Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.

1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento
<ol><li>Detección de SCV.<ol>
<li>Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).</li>
		<li>Repita e...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.
Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas...

Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecimiento4, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas5 por P. aeruginosa. 6mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento7. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)8,9 y el operon biosintético (algD operon)10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.
Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.

La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV6. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mi...

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Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

La variante de colonia pequeña o técnica SCV permite la selección y el crecimiento de pequeñas variantes de colonias de Pseudomonas aeruginosa. El método es muy definitivo y permite una selección más fácil que los métodos normales. Este protocolo también detalla un método ELISA más seguro y sensible para la cuantificación de alginatos en comparación con el método estándar de carbazole de ácido urónico, lo que permite la cuantificación directa del alginato en muestras sin cautela ni manipulación de muestras.Demostrando el procedimiento estarán Brandon Kirby, un técnico de laboratorio, y Roy Al Ahmar, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para detectar la variante de colonia pequeña o SCV, primero raya la cepa P.aeruginosa PAO1 delta PYRD en placas PIA precalejadas. Crecer las cepas a 37 grados Celsius durante 48 horas.En la placa de crecimiento, identifique un aislado de una sola colonia que tenga el fenotipo SCV caracterizado por un tamaño de colonia de uno a tres milímetros en comparación con el tamaño normal de colonia de tres a cinco milímetros. Vuelva a rayar las colonias seleccionadas para obtener un aislado puro del SCV. Para realizar la activación fisiológica de la vía de salvamento, utilice un bucle de inoculación estéril para recoger la colonia SCV de la placa PIA.Rayar la colonia seleccionada en una placa PIA precalentada complementada con 0,1 uracilo mililolar. Haga crecer la placa a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Para comenzar el ensayo de carbazole de ácido urónico, identifique una sola colonia de un cultivo puro de la cepa deseada para ser probada y elija la colonia usando un palillo de dientes estéril.Coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga cinco mililitros de PIB. Crecer en una incubadora de coctelera a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, agregue una alícuota del caldo PIB cultivado en una placa de PIA precalemada.Usando un esparcidor celular estéril, esparza el caldo sobre el plato y crece a 37 grados Celsius durante 24 horas. Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 mililitros, agregue 0.85%cloruro de sodio al césped adulto y recoja la muestra raspando la placa usando un esparcidor celular. Aspirar la muestra con una pipeta fresca de 50 mililitros y transferir en un tubo de recogida de 50 mililitros.Vórtice la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo. Para medir el OD600 de las muestras, primero en blanco el espectrofotómetro utilizando un mililitro de cloruro de sodio al 0,85%. A continuación, agregue un mililitro de la muestra a una nueva cubeta desechable y lea la OD. Repita este paso dos veces para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.Ahora agregue tres mililitros de la solución de borato de ácido sulfúrico en tubos de cultivo y deje reposar sobre hielo. Añadir 350 microlitros de la muestra recogida lentamente a la mezcla de ácido en los tubos de ensayo. Después de vórtices brevemente en bajo, añadir 100 microlitros de 0.1%carbazole y solución de etanol a la mezcla de muestra ácida.Tapa el tubo y el vórtice en el ajuste medio durante cinco segundos. A continuación, colocar en un baño seco a 55 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, vórtice los tubos brevemente en alto y dejar enfriar durante cinco minutos.Utilice el tubo con cloruro de sodio al 0,85% en blanco para el espectrofotómetro. A continuación, añada un mililitro de la mezcla a una cubeta limpia y lea la OD de las muestras a 530 nanómetros en un espectrofotómetro. Preparar una curva estándar midiendo el OD530 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico.Repita dos veces y extraiga una ecuación lineal de estas lecturas. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600. Con una micropipeta, agregue 50 microlitros de la muestra recogida a una placa de 96 pozos sin tratar.A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de recubrimiento ELISA a los pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos horas. Con una botella de chorro, lave los pozos de la placa dos veces con PBS-T llenando los pozos y luego drenando el plato volteando la placa.Añadir 200 microlitros de tampón de bloqueo a los pozos con una micropipeta e incubar a cuatro grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave el plato dos veces con PBS-T como antes. A continuación, agregue 100 microlitros de anticuerpo primario diluido a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas.Después de la incubación, lave los pozos de la placa tres veces con PBS-T como antes. A continuación, añadir 100 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Después de lavar la placa de nuevo tres veces, utilice una micropipeta para añadir 100 microlitros de solución TMB ELISA.Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad colocando la placa en un cajón o envolviendo en papel de aluminio. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de parada. Utilice un lector de placas para medir el diámetro de propiedad a 450 nanómetros.Produzca una curva estándar midiendo el OD450 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico. Repita las mediciones dos veces y extraiga una ecuación lineal. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.Aquí se muestran muestras de PAO581 y PAO581 con mutaciones en genes que regulan la pirimidina de novo biosíntesis cultivada en PIA y PIA complementadas con 0,1 milimolar de uracilo. Los datos muestran que la presencia de uracilo en los medios de comunicación da lugar a la conversión de la cepa mutante de nuevo a mucoidy como se ve en la producción de alginato restaurado. Aquí, se muestran los resultados de la ELISA basada en anticuerpos monoclonales antialginato.Las colonias se cultivan en placas PIA con arabinosa para la inducción del promotor PBAD y el plásmido pHERD-20T. Se muestran PAO1, PAO1 que llevan la expresión plásmido pHERD-20T con el principal factor sigma específico de alginato algU, y PAO1 con una eliminación en el marco del gen algD en la codificación de la enzima biosintética de alginato clave GDP-mannosa deshidrogenasa. Estos datos comparan los niveles no mucoide de alginato medidos para PAO1 y PAO1 delta algD con los niveles mucoide de alginato medidos para PAO1 con pHERD-20T algU.ElISA antialginato también se probó en muestras de esputo del paciente sin crecimiento previo en placas. Tres muestras de esputo de CF que tuvieron crecimiento de mucoide P.aeruginosa mostraron alginato detectable en comparación con dos muestras de esputo paciente que contenían un crecimiento no mucoide P.aeruginosa o ningún crecimiento de P.aeruginosa. La preparación de las curvas estándar para la cuantificación del alginato es muy crucial, ya que esto permitirá una medición precisa y precisa del alginato dentro de la muestra.La solución ácida utilizada en el método de carbazole es muy peligrosa, por lo que se deben utilizar equipos de protección personal adecuados y precauciones para garantizar la seguridad. Después de aislar los SGV, se pueden hacer más perfiles genéticos para comprender mejor las mutaciones que ocurren y la patogenicidad asociada con tales mutaciones. El método ELISA se puede adaptar para controlar la infección pulmonar crónica en pacientes con fibrosis quística.Además, nuestro método de crecimiento podría ayudar a diagnosticar infecciones causadas por SCVs específicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...