Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

1. SCV Büyüme Koşulları ve Kurtarma Yolu Fizyolojik Aktivasyonu
<ol><li>SCV tespiti.<ol>
<li>P. aeruginosa suşları PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 ve PAO581ΔpyrD önceden ısıtılmış Pseudomonas izolasyon agar (PIA) plakaları üzerinde çizgi ve 48 saat için 37 °C'de büyür. Büyüme plakası üzerinde SCV fenotip (normal 3−5 mm koloni boyutu aksine 1−3 mm koloni boyutu) olan tek bir koloni izole tanımlayın.</li>
		<li>SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için adı...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Hem SCV hem de aljinat çeşitli kronik enfeksiyonlarda bulunan önemli hastalık belirteçleridir. Bu nedenle, SCV büyümek ve P. aeruginosa tarafından aljinat düzenleme ve üretim çalışma yeteneği bu kronik hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi ayrılmaz bir parçasıdır.
SCV suşları diğer P. aeruginosa suşları ile karşılaştırıldığında onların yavaş büyüme hızı4 nedeniyle büyümek için kötü üne sahiptir, onların ...

Pseudomonas aeruginosa ile kronik akciğer enfeksiyonları kistik fibrozis (CF) olan hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Erken çocukluk döneminde, hastalar P. aeruginosanonmucoid izole dahil olmak üzere birden fazla bakteriyel patojenler tarafından kolonize edilir1,2. Küçük koloni varyantının (SCV) ortaya çıkması izole yanı sıra mukoid izole kronik enfeksiyonlara başlangıç için bir belirteçtir. SCV izole son derece ilaca dirençli3 yavaş büyüme oranlarınedeniyle 4, hangi onları tedavi alayları ve diğer kronik enfeksiyonlar da ciddi bir caydırıcı hale getirir5 P. aeruginosatarafından . Al Ahmar ve ark.6'nın çalışmaları, de novo pirimidin biyosentezi ile bağlantılı SCV ve mucoidy arasında bir bağlantı olduğunu gösterdi. Pirimidin açlık, pirimidin üretimi ile ilgili genlerde mutasyonlar nedeniyle, nonmucoid referans zorlanma PAO1 ve mukoid türevi SCV fenotip sonuçlandı, PAO581 (PAO1mucA25).
Aljinat overproduction CF kronik akciğer enfeksiyonları için önemli bir hastalık belirteci olmasına rağmen, aljinat ve akciğer patolojisi miktarı arasında doğrudan bir korelasyon olup olmadığı açık değildir, ve aljinat tedavi için bir prognoz belirteci olarak kullanılabilir olup olmadığı belirsizdir7. Aljinat üretimi esas olarak iki operon, düzenleyici operon(algUmucABCD)8,9 ve biyosentetik operon(algD operon)10,11tarafından düzenlenir. Aljinat üretimi sıkıca sigma faktörü AlgU9tarafından düzenlenir9 ,12 (ayrıca AlgT olarak da bilinir) ve anti-sigma faktörü MucA13bozulması . Hastaların balgam örneklerinden aljinat in in in üretimini izleyebilme yeteneği yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Burada, pirimidin de novo sentezleyemeyen mutantların neden olduğu SCV varlığını tespit eden bir büyüme durumunu tanımlıyoruz. Urasil ve/veya sitozin takviyesi, pirimidin nükleotitinin azotlu tabanı, kurtarma yolunu aktive eder, böylece mutantlarda normal büyümeyi geri sağlar. Bu spesifik SCV mutantları için bu büyüme yöntemi, hasta örneklerinde pirimidin mutasyonlarını belirlemek için bir tarama yöntemi olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, p. aeruginosatarafından üretilen ve salgılanan aljinat tespiti ve ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk geleneksel yöntem14,15,16 asit yüksek konsantrasyon kullanarak polisakkarit aşağılayıcı ve daha sonra örnek konsantrasyonu quantitate için bir kolorimetrik gösterge ekleyerek. Laboratuvarımızda geliştirilen ikinci yöntem, QED Biosciences tarafından geliştirilen anti-aljinat monoklonal antikor (mAb) kullanarak Enzime Bağlı İmmünosorbent Assay (ELISA) kullanılmaktadır. ELISA yöntemi üronik asit tizinden daha spesifik ve hassas olduğunu kanıtlar ve yüksek konsantrasyonlu sülfürik asitten kaçınma nedeniyle daha güvenli kullanım sağlar. ELISA'nın aljinat ölçmek için doğrudan hasta balgam örneklerinde kullanılabilme özelliği ile, enfeksiyonun farklı dönemlerinde akciğerlerde bulunan aljinat miktarını takip etmek için bir izleme tanı aracı olarak geliştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, fırsatçı gram-negatif bakteriyel patojen, mucoidy denilen benzersiz bir fenotip sonuçlanan bir eksopolisakkarit aljinat aşırı üretebilir. Aljinat kistik fibrozis (CF) olan hastalarda kötü prognoz ile sonuçlanan kronik akciğer enfeksiyonları ile bağlantılıdır. Aljinat üretimini düzenleyen yolların anlaşılması, aljinat oluşumunu hedefleyen yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hastalığa bağlı bir diğer fenotip ise küçük koloni varyantıdır (SCV). SCV bakterilerin yavaş büyüme nedeniyle ve genellikle antimikrobiyallere karşı artan direnç ile ilişkilidir. Bu yazıda ilk olarak pimimidin biyosentez mutasyonlarına bağlı olarak genetik olarak tanımlanmış p. aeruginosa SCV formunu niçin bir yöntem gösterdik. Azotlu bazların takviyesi, urasil veya sitozin, bu mutantlar için normal büyüme döner, çevreden serbest üsleri temizler bir kurtarma yolu varlığını gösteren. Daha sonra, bakteriyel aljinat ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk yöntem, polisakkaritin hidrolizine, üronik asit monomerine dayanır ve ardından kromojenik reaktif, karbazol ile türevleştirme yapılır, ikinci yöntem ise ticari olarak kullanılabilir, aljinat özgü mAb'ye dayalı bir ELISA kullanır. Her iki yöntem de nicellik için standart bir eğri gerektirir. Ayrıca immünolojik yöntemin aljinat ölçümü için spesifik olduğunu ve klinik örneklerde aljinat ölçümü için kullanılabileceğini de göstermektedir.

Şekil 1 PID geninde (pirimidin biyosentez yolunda ki bir gen) çerçeve içi deletion olan veya olmayan PAO1 ve PAO581 plakalarını gösterir ve bu plakalar SCV6ile sonuçlanır. PAO1 SCV mutanturasil takviyesi yanıt olarak normal büyüme geri yüklendi (Şekil 1A,B). Ayrıca, PAO581ΔpyrDSCV mutant aynı urasil tedavi ile mucoidy döndü, ebeveyn suşu PAO581 ek bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Burada, pseudomonas aeruginosaküçük koloni varyantı kültüre bir büyüme durumu açıklar. Ayrıca p. aeruginosa tarafından üretilen eksopolisakkarit aljinatının saptanması ve nicelliği için geleneksel üronik asit karbazol testi ve aljinatspesifik monoklonal antikor (mAb) bazlı ELISA kullanılarak iki ayrı yöntem tanımlanmıştır.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Küçük koloni varyantı veya SCV tekniği Pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyantları seçimi ve büyüme sağlar. Yöntem çok kesin ve normal yöntemlere göre daha kolay seçim sağlar. Bu protokol aynı zamanda aljinat kantifikasyonu için standart üronik asit karbazol yöntemine kıyasla daha güvenli ve daha hassas bir ELISA yöntemini ayrıntılarıyla anlatarak, numunelerde katutery veya numune manipülasyonu olmaksızın doğrudan aljinat nicelemesini sağlar.Prosedürü gösteren brandon Kirby, bir laboratuvar teknisyeni ve Roy Al Ahmar, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Küçük koloni varyantını veya SCV'yi tespit etmek için, önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerinde p.aeruginosa zorlanma PAO1 delta PYRD ilk çizgi. Suşları 48 saat boyunca 37 derecede büyütün.Büyüme plakası üzerinde, normal üç ila beş milimetre lik koloni boyutuna karşılık bir ila üç milimetrelik bir koloni boyutu ile karakterize SCV fenotip olan tek bir koloni izole tanımlayın. SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için seçilen kolonileri yeniden çizgileyin. Kurtarma yolunun fizyolojik aktivasyonunu gerçekleştirmek için, PIA plakasından SCV kolonisini seçmek için steril bir aşılama döngüsü kullanın.Seçilen koloniyi 0,1 milimolar urasil ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış PIA plakası üzerinde çizgi. 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derece plaka büyütün. Üronik asit karbazol testine başlamak için, test edilecek istenilen suş saf bir kültürden tek bir koloni belirlemek ve steril bir kürdan kullanarak koloni almak.Kürdanı beş mililitre PIB içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir shaker kuluçka büyütün. Kuluçkadan sonra, önceden ısıtılmış PIA plakasına kültürlü PIB suyu bir aliquot ekleyin.Steril bir hücre yayıcı kullanarak, plaka üzerinde suyu yayıldı ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyümek. Bir pipet denetleyicisi ve steril 50 mililitrelik pipet kullanarak, yetişkin çim% 0.85 sodyum klorür ekleyin ve bir hücre dağıtıcı kullanarak plaka kazınarak örnek toplamak. Taze 50 mililitrelik pipet kullanarak numuneyi aspire edin ve 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarın.Karışımı ve buz üzerinde yer için yüksek üzerinde örnek Girdap. Örneklerin OD600 ölçmek için, ilk boş spektrofotometre kullanarak bir mililitre kullanarak 0.85% sodyum klorür. Sonra yeni bir tek kullanımlık cuvette için örnek bir mililitre ekleyin ve OD okuyun. Her örnek için bir okuma triplicate elde etmek için bu adımı iki kez tekrarlayın.Şimdi kültür tüpleri içine sülfürik asit borat çözeltisi üç mililitre ekleyin ve buz üzerinde oturup sağlar. Test tüplerinde asit karışımı yavaş yavaş toplanan örnek 350 mikrolitre ekleyin. Kısa bir süre düşük girdap sonra, asit örnek karışımına% 0.1 karbazol ve etanol çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.Tüpü ve girdabı orta ayarda beş saniye boyunca kaplayın. Sonra 30 dakika boyunca 55 santigrat derece kuru bir banyo yerleştirin. Kuluçkadan sonra tüpleri kısa bir süre yüksekte talan edin ve beş dakika soğumaya bırakın.Spektrofotometreye boş olarak %0,85 sodyum klorür içeren tüpü kullanın. Sonra temiz bir cuvette karışımın bir mililitre ekleyin ve bir spektrofotometre üzerinde 530 nanometre de örneklerin OD okuyun. Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD530'u ölçerek standart bir eğri hazırlayın.İki kez tekrarlayın ve bu okumalardan doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ile bölün. Mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 mikrolitresini işlenmemiş 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin.Daha sonra kuyulara 50 mikrolitre ELISA kaplama tamponu ekleyin. Plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, kuyuları doldurarak ve sonra plakayı ters çevirerek süzerek plaka kuyularını PBS-T ile iki kez yıkayın.Bir mikropipet ile kuyulara tampon engelleme 200 mikrolitre ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat inkübat. Ertesi gün, daha önce olduğu gibi PBS-T ile iki kez plaka yıkayın. Sonra kuyulara seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka.Kuluçkadan sonra, plaka kuyularını daha önce olduğu gibi PBS-T ile üç kez yıkayın. Daha sonra, kuyulara 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 derecede 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı üç kez tekrar yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre TMB ELISA çözeltisi eklemek için bir mikropipet kullanın.Tabağı bir çekmeceye yerleştirerek veya folyoya sararak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra stop çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. 450 nanometre de OD ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD450'sini ölçerek standart bir eğri üretin. Ölçümleri iki kez tekrarlayın ve doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu OD600 ile doğrusal denklemden ayırın.Burada gösterilen PAO581 ve PAO581 örnekleri pia ve PIA üzerinde yetiştirilen pimimidin de novo biyosentezdüzenleyen genlerde mutasyonlar ile 0.1 milimolar urasil ile takviye. Veriler, medyada urasil varlığının mutant geriliminin restore edilen aljinat üretiminde görüldüğü gibi mucoidy'e dönüştürülmesiyle sonuçlanmasına yol açtığını göstermektedir. Burada anti-aljinat monoklonal antikor bazlı ELISA için sonuçlar gösterilmiştir.PBAD promotörü ve pHERD-20T plazmidinin indüksiyonu için arabinoselu PIA plakaları üzerinde koloniler yetiştirilir. Gösterilen PAO1, PAO1 ana aljinat spesifik sigma faktörü algU ile ifade plazmid pHERD-20T taşıyan, ve PAO1 anahtar aljinat biyosentetik enzim GSY-mannose dehidrogenaz kodlama algD geninin bir çerçeve silme ile. Bu veriler PAO1 ve PAO1 delta algD için ölçülen aljinat mukoid olmayan aljinat düzeylerini pHERD-20T algU ile PAO1 için ölçülen aljinat mukoid düzeyleri ile karşılaştırılır.Anti-aljinat ELISA da plakalar üzerinde önceden büyüme olmadan hasta balgam örnekleri üzerinde test edildi. Mucoid P.aeruginosa büyümesi olan üç CF balgam örneği, mukoid olmayan P.aeruginosa veya P.aeruginosa büyümesi içermeyen iki hasta balgam örneği ile karşılaştırıldığında saptanabilir aljinat gösterdi. Aljinat ölçümü için standart eğrilerin hazırlanması çok önemlidir, çünkü bu örnek içinde aljinatın kesin ve doğru ölçümü ne olanak sağlayacaktır.Karbazol yönteminde kullanılan asit çözeltisi çok tehlikelidir, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik sağlamak için önlemler kullanılmalıdır. SCV'leri izole ettikten sonra, meydana gelen mutasyonları ve bu mutasyonlarla ilişkili patojeniteyi daha iyi anlamak için daha fazla genetik profilleme yapılabilir. ELISA yöntemi kistik fibrozisli hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunu izlemek için uyarlanabilir.Ayrıca, büyüme yöntemimiz spesifik SCV'lerin neden olduğu enfeksiyonların teşhisine yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...