Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gir R44GM113545 og P20GM103434.

1. SCV vekstforhold og fysiologisk aktivering av bergingsveien
<ol><li>Påvisning av SCV.<ol>
<li>Streak P. aeruginosa stammer PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581, og PAO581ΔpyrD på prewarmed Pseudomonas isolasjon agar (PIA) plater og vokse på 37 ° C for 48 h. På vekstplaten identifiserer du en enkelt koloniisolat som har SCV-fenotypen (kolonistørrelse på 1-3 mm i motsetning til den normale 3-5 mm kolonistørrelsen).</li>
		<li>Gjenta trinn 1.1.1 for å oppnå en ren isolat av SCV. MER...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Både SCV og alginat er viktige sykdomsmarkører involvert i flere kroniske infeksjoner. Derfor er evnen til å vokse SCV samt studere regulering og produksjon av alginat av P. aeruginosa integrert i oppdagelsen av nye behandlinger for disse kroniske sykdommene.
SCV stammer er notorisk vanskelig å vokse på grunn av deres langsomme vekstrate4 sammenlignet med andre P. aeruginosa stammer, som hjelpemidler i deres antimikrobielle motstand<sup class="xre...

Kroniske lungeinfeksjoner med Pseudomonas aeruginosa er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos pasienter med cystisk fibrose (CF). I tidlig barndom koloniseres pasienter av flere bakterielle patogener, inkludert ikke-mucoid isolater av P. aeruginosa1,2. Fremveksten av den lille kolonivarianten (SCV) isolerer samt mucoid isolater er en markør for utbruddet til kroniske infeksjoner. SCV isolater er svært resistente3 på grunn av deres langsomme vekstrater4, noe som gjør dem en alvorlig avskrekkende i behandling regimenter og andre kroniske infeksjoner5 av P. aeruginosa. Arbeid av Al Ahmar et al.6 viste en sammenheng mellom SCV og mucoidy knyttet sammen av de novo pyrimidine biosyntese. Pyrimidinsult, på grunn av mutasjoner i gener involvert med pyrimidinproduksjon, resulterte i SCV fenotype i nonmucoid referansestammen PAO1 og mucoidderivatet PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduksjon er en viktig sykdomsmarkør for kroniske lungeinfeksjoner i CF, er det ikke klart om det er en direkte sammenheng mellom mengden alginat og lungepatologi, og det er uklart om alginat kan brukes som prognosemarkør for behandling7. Alginatproduksjonen er hovedsakelig regulert av to operoner, en regulatorisk operon (algUmucABCD)8,9 og biosyntetisk operon (algD operon)10,11. Algiat produksjonen er tett regulert av sigma faktor AlgU9,12 (også kjent som AlgT) og nedbrytning av anti-sigma faktor MucA13. Evnen til å overvåke produksjonen av alginatin in situ fra pasientenes sputumprøver kan hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske alternativer.
Her beskriver vi en veksttilstand som oppdager tilstedeværelsen av SCV forårsaket av mutanter som ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskudd av uracil og/eller cytosin, nitrogenholdig base av pyrimidinnukleotid, til mediet aktiverer bergingsveien, og gjenoppretter dermed den normale veksten i mutanter. Denne vekstmetoden for disse spesifikke SCV-mutantene kan brukes som en screeningmetode for å identifisere pyrimidinmutasjoner i pasientprøver. I tillegg diskuterer vi to metoder for deteksjon og måling av alginat produsert og utskilt av P. aeruginosa. Den første er den tradisjonelle metoden14,15,16 for å forringe polysakkarid ved hjelp av en høy konsentrasjon av syre og deretter legge til en kolormetrisk indikator for å kvantate konsentrasjonen i prøven. Den andre metoden, utviklet i vårt laboratorium, benytter enzymet-linked immunosorbent analyse (ELISA) ved hjelp av en anti-algonat monoklonalt antistoff (mAb) utviklet av QED Biosciences. ELISA-metoden viser seg å være mer spesifikk og følsom enn uronisk syreanalyse og gir sikrere bruk på grunn av unngåelse av den svært konsentrerte svovelsyre. Med elisas evne til å brukes direkte på pasientprøver for å måle alginat, kan det utvikles som et overvåkingsdiagnostisk verktøy for å følge mengden alginat tilstede i lungene i forskjellige perioder av infeksjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen, kan overprodusere et exopolysakkaridalgin som resulterer i en unik fenotype kalt mucoidy. Alginat er knyttet til kroniske lungeinfeksjoner som resulterer i dårlig prognose hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Forstå banene som regulerer produksjonen av algetrekkan hjelpe i utviklingen av nye terapeutiske strategier rettet mot den algeiske formasjonen. En annen sykdomsrelatert fenotype er den lille kolonivarianten (SCV). SCV skyldes den langsomme veksten av bakterier og ofte forbundet med økt motstand mot antimikrobielle midler. I dette papiret viser vi først en metode for å kulturing en genetisk definert form av P. aeruginosa SCV på grunn av pyridin biosyntese mutasjoner. Tilskudd av nitrogenholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale veksten til disse mutantene, og viser tilstedeværelsen av en redningsvei som scavenges frie baser fra miljøet. Deretter diskuterer vi to metoder for måling av bakteriell alginat. Den første metoden er avhengig av hydrolysen av polysakkarid til sin uronic acid monomer etterfulgt av avledningmed en kromogen reagens, karbazole, mens den andre metoden bruker en ELISA basert på en kommersielt tilgjengelig, algon-spesifikk mAb. Begge metodene krever en standard kurve for kvantasjon. Vi viser også at den immunologiske metoden er spesifikk for alginatkvantifisering og kan brukes til måling av alginat i de kliniske prøvene.

Figur 1 viser plater av PAO1 og PAO581 med eller uten in-frame sletting i pyrimidet (et gen i pyriden biosynteseveien) som resulterer i SCV6. PAO1 SCV mutant ble gjenopprettet til normal vekst som svar på uracil tilskudd (Figur 1A,B). Videre ble PAO581ΔpyrDSCV mutant returnert til mucoidy med samme uracil behandling, fordi den overordnede stammen PAO581 har en ekstra <e...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Her beskriver vi en veksttilstand for å kultur den lille kolonivarianten av Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder for deteksjon og kvantitasjon av exopolysakkaridalgatet produsert av P. aeruginosa ved hjelp av en tradisjonell uronisk syrekarbazolanalyse og et algonalt spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) basert ELISA.

Kultur av liten koloni variant av Pseudomonas aeruginosa og kvantasjon av sin Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Den lille kolonivarianten eller SCV-teknikken gjør det mulig å velge og vekst av små kolonivarianter av Pseudomonas aeruginosa. Metoden er veldig definitiv og gir enklere valg enn normale metoder. Denne protokollen beskriver også en sikrere, mer følsom ELISA-metode for alginat kvantifisering sammenlignet med standard uronic acid carbazole-metoden, slik at direkte alginat kvantifisering i prøver uten cautery eller prøvemanipulasjon.Å demonstrere prosedyren vil være Brandon Kirby, en laboratorietekniker, og Roy Al Ahmar, en utdannet student fra laboratoriet mitt. For å oppdage den lille kolonivarianten eller SCV, må P.aeruginosa-stammen PAO1 delta PYRD på forhåndsvarmede PIA-plater. Øk stammene ved 37 grader Celsius i 48 timer.På vekstplaten, identifiser en enkelt koloniisolere som har SCV fenotype preget av en kolonistørrelse på en til tre millimeter i motsetning til den normale tre til fem millimeter kolonistørrelsen. Re-strek de valgte koloniene for å oppnå en ren isolat av SCV. For å utføre fysiologisk aktivering av bergingsveien, bruk en steril inokulasjonssløyfe for å plukke SCV-kolonien fra PIA-platen.Strek den valgte kolonien på en forvarmet PIA plate supplert med 0,1 millimolar uracil. Dyrk platen ved 37 grader Celsius i 24 til 48 timer. For å begynne uronic acid carbazole analysen, identifisere en enkelt koloni fra en ren kultur av ønsket belastning som skal testes og plukke kolonien ved hjelp av en steril tannpirker.Plasser tannpirken i et kulturprøvesrør som inneholder fem milliliter PIB. Vokse i en shaker inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Etter inkubasjon, legg til en aliquot av den kultiverte PIB kjøttkraft på en forhåndsoppvarmet PIA plate.Bruk en steril cellespreder, spre buljongen over platen og vokse ved 37 grader Celsius i 24 timer. Bruk en pipetteregulator og en steril 50 milliliter pipette, tilsett 0,85% natriumklorid til den voksne plenen og samle prøven ved å skrape platen ved hjelp av en cellespreder. Aspirer prøven med en frisk 50 milliliter pipette og overfør til et 50 milliliter oppsamlingsrør.Vortex prøven på høy for å blande og plassere prøvene på is. For å måle OD600 av prøvene, først blank spektrofotometeret ved hjelp av en milliliter på 0,85% natriumklorid. Deretter legger du til en milliliter av prøven til en ny engangs cuvette og les OD. Gjenta dette trinnet to ganger for å få en triplicate av leser for hver prøve.Legg nå til tre milliliter av svovelsyreboratløsningen i kulturrør og la sitte på is. Tilsett 350 mikroliter av den oppsamlede prøven sakte til syreblandingen i testrørene. Etter kort vortexing på lav, tilsett 100 mikroliter av 0,1% karboazol og etanol løsning til syre prøveblandingen.Cap røret og virvel på medium innstillingen i fem sekunder. Deretter plasseres i et tørt bad ved 55 grader Celsius i 30 minutter. Etter inkubasjon, vortex rørene kort på høy og la avkjøles i fem minutter.Bruk røret med 0,85 % natriumklorid som blankt for spektrofotometeret. Tilsett deretter en milliliter av blandingen til en ren cuvette og les OD av prøvene ved 530 nanometer på et spektrofotometer. Forbered en standardkurve ved å måle OD530 av seriell fortynning av kjente konsentrasjoner av d-mannuronic syre.Gjenta to ganger og trekk ut en lineær ligning fra disse målingene. Beregn konsentrasjonen av alginaten i hver prøve ved hjelp av standardkurven og del alginatkonsentrasjonen fra lineær ligning med OD600 for å oppnå den totale mengden alginat per OD600. Bruk en mikropipette til å tilsette 50 mikroliter av den innsamlede prøven til en ubehandlet 96-brønnsplate.Tilsett deretter 50 mikroliter med ELISA-beleggbuffer til brønnene. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i to timer. Bruk en sprutflaske til å vaske platebrønnene to ganger med PBS-T ved å fylle brønnene og deretter tømme dem ved å snu platen.Tilsett 200 mikroliter med blokkeringsbuffer til brønnene med en mikropipette og inkuber ved fire grader Celsius over natten. Neste dag, vask platen to ganger med PBS-T som før. Tilsett deretter 100 mikroliter fortynnet primært antistoff til brønnene og inkuber ved 37 grader Celsius i en til to timer.Etter inkubasjon, vask platebrønnene tre ganger med PBS-T som før. Deretter legger du til 100 mikroliter fortynnet sekundært antistoff til brønnene og inkuberer ved 37 grader Celsius i en til to timer. Etter å ha vasket platen igjen tre ganger, bruk en mikropipette til å legge til 100 mikroliter TMB ELISA-oppløsning.Inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter i mørket ved å plassere platen i en skuff eller innpakning i folie. Tilsett deretter 100 mikroliter stoppløsning. Bruk en plateleser til å måle OD ved 450 nanometer.Produser en standardkurve ved å måle OD450 av seriell fortynning av kjente konsentrasjoner av d-mannuronic acid. Gjenta målene to ganger og trekk ut en lineær formel. Beregn konsentrasjonen av alginaten i hver prøve ved hjelp av standardkurven og del alginatkonsentrasjonen fra den lineære ligningen med OD600 for å oppnå den totale mengden alginat per OD600.Vist her er prøver av PAO581 og PAO581 med mutasjoner i gener som regulerer pyrimidin de novo biosyntese dyrket på PIA og PIA supplert med 0,1 millimolar uracil. Dataene viser at tilstedeværelsen av uracil i media resulterer i konvertering av mutant belastning tilbake til mucoidy sett av den restaurerte alginatproduksjonen. Her vises resultatene for antialginatmonoklonalt antistoffbasert ELISA.Kolonier dyrkes på PIA plater med arabinose for induksjon av PBAD arrangør og pHERD-20T plasmid. Vist er PAO1, PAO1 bærer uttrykket plasmid pHERD-20T med hoved alginat spesifikke sigma faktor algU, og PAO1 med en in-frame sletting av algD genet i koding nøkkelen alginat biosyntetisk enzym BNP-mannose dehydrogenase. Disse dataene sammenligner de ikke-mucoid nivåene av alginat målt for PAO1 og PAO1 delta algD versus mucoid nivåer av alginat målt for PAO1 med pHERD-20T algU.Anti-alginat ELISA ble også testet på pasientsputumprøver uten forutgående vekst på plater. Tre CF sputum prøver som hadde vekst av mucoid P.aeruginosa viste påviselig alginat sammenlignet med to pasient sputum prøver som inneholdt enten ikke-mucoid P.aeruginosa eller ingen P.aeruginosa vekst. Utarbeidelsen av standardkurvene for alginat kvantifisering er svært avgjørende da dette vil tillate nøyaktig og nøyaktig måling av alginat i prøven.Syreløsningen som brukes i karboazolmetoden er svært farlig, så riktig personlig verneutstyr og forholdsregler må brukes for å sikre sikkerheten. Etter å ha isolert SCVs, kan ytterligere genetisk profilering gjøres for å bedre forstå mutasjoner som oppstår og patogeniteten forbundet med slike mutasjoner. ELISA-metoden kan tilpasses for å overvåke kronisk lungeinfeksjon hos pasienter med cystisk fibrose.Videre kan vår vekstmetode bidra til å diagnostisere infeksjoner forårsaket av spesifikke SCVer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifisering av nye gener assosiert med Alginat Produksjonen i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Ved hjelp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-mediert Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder for å oppdage cytotoksisk Amyloids følgende infeksjon av lunge endotelceller av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...