Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) beviljar R44GM113545 och P20GM103434.

1. SCV tillväxtförhållanden och fysiologisk aktivering av bärgningsvägen
<ol><li>Detektion av SCV.<ol>
<li>Streak P. aeruginosa stammar PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 och PAO581ΔpyrD på förvärmda Pseudomonas isolering agar (PIA) plattor och växa på 37 ° C för 48 h. På tillväxtplattan identifiera en enda koloni isolera som har SCV fenotyp (kolonistorlek 1−3 mm i motsats till den normala 3−5 mm koloni storlek).</li>
		<li>Upprepa steg 1.1.1 för att få ett rent isolerat a...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Både SCV och alginate är viktiga sjukdomsmarkörer inblandade i flera kroniska infektioner. Därför är förmågan att växa SCV samt studera reglering och produktion av alginate av P. aeruginosa integrerad i upptäckten av nya behandlingar för dessa kroniska sjukdomar.
SCV stammar är notoriskt svårt att växa på grund av deras långsamma tillväxttakt4 jämfört med andra P. aeruginosa stammar, som hjälper till i deras antimikrobiell resistens...

Kroniska lunginfektioner med Pseudomonas aeruginosa är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos patienter med cystisk fibros (CF). Under tidig barndom koloniseras patienter av flera bakteriella patogener, inklusive nonmucoid isolat av P. aeruginosa1,2. Uppkomsten av den lilla kolonivarianten (SCV) isolat samt slemhinnor isolat är en markör för uppkomsten av kroniska infektioner. SCV isolat är mycket resistenta3 på grund av deras långsamma tillväxttakt4, vilket gör dem en allvarlig avskräckande i behandlingsregementen och andra kroniska infektioner5 av P. aeruginosa. Arbete av Al Ahmar et al.6 visade en koppling mellan SCV och slemhinnor kopplade av de novo pyrimidin biosyntes. Pyrimidinsvält, på grund av mutationer i gener som var involverade i pyrimidinproduktion, resulterade i SCV fenotyp i nonmucoid referensstam PAO1 och slemhinnederivatet PAO581 (PAO1mucA25).
Även om alginate överproduktion är en viktig sjukdom markör för kroniska lunginfektioner i CF, är det inte klart om det finns ett direkt samband mellan mängden alginate och lungpatologi, och det är oklart om alginate kan användas som en prognos markör för behandling7. Alginate produktionen regleras huvudsakligen av två operons, en reglerande operon(algUmucABCD)8,9 och biosyntetisk operon(algD operon)10,11. Alginate produktionen är hårt reglerad av sigma faktor AlgU9,12 (även känd som AlgT) och nedbrytningen av anti-sigma faktor MucA13. Förmågan att övervaka produktionen av alginate på plats från patienternas slemprover kan bidra till utvecklingen av nya terapeutiska alternativ.
Här beskriver vi ett tillväxttillstånd som upptäcker förekomsten av SCV orsakad av mutanter som inte kan syntetisera pyrimidinde novo. Tillskott av uracil och/eller cytosin, den kvävehaltiga basen av pyrimidinnucleotide, till mediet aktiverar bärgningsvägen och återställer därmed den normala tillväxten i mutanter. Denna tillväxtmetod för dessa specifika SCV mutanter kan användas som en screening metod för att identifiera pyrimidin mutationer i patientprover. Dessutom diskuterar vi två metoder för upptäckt och mätning av alginate produceras och utsöndras av P. aeruginosa. Den första är den traditionella metoden14,15,16 för att försämra polysackaridermed en hög koncentration av syra och sedan lägga till en kolorimetrisk indikator för att kvantifiera koncentrationen i provet. Den andra metoden, som utvecklats i vårt laboratorium, använder Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) med hjälp av en anti-alginate monoklonal antikropp (mAb) som utvecklats av QED Biosciences. ELISA-metoden visar sig vara mer specifik och känslig än urinsyraanalysen och möjliggör säkrare användning på grund av undvikande av den högkoncentrerade svavelsyran. Med elisas förmåga att användas direkt på patientslemprover för att mäta alginat kan det utvecklas som ett övervakningsdiagnostiskt verktyg för att följa mängden alginate som finns i lungorna vid olika perioder av infektionen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen, kan överproducera en exopolysackarider alginate resulterar i en unik fenotyp som kallas mucoidy. Alginate är kopplat till kroniska lunginfektioner som resulterar i dålig prognos hos patienter med cystisk fibros (CF). Förstå de vägar som reglerar produktionen av alginate kan bidra till utvecklingen av nya terapeutiska strategier som riktar sig till alginate bildning. En annan sjukdomsrelaterad fenotyp är den lilla kolonivarianten (SCV). SCV beror på den långsamma tillväxten av bakterier och ofta förknippas med ökad resistens mot antimikrobiella medel. I detta dokument visar vi först en metod för att odla en genetiskt definierad form av P. aeruginosa SCV på grund av pyrimidin biosyntesmutationer. Tillskott av kvävehaltiga baser, uracil eller cytosin, returnerar den normala tillväxten till dessa mutanter, vilket visar närvaron av en bärgning sytningsväg som rensar fria baser från miljön. Därefter diskuterar vi två metoder för mätning av bakteriell alginat. Den första metoden bygger på hydrolysav av polysackarider till dess urinsyra monomer följt av härledning med en kromogen reagens, carbazole, medan den andra metoden använder en ELISA baserad på en kommersiellt tillgänglig, alginate-specifika mAb. Båda metoderna kräver en standardkurva för mängdering. Vi visar också att den immunologiska metoden är specifik för alginatekvantifiering och kan användas för mätning av alginat i de kliniska proverna.

Figur 1 visar plattor av PAO1 och PAO581 med eller utan in-frame borttagning i pyrd genen (en gen i pyrimidin biosyntesen väg) som resulterar i SCV6. PAO1 SCV mutant återställdes till normal tillväxt som svar på uracil tillskott(figur 1A,B). Dessutom återlämnades PAO581ΔpyrDSCV-mutanten till slemhinnan med samma uracilbehandling, eftersom föräldrastammen PAO581 ...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Här beskriver vi en tillväxt villkor för att kultur den lilla kolonivarianten av Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver också två separata metoder för detektion och mängder av exopolysackarideralginate som produceras av P. aeruginosa med hjälp av en traditionell urinsyra karbazolanalys och en alginate-specifik monoklonal antikropp (mAb) baserad ELISA.

Kultur av liten kolonivariant av Pseudomonas aeruginosa och Antal av dess Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Den lilla kolonivarianten eller SCV-tekniken möjliggör urval och tillväxt av små kolonivarianter av Pseudomonas aeruginosa. Metoden är mycket definitiv och möjliggör enklare urval än normala metoder. Detta protokoll också detaljer en säkrare, mer känslig ELISA metod för alginat kvantifiering jämfört med standard uronic syra carbazole metod, möjliggör direkt alginat kvantifiering i prover utan cautery eller prov manipulation.Demonstrera förfarandet kommer att Brandon Kirby, en lab tekniker, och Roy Al Ahmar, en doktorand från mitt laboratorium. För att upptäcka den lilla kolonivarianten eller SCV, först strimma P.aeruginosa stammen PAO1 delta PYRD på förvörd PIA plattor. Odla stammarna vid 37 grader Celsius i 48 timmar.På tillväxtplattan, identifiera en enda koloni isolat som har SCV fenotyp kännetecknas av en koloni storlek på en till tre millimeter i motsats till den normala tre till fem millimeter koloni storlek. Re-strimla de utvalda kolonierna för att erhålla ett rent isolat av SCVEN. För att utföra fysiologisk aktivering av bärgningsvägen, använd en steril inokuleringsslinga för att plocka SCV-kolonin från PIA-plattan.Strimma den valda kolonin på en förvörd PIA-platta kompletterad med 0,1 millimolar uracil. Odla plattan vid 37 grader Celsius i 24 till 48 timmar. För att börja uronic acid carbazole assay, identifiera en enda koloni från en ren kultur av den önskade stammen som ska testas och plocka kolonin med hjälp av en steril tandpetare.Placera tandpetaren i ett odlingsprovrör som innehåller fem milliliter PIB. Odla i en shaker inkubator vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter inkubation, tillsätt en alikvot av den odlade PIB-buljongen på en förvörd PIA-platta.Med hjälp av en steril cellspridare, sprida buljongen över plattan och växa vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Lägg med en pipettstyrenhet och en steril pipett på 50 milliliter, till 0,85 %natriumklorid i den vuxna gräsmattan och samla ihop provet genom att skrapa plattan med hjälp av en cellspridare. Aspirera provet med hjälp av en färsk 50 milliliter pipett och överför till en 50 milliliter uppsamlingsrör.Vortex provet på hög för att blanda och placera proverna på is. För att mäta OD600 av proverna, först tom spektrofotometern med en milliliter av 0,85%natriumklorid. Tillsätt sedan en milliliter av provet till en ny engångs cuvette och läs OD. Upprepa detta steg två gånger för att få en tre exemplar av läsningar för varje prov.Tillsätt nu tre milliliter av svavelsyraboratlösningen i odlingsrör och låt sitta på is. Tillsätt 350 mikroliter av det uppsamlade provet långsamt till syrablandningen i provrören. Efter kort virvelning på låg, tillsätt 100 mikroliter av 0,1%karbazol och etanollösning till syraprovblandningen.Kapa röret och virveln på medelinställningen i fem sekunder. Placera sedan i ett torrt bad vid 55 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubation, virvel rören kort på hög och låt svalna i fem minuter.Använd röret med 0,85%natriumklorid som ett blankt till spektrofotometern. Tillsätt sedan en milliliter av blandningen till en ren cuvette och läs OD av proverna på 530 nanometer på en spektrofotometer. Förbered en standardkurva genom att mäta OD530 av serieutspädningar av kända koncentrationer av d-mannuronic syra.Upprepa två gånger och extrahera en linjär ekvation från dessa avläsningar. Beräkna alginatkoncentrationen i varje prov med hjälp av standardkurvan och dela alginatkoncentrationen från linjär ekvation genom OD600 för att erhålla den totala alginatmängden per OD600. Med hjälp av en mikropipette, tillsätt 50 mikroliter av det insamlade provet till en obehandlad 96-brunnsplatta.Lägg sedan till 50 mikroliter av ELISA-beläggningsbuffert till brunnarna. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i två timmar. Tvätta tallriksbrunnarna två gånger med PBS-T genom att fylla brunnarna och sedan tömma dem genom att vända på plattan genom att vända på tallriken.Tillsätt 200 mikroliter av blockerande buffert till brunnarna med en mikropipette och inkubera vid fyra grader Celsius över natten. Nästa dag, tvätta plattan två gånger med PBS-T som tidigare. Tillsätt sedan 100 mikroliter av utspädd primär antikropp mot brunnarna och inkubera vid 37 grader Celsius i en till två timmar.Efter inkubation, tvätta plattan brunnar tre gånger med PBS-T som tidigare. Därefter lägger du till 100 mikroliter av utspädd sekundär antikropp mot brunnarna och inkuberar vid 37 grader Celsius i en till två timmar. Efter tvätt av plattan igen tre gånger, använd en mikropipette för att lägga till 100 mikroliter av TMB ELISA-lösning.Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter i mörker genom att placera plattan i en låda eller inslagning i folie. Lägg sedan till 100 mikroliter av stopplösning. Använd en tallriksläsare för att mäta OD vid 450 nanometer.Producera en standardkurva genom att mäta OD450 av serieutspädningar av kända koncentrationer av d-mannuronic syra. Upprepa mätningarna två gånger och extrahera en linjär ekvation. Beräkna alginatkoncentrationen i varje prov med hjälp av standardkurvan och dela alginatkoncentrationen från den linjära ekvationen med OD600 för att erhålla den totala alginatmängden per OD600.Visas här är prover av PAO581 och PAO581 med mutationer i gener som reglerar pyrimidin de novo biosyntes odlas på PIA och PIA kompletteras med 0,1 millimolar av uracil. Uppgifterna visar att förekomsten av uracil i media resulterar i omvandlingen av mutantstammen tillbaka till mucoidy som ses av den återställda alginatproduktionen. Här visas resultat för anti-alginaten monoklonal antikroppsbaserade ELISA.Kolonier odlas på PIA-plattor med arabinose för induktion av PBAD promotorn och pHERD-20T plasmid. Visas är PAO1, PAO1 bär uttrycket plasmid pHERD-20T med de viktigaste alginat specifika sigma faktor algU, och PAO1 med en in-frame borttagning av algD genen i kodning nyckeln alginat biosyntetiska enzym BNP-manose dehydrogenas. I dessa data jämförs de icke-mucoidnivåer av alginate som uppmätts för PAO1 och PAO1 delta algD jämfört med de mucoidnivåer av alginat som uppmätts för PAO1 med pHERD-20T algU.Anti-alginate ELISA testades också på patient sputum prover utan tidigare tillväxt på plattor. Tre CF sputum prover som hade tillväxt av mucoid P.aeruginosa visade påvisbara alginat jämfört med två patient sputum prover som innehöll antingen icke-mucoid P.aeruginosa eller ingen P.aeruginosa tillväxt. Utarbetandet av standardkurvorna för alginatkvantifieringen är mycket avgörande eftersom detta kommer att möjliggöra exakt och exakt mätning av alginat inom provet.Den syralösning som används i karbazolmetoden är mycket farlig så korrekt personlig skyddsutrustning och försiktighetsåtgärder måste användas för att garantera säkerheten. Efter att isolera SCVs, ytterligare genetisk profilering kan göras för att bättre förstå mutationer som förekommer och patogenicitet är associerade med sådana mutationer. ELISA-metoden kan anpassas för att övervaka kronisk lunginfektion hos patienter med cystisk fibros.Dessutom kan vår tillväxtmetod hjälpa till att diagnostisera infektioner orsakade av specifika SCVs.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifiering av nya gener associerade med alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Med hjälp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon mutagenes

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder för att upptäcka cytotoxiska amyloid följande infektion av pulmonell Endothelial celler av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...