유전자의 돌연변이로 인해, 비점막 기준 균주 PAO1 및 점막 유도체, PAO581 (PAO1mucA25)에서 SCV 표현형을 초래하였다.
알긴산 과잉 생산은 CF에서 만성 폐 감염에 대한 중요한 질병 마커임에도 불구하고, 알긴산과 폐 병리학의 양 사이에 직접적인 상관관계가 있는지 는 명확하지 않으며, 알긴산이 치료를 위한 예후 마커로 사용될 수 있는지는 불분명하다7. 알긴산 생산은 주로 2개의 오페론, 조절오페론(algUmucABCD)8,9 및 생합성 오페론(algD operon) 10,11에의해 조절된다. 알긴산 생산은 시그마 인자 AlgU9,12(일명 AlgT라고도 함)와 반시그마 인자 MucA13의분해에 의해 엄격하게 조절된다. 환자의 가래 표본에서 즉석에서 알긴산의 생산을 모니터링하는 능력은 새로운 치료 옵션의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
여기서, 우리는 피리미딘 드 노보를 합성할 수 없는 돌연변이체에 의한 SCV의 존재를 검출하는 성장 조건을 기술한다. 피리미딘 뉴클레오티드의 질소 염기인 우라실 및/또는 시토신을 보충하여 인양 경로를 활성화시켜 돌연변이체의 정상적인 성장을 회복시다. 이들 특정 SCV 돌연변이체에 대한 이러한 성장 방법은 환자 샘플에서 피리미딘 돌연변이를 식별하는 스크리닝 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 우리는 P. aeruginosa에의해 생성되고 분비되는 알긴산의 검출 및 측정을위한 두 가지 방법에 대해 논의합니다. 첫 번째는 고농도의 산을 이용하여 다당류를 분해한 다음 시료의 농도를 정량화하기 위해 색도 지표를 첨가하는 전통적인 방법14,15,16이다. 우리의 실험실에서 개발 된 두 번째 방법은 QED 바이오 사이언스가 개발 한 항 알긴산 단일 클론 항체 (mAb)를 사용하여 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)을 활용합니다. ELISA 방법은 우론산 분석법보다 더 구체적이고 민감하며 고농축 황산의 회피로 인해 보다 안전한 사용을 가능하게 합니다. Alginate를 측정하기 위하여 참을성 있는 가래 견본에 직접 이용되는 ELISA의 기능으로, 감염의 다른 기간에 폐에 존재하는 알긴산의 양을 따르는 감시 진단 공구로 개발될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

기회 그람 음성 세균성 병원균인 슈도모나스 녹농균은점막이라는 독특한 표현형을 초래하는 외다당류 알긴산을 과잉 생산할 수 있습니다. Alginate는 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 나쁜 예후 귀착되는 만성 폐 감염에 연결됩니다. 알긴산의 생산을 조절하는 경로를 이해하면 알긴산 형성을 대상으로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 질병 관련 표현형은 작은 콜로니 변이체(SCV)이다. SCV는 박테리아의 느린 성장 및 종종 항균제에 증가 저항과 관련. 이 논문에서, 우리는 먼저 피리미딘 생합성 돌연변이로 인해 유전적으로 정의 된 형태의 P. aeruginosa SCV를 배양하는 방법을 보여줍니다. 질소 염기, 우라실 또는 시토신의 보충은 이러한 돌연변이체에 정상적인 성장을 반환하여 환경으로부터 자유 염기를 청소하는 인양 통로의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 세균성 알긴산의 측정을 위한 2개의 방법을 토론합니다. 첫 번째 방법은 다당류의 가수분해를 그것의 우론산 단량체에 의존하고 염색체 시약, 카르바졸로 유도하는 반면, 두 번째 방법은 시판되는 알긴산 특이적 mAb에 기초한 ELISA를 사용한다. 두 방법 모두 정량화에 대한 표준 곡선이 필요합니다. 우리는 또한 면역학적 방법이 알긴산 정량화를 위해 특이적이고 임상 구편에서 알긴산의 측정을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.

도 1은 SCV6을초래하는 pyrD 유전자(피리미딘 생합성 경로내의 유전자)에서 프레임 내 결실 유무에 관계없이 PAO1 및 PAO581의 플레이트를 나타낸다. PAO1 SCV 돌연변이체는 우라실 보충에 반응하여 정상 성장으로 회복되었다(도1A,B). 더욱이, PAO581ΔpyrDSCV 돌연변이체는 부모 균주 PAO581이 추가?...

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Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

여기서, 우리는 녹농균의 작은 식민지 변종을 배양하는 성장 상태를 설명한다. 우리는 또한 전통적인 우론산 카르바졸 분석및 알긴산 특이적 단일클론 항체(mAb) 기반 ELISA를 사용하여 P. aeruginosa에 의해 생성된 외다당류 알긴산의 검출 및 정량화를 위한 2개의 개별적인 방법을 기술한다.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

작은 식민지 변형 또는 SCV 기술은 슈도모나스 아에루기노사의 작은 식민지 변종의 선택과 성장을 허용합니다. 이 방법은 매우 확실하며 일반 방법보다 쉽게 선택할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 표준 비뇨기산 카르바졸 방법에 비해 알지네이트 정량화를 위한 보다 안전하고 민감한 ELISA 방법을 상세히 설명하여 소터리 또는 시료 조작 없이 시료에서 직접 알자능 정량화를 가능하게 한다.절차를 시연하는 것은 실험실 기술자 인 브랜든 커비와 내 실험실대학원생 인 로이 알 아마르 (Roy Al Ahmar)가 될 것입니다. 작은 식민지 변형 또는 SCV를 검출하기 위해, 먼저 사전 따뜻하게 PIA 플레이트에 P.aeruginosa 변형 PAO1 델타 PYRD를 줄입니다. 48 시간 동안 섭씨 37도에서 균주를 성장시면 됩니다.성장 판상에서, 일반적인 3~5밀리미터 식민지 크기와 는 반대로 1~ 3밀리미터의 식민지 크기를 특징으로 하는 SCV 표현형을 가지는 단일 식민지 분리를 식별한다. SCV의 순수한 분리를 얻기 위해 선택한 식민지를 다시 줄입니다. 인양 경로의 생리적 활성화를 수행하려면 멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하십시오.0.1 밀리몰라 우라실로 보충된 미리 데운 PIA 플레이트에서 선택한 콜로니를 줄입니다. 24 ~48시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 자랍니다. 우론산 카르바졸 분석기를 시작하려면, 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 시험하고 선택하기 위해 원하는 균주의 순수한 배양으로부터 단일 식민지를 식별한다.PIB의 5 밀리리터를 포함하는 배양 시험 관에 이쑤시개를 놓습니다. 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 성장합니다. 인큐베이션을 따라 미리 데워진 PIA 플레이트에 배양된 PIB 국물의 알리쿼트를 넣습니다.멸균 세포 스프레더를 사용하여 국물을 접시 에 퍼뜨리고 섭씨 37도에서 24 시간 동안 자랍니다. 파이펫 컨트롤러와 멸균 50 밀리리터 파이펫을 사용하여, 어른 잔디에 0.85 %의 염화 나트륨을 추가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트를 긁어 샘플을 수집합니다. 신선한 50 밀리리터 파이펫을 사용하여 샘플을 흡인하고 50 밀리리터 수집 튜브로 옮킨다.샘플을 높은 곳에 소용돌이쳐 얼음에 샘플을 섞고 놓습니다. 샘플의 OD600을 측정하려면 먼저 0.85%의 염화나트륨을 사용하여 분광계를 블랭크합니다. 그런 다음 샘플 1 밀리리터를 새로운 일회용 큐벳에 추가하고 OD를 읽습니다. 이 단계를 두 번 반복하여 각 샘플에 대한 트리플리케이트를 얻습니다.이제 황산 붕산 용액 3 밀리리터를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 앉게 하십시오. 수집된 샘플의 마이크로리터 350을 시험관의 산 혼합물에 천천히 넣습니다. 낮은 에 잠시 소용돌이 후, 산 시료 혼합물에 0.1%의 카바졸 및 에탄올 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다.중간 설정에서 튜브와 소용돌이를 5초 동안 캡합니다. 그런 다음 55°C의 건조한 욕조에 30분간 놓습니다. 인큐베이션 후 튜브를 조심스럽게 소용돌이쳐 5분 동안 식힙니다.0.85%의 염화나트륨을 가진 튜브를 분광광계에 공백으로 사용하십시오. 그런 다음 깨끗한 큐벳에 혼합물의 1 밀리리터를 추가하고 분광계에서 530 나노미터에서 샘플의 OD를 읽습니다. d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD530을 측정하여 표준 곡선을 준비합니다.두 번 반복하고 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알긴네이트 농도를 계산하고 ALginate 농도를 선형 방정식에서 OD600으로 나누어 OD600당 총 알긴네이트양을 얻습니다. 마이크로피펫을 사용하여 수집된 샘플의 50마이크로리터를 처리되지 않은 96웰 플레이트에 추가합니다.그런 다음 우물에 ELISA 코팅 버퍼 50 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 분출 병을 사용하여, 우물을 채우고 접시를 뒤집어 서 그들을 배수하여 PBS-T로 접시 우물을 두 번 세척합니다.마이크로피펫으로 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 우물에 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 다음 날, 이전과 같이 PBS-T로 접시를 두 번 씻으시다. 그런 다음 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양합니다.배양 후, 이전과 같이 PBS-T로 플레이트 웰을 세 번 씻으시다. 다음으로, 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 이차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양한다. 접시를 세 번 다시 세척한 후 마이크로 파이프를 사용하여 TMB ELISA 용액 100 마이크로리터를 추가하십시오.접시를 서랍에 넣거나 호일로 포장하여 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 정지 용액 100 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 OD를 측정합니다.d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다. 측정값을 두 번 반복하고 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플에서 알긴의 농도를 계산하고 OD600당 총 알긴네이트양을 얻기 위해 OD600으로 선형 방정식에서 알긴전농도를 나눕니다.여기에 표시된 PAO581 및 PAO581의 샘플은 PIA및 PIA에서 자란 피리미딘 드 노보 생합성을 조절하는 유전자의 돌연변이를 우라실의 0.1 밀리머로 보충합니다. 데이터는 미디어에 우라실의 존재가 복원 된 alginate 생산에 의해 본 바와 같이 점액으로 돌연변이 변형의 변환을 초래한다는 것을 보여줍니다. 여기서, 항알기네이트 단클론 항체-ELISA에 대한 결과가 나타난다.식민지는 PBAD 프로모터와 pHERD-20T 플라스미드의 유도를 위해 아라비노스가 있는 PIA 플레이트에서 재배됩니다. 주요 알기네이트 특이적 시그마 인자 알루U를 탑재한 PAO1, PAO1, PAO1은 주요 알기네이트 생합성 효소 GDP-만노스 탈수소효소를 코딩하는 데 있는 algD 유전자의 인프레임 삭제를 갖는다. 이 데이터는 PAO1 및 PAO1 델타 algD에 대해 측정된 알기네이트의 비점액 수준을 pHERD-20T algU와 PAO1에 대해 측정된 알긴네이트의 점막 수준과 비교합니다.항 알자네이트 ELISA는 또한 플레이트에 대한 사전 성장없이 환자 가래 샘플에서 테스트되었습니다. 점액 P.aeruginosa의 성장을 했다 3 개의 CF 가래 샘플 비 점액 P.aeruginosa 또는 아니 P.aeruginosa 성장을 포함 하는 두 개의 환자 가래 샘플에 비해 검출 알기네이트 를 보였다. 이는 샘플 내에서 알긴산의 정확하고 정확한 측정을 가능하게 하기 때문에 알지네이트 정량화를 위한 표준 곡선의 준비는 매우 중요합니다.카르바졸 방법에 사용되는 산용액은 매우 위험하므로 적절한 개인 보호 장비와 예방 조치를 사용하여 안전을 보장해야 합니다. SCV를 격리한 후, 추가 유전 프로파일링은 발생하는 돌연변이와 그러한 돌연변이와 관련된 병원성을 더 잘 이해하기 위해 수행 될 수 있습니다. ELISA 방법은 낭포성 섬유증 환자에서 만성 폐 감염을 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.게다가, 우리의 성장 방법은 특정 SCV에 기인한 감염을 진단하는 것을 도울 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...