Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.

1. Условия роста SCV и физиологическая активация пути спасения
<ol><li>Обнаружение SCV.<ol>
<li>Полоса P. aeruginosa штаммов PAO1, PAO1 йpyrD, PAO581, и PAO581й pyrD на предварительно разогретых Pseudomonas изоляции агар (PIA) пластин и расти при 37 кС для 48 ч. На пластине роста определить одну колонию изоли?...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Оба SCV и альгинат являются важными маркерами болезни, причастных к нескольким хроническим инфекциям. Таким образом, способность расти SCV, а также изучить регулирование и производство альгината P. aeruginosa является неотъемлемой частью открытия новых методов лечения этих хронических з?...

Хронические инфекции легких с Pseudomonas aeruginosa являются основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с муковисцидозом (CF). В раннем детстве пациенты колонизируются несколькими бактериальными патогенами, включая немукоидные изоляты P. aeruginosa1,2. Появление небольшого варианта колонии (SCV) изолятов, а также изоляты слизистой оболочки является маркером для начала хронических инфекций. SCV изоляты высоко лекарственно устойчивы3 из-за их медленных темпов роста4, что делает их тяжелым сдерживающим фактором в лечении полков и других хронических инфекций5 P. aeruginosa. Работа Al Ahmar et al.6 показала связь между SCV и слизистой оболочкой, связанную биосинтезом de novo pyrimidine. Пиримидиновые голодания, из-за мутаций в генах, связанных с производством пиримидина, привели к phenotype SCV в немукоидном референс-напряга е PAO1 и слизистой производной, PAO581 (PAO1mucA25).
Хотя альгинат перепроизводства является важным маркером заболевания для хронических инфекций легких в CF, не ясно, есть ли прямая корреляция между количеством альгината и легочной патологии, и неясно, если альгинат может быть использован в качестве маркера прогноза для лечения7. Производство алгината в основном регулируется двумя оперонами, регулятивным опероном(algUmucABCD)8,9 и биосинтетическим опероном(algD operon)10,11. Производство alginate плотно регулируется фактором сигмы AlgU9,12 (также известный как AlgT) и деградации анти-сигма фактор MucA13. Способность контролировать выработку альгината на месте из образцов моспы пациентов может помочь в разработке новых терапевтических вариантов.
Здесь мы описываем состояние роста, которое обнаруживает наличие SCV, вызванного мутантами, которые не могут синтезировать пиримидин де Ново. Дополнение урацила и/или цитозина, азотного основания пиримидного нуклеотида, к среде активизирует спасительный путь, тем самым восстанавливая нормальный рост мутантов. Этот метод роста для этих конкретных мутантов SCV может быть использован в качестве метода скрининга для выявления пиримидиновых мутаций в образцах пациентов. Кроме того, мы обсуждаем два метода обнаружения и измерения альгината, произведенного и выделяемого P. aeruginosa. Первый метод14,15,16 деградации полисахарида с использованием высокой концентрации кислоты, а затем добавить колориметрический индикатор для количественной концентрации в образце. Второй метод, разработанный в нашей лаборатории, использует фермент-связанных иммуносорбента Ассей (ELISA) с использованием анти-альгината моноклональных антител (mAb), разработанных Зед Biosciences. Метод ELISA оказывается более конкретным и чувствительным, чем ассс ы уроническая кислота, и позволяет более безопасно использовать сяризне из-за избежания высококонцентрированной серной кислоты. С возможностью ELISA быть использованы непосредственно на образцы эмпухи пациента для измерения альгината, он может быть разработан в качестве мониторинга диагностический инструмент, чтобы следить за количество альгината присутствует в легких в разные периоды инфекции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, оппортунистический грамотрицательный бактериальный патоген, может перепроизводить экзополисахарид альгината в результате чего уникальный фенотип называется слизистой оболочки. Альгинат связан с хроническими легочными инфекциями, что приводит к плохому прогнозу у пациентов с муковисцидозом (КФ). Понимание путей, которые регулируют производство альгината может помочь в разработке новых терапевтических стратегий, направленных на альгинат формирования. Другим фенотипом, связанным с болезнью, является небольшой вариант колонии (SCV). SCV объясняется медленным ростом бактерий и часто связан с повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам. В этой работе мы сначала показываем метод культивирования генетически определенной формы P. aeruginosa SCV из-за мутаций биосинтеза пиримидина. Дополнение азотных оснований, урацила или цитозина, возвращает нормальный рост этим мутантам, демонстрируя наличие спасительного пути, который высвобожяет свободные базы от окружающей среды. Далее мы обсудим два метода измерения бактериального альгината. Первый метод опирается на гидролиз полисахарида к его мономеру уроновой кислоты с последующим производным с хромогенным реагентом, карбазолом, в то время как второй метод использует ELISA на основе коммерчески доступного, альгината специфического mAb. Оба метода требуют стандартной кривой для количественной оценки. Мы также показываем, что иммунологический метод специфичен для алгинатной количественной оценки и может быть использован для измерения альгината в клинических образцах.

На рисунке 1 показаны пластины PAO1 и PAO581 с или без удаления в кадре гена пирд (ген в пути биосинтеза пиримидина), что приводит к SCV6. Пао1 SCV мутант был восстановлен в нормальном росте в ответ на урацил добавок(Рисунок 1A,B...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Здесь мы описываем состояние роста к культуре малый вариант колонии Pseudomonas aeruginosa. Мы также описываем два отдельных метода обнаружения и количественной оценки экзополисахарида альгината производства P. aeruginosa с использованием традиционной уронической кислоты карбазол анализа и альгината конкретных моноклональных антител (mAb) основе ELISA.

Культура Малой колонии Вариант Pseudomonas aeruginosa и Квантитация его Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Небольшой вариант колонии или SCV техника позволяет для выбора и роста небольших вариантов колонии Pseudomonas aeruginosa. Метод является очень окончательным и позволяет легче выбора, чем обычные методы. В этом протоколе также подробно более безопасный, более чувствительный метод ELISA для количественной оценки альгината по сравнению со стандартным методом карбазола урановой кислоты, позволяющий прямой альгинат количественной оценки в образцах без прижигания или манипуляции образца.Демонстрация процедуры будет Брэндон Кирби, лаборант, и Рой Аль Ахмар, аспирант из моей лаборатории. Чтобы обнаружить вариант небольшой колонии или SCV, первая полоса P.aeruginosa штамм PAO1 дельта PYRD на предварительно разогретых пластин PIA. Рост штаммов на 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов.На пластине роста определите один изолят колонии, который имеет фенотип SCV, характеризующийся размером колонии от одного до трех миллиметров, в отличие от обычного размера колонии размером от трех до пяти миллиметров. Повторно полоса выбранных колоний, чтобы получить чистый изолят SCV. Для выполнения физиологической активации пути спасения используйте стерильную петлю прививки, чтобы выбрать колонию SCV из пластины PIA.Полоса выбранной колонии на предварительно разогретой пластине PIA, дополненной 0,1 миллимолярным урацилом. Расти пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 24 до 48 часов. Чтобы начать анализ карбазола мочевой кислоты, определите одну колонию из чистой культуры желаемого штамма, который будет протестирован, и выберите колонию с помощью стерильной зубочистки.Поместите зубочистку в культурную пробирку, содержащую пять миллилитров PIB. Расти в шейкер инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. После инкубации добавьте алицит культурного бульона PIB на предварительно разогретую пластину PIA.Используя стерильный распределитель клеток, разложить бульон по тарелке и расти при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Используя контроллер пипетки и стерильный 50-миллилитровый пипетку, добавьте 0,85% хлорида натрия к взрослому газону и соберите образец, соскоб пластины с помощью распределитель клеток. Аспирировать образец с помощью свежей 50 миллилитров пипетки и передать в 50 миллилитров трубки сбора.Vortex образец на высоком смешать и поместить образцы на льду. Для измерения OD600 образцов, сначала пустой спектрофотометр с помощью одного миллилитра 0,85% хлорида натрия. Затем добавьте один миллилитр образца в новый одноразовый кювет и прочитайте OD. Повторите этот шаг дважды, чтобы получить тройной считывает для каждого образца.Теперь добавьте три миллилитров раствора серной кислоты в культурные трубки и дайте посидеть на льду. Добавьте 350 микролитров собранного образца медленно в кислотную смесь в пробирках. После краткого вихря на низком уровне, добавить 100 микролитров 0,1%карбазола и этанола раствор смеси образца кислоты.Крышка трубки и вихря на средней настройки в течение пяти секунд. Затем поместите в сухую ванну при 55 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, вихрь трубы кратко на высоком и дайте остыть в течение пяти минут.Используйте трубку с 0,85% хлорида натрия в качестве пустого для спектрофотометра. Затем добавьте один миллилитр смеси в чистый кювет и прочитайте OD образцов на 530 нанометров на спектрофотометре. Подготовьте стандартную кривую путем измерения OD530 серийных разбавлений известных концентраций d-маннуроновой кислоты.Повторите дважды и извлечь линейное уравнение из этих показаний. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината на OD600. Используя микропипюту, добавьте 50 микролитров собранного образца в необработанную пластину из 96 колодец.Затем добавьте 50 микролитров буфера покрытия ELISA к скважинам. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Использование шприц бутылку, мыть пластины скважин в два раза с PBS-T путем заполнения скважин, а затем слива их, перевернут пластины более.Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в скважины с помощью микропипетта и инкубировать при четырех градусах Цельсия за ночь. На следующий день, мыть тарелку дважды с PBS-T, как и раньше. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного первичного антитела к скважинам и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух часов.После инкубации, мыть пластины скважин три раза с PBS-T, как и раньше. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного вторичного антитела к скважинам и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух часов. После мытья пластины снова три раза, используйте micropipette добавить 100 микролитров раствора TMB ELISA.Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте, поместив пластину в ящик или упаковка в фольгу. Затем добавьте 100 микролитров стоп-раствора. Используйте считыватель пластин для измерения OD на 450 нанометров.Создайте стандартную кривую, измерив OD450 серийных разбавлений известных концентраций d-маннуроновой кислоты. Повторите измерения дважды и извлекайте линейное уравнение. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината на OD600.Здесь показаны образцы PAO581 и PAO581 с мутациями в генах, регулирующих пиримидин де ново биосинтез, выращенный на PIA и PIA, дополненный 0,1 миллимолялем урацила. Данные показывают, что наличие урацила в средствах массовой информации приводит к преобразованию штамма мутантов обратно в слизистую оболочку, как видно из восстановленного производства альгината. Здесь показаны результаты для антиалгинатных моноклональных антител на основе ELISA.Колонии выращиваются на пластинах PIA с арабинозой для индукции ПБАД промоутера и плазмиды PHERD-20T. Показаны PAO1, PAO1 проведения выражения плазмидной pHERD-20T с основным альгинатом конкретных сигма фактор algU, и PAO1 с в кадре удаление гена algD в кодировании ключевых альгинат биосинтетических ферментов GDP-манноза дегидрогеназы. Эти данные сравнивают немукоидные уровни альгината, измеренные для PAO1 и PAO1 delta algD, по сравнению с уровнями слизистой оболочки альгината, измеренными для PAO1, с pHERD-20T algU.Анти-альгинат ELISA также был протестирован на образцах мокроты пациента без предварительного роста на пластинах. Три образца мокроты CF, которые имели рост слизистой P.aeruginosa показали обнаруживаемый альгинат по сравнению с двумя образцами мокроты пациента, которые содержали либо немукоидный P.aeruginosa или нет роста P.aeruginosa. Подготовка стандартных кривых для количественной оценки альгината имеет очень важное значение, поскольку это позволит точно и точно измерить альгинат в образце.Кислотный раствор, используемый в методе карбазола, очень опасен, поэтому для обеспечения безопасности необходимо использовать надлежащее средства индивидуальной защиты и меры предосторожности. После изоляции SCV, дальнейшее генетическое профилирование может быть сделано, чтобы лучше понять происходящие мутации и патогенность, связанную с такими мутациями. Метод ELISA может быть адаптирован для мониторинга хронической инфекции легких у пациентов с муковисцидозом.Кроме того, наш метод роста может помочь диагностировать инфекции, вызванные конкретными SCV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Синегнойной палочки и Saccharomyces CEREVISIAE биопленки в Проточные ячейки

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Долгосрочная Хронический<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Дыхательных инфекции у мышей

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Идентификация новых генов, ассоциированных с альгината производства в<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Использование мини-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner транспозонов-опосредованного мутагенеза

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Синегнойная палочка Индуцированные легких травм Модель

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...