Name: culture, manipulation, and orthotopic transplantation of mouse bladder tumor organoids
Uploaded: 2020-01-31T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами Национального исследовательского фонда Кореи к K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A10477755, NRF-2017R1A5A1015366, Программа развития креативных технологий экономики (SF317001A POSCO) BK21 Плюс научно-исследовательское стипендию.

<ol>
	<li>Sanli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+cancer.">Bladder cancer.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).</li><li>Stenzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+muscle-invasive+and+metastatic+bladder+cancer:+update+of+the+EAU+guidelines.">Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines.</a> European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603 (2012).</li><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-517 (2018).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer&#8211;derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer&#8211;derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+mammalian+Hedgehog+signaling+to+the+stroma+determines+the+molecular+subtype+of+bladder+cancer.">Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer.</a> eLife. 8, 43024 (2019).</li><li>Shin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+of+bladder+neoplasia+and+tissue+dynamics+of+its+progression+to+invasive+carcinoma.">Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma.</a> Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).</li><li>Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bladder+wall+injection.">Mouse bladder wall injection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).</li></ol>

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Этот протокол описывает экспериментальные процедуры для культуры и поддержания мочевого пузыря опухоли органоидов, полученных из канцероген-индуцированной опухоли мочевого пузыря.
В этом протоколе есть несколько экспериментальных шагов, в которых процедурам может потребоваться устранение неполадок. Во-первых, количество опухолевых клеток, которые первоначально семенами является критическим фактором, потому что низкое количество опухолевых клеток в культуре (No lt;2 х 104 клетки) в основном приводят к гибели клеток из-за отсутствия взаимодействий между опухолевыми клетками. В отличие от этого, начиная со слишком большого количества клеток (Nogt;5 x 104 клетки) при посеве приводит к переполненности органоидов, в результате чего трудности при обработке культур с плохим ростом каждого органоида. Настоятельно рекомендуется, чтобы несколько пластин с различными числами клеток были созданы в начале для оптимизации экспериментальных условий. Определение нужного количества первоначальных опухолевых клеток имеет решающее значение для достижения высочайшей жизнеспособности клеток и для создания успешных органоидов опухоли мочевого пузыря. Кроме того, в долгосрочной культуре более 2 недель без прохождения, большинство опухолевых органоидов остановить рост, потенциально из-за недостаточного питания питательных веществ в центре органоидов и истощение фактора роста в подвале мембраны матрицы. Таким образом, субкультирование органоидов своевременно является важным шагом для поддержания культуры органов опорно-уреопухолевого содержания.
Во-вторых, производство высокотизерных лентивирусных частиц имеет решающее значение для эффективной генетической манипуляции опухолевыми органоидами. Для устранения неполадок вирус титер связанных вопросов, настоятельно рекомендуется, чтобы вирус титры быть определены до вирусной трансдукции каждый раз, потому что лентивирные конструкции, как правило, производят вирусные частицы с различной эффективностью. Если опухолевые органоиды обладают низкой жизнеспособностью после вирусной инфекции, вполне вероятно, что вирусные титры потенциально слишком высоки. Настоятельно рекомендуется использовать меньшее количество вируса в этом случае. В-третьих, во время ортотопической трансплантации инсированных BBN органоидов опухолевых мочевого пузыря, очень важно поддерживать целостность стенки мочевого пузыря. В случае, если инъекция достигает просвет мочевого пузыря, проникая в слой стенки мочевого пузыря, эксперимент должен быть прекращен и отброшен. По возможности рекомендуется мониторинг роста опухоли мочевого пузыря с помощью ультразвуковой системы визуализации.
Одним из ограничений современных методов является отсутствие опухолевой микросреды или стромы в этих органоидах. Чтобы преодолеть эту проблему, настоятельно рекомендуется, чтобы ортотопические трансплантации опухолевых органоидов использовать in vivo системы для имитации родной микросреды опухоли. В будущем необходимо будет разработать 3D-органоидные системы, состоящие из опухолевых органоидов с другими компонентами опухолевой стромы.
Одним из основных последствий нашей техники является то, что при ортотопической трансплантации опухолевых органоидов только 10 органоидов опухолевых мочевого пузыря могут вызвать рост опухоли в мочевом пузыре. По сравнению с обычными экспериментами по трансплантации опухоли, которые требуют 5 х 105-1 х 106 одноместных опухолевых клеток мочевого пузыря, наши методы являются гораздо более эффективными и надежными. Другим существенным отличием является то, что органоиды могут быть разнообразны манипулировать с помощью различных лентивирных векторов, таких как лентивирные конструкции, содержащие короткошерстную РНК, систему CRISPR-Cas9, или гены, представляющие интерес. Это будут мощные инструменты для добавления к современной органоидной технологии. В целом, экспериментальные подходы, представленные здесь может способствовать созданию моделей опухолей in vitro, которые могут улучшить наше понимание патогенеза рака мочевого пузыря, а не с помощью 2D линий раковых клеток мочевого пузыря.
Этот метод был в состоянии установить мочевого пузыря опухоли органоидов, полученных из канцерогена индуцированной опухоли мочевого пузыря. В статье приводится описание опосредованных лентивирусом экспериментальных процедур, с помощью которых вводятся и успокоятся генетические модификации в органоидах опухолевых мочевого пузыря. Кроме того, включена процедура ортотопической трансплантации опухолевых органоидов. В сочетании с современными моделями рака in vivo, этот метод будет полезным инструментом для изучения молекулярной основы опухоли мочевого пузыря.

Рак мочевого пузыря является наиболее распространенным раком мочевыводящих путей, с примерно 165000 пациентов умирают ежегодно1. Среди различных видов рака мочевого пузыря, инвазивная уротелиальная карцинома обладает агрессивным фенотипом, и его 5-летняя выживаемость ниже 50%2. Новые терапевтические варианты для инвазивных опухолей уротелиала не были расширены в течение последних нескольких десятилетий1.
Раковые клеточные линии были широко использованы для скрининга наркотиков3. Хотя благоприятные результаты наблюдались в многочисленных кандидатов наркотиков в раковых клеток линий, плохие результаты, как сообщается, в клинических испытаниях4. После повышенной адаптации к двумерным (2D) средам культуры в пробирке становится все труднее переизглагать местные опухоли в клеточных линиях. Модели рака животных или пациента полученных опухоли ксенотрансплантатов могут быть использованы для решения ограничений, наблюдаемых в линии раковых клеток мочевого пузыря. Тем не менее, модели рака животных являются временной и ресурсоемкой. Таким образом, улучшенные модели заболеваний были востребованы в течение многих лет и новая модель системы, органоиды, была разработана для преодоления недостатков существующих моделей5.
Органоид представляет собой многоклеточную 3D конструкцию, которая может резюмировать в пробирке физиологические характеристики соответствующего органа in vivo. Нормальные и опухолевые органоиды могут быть получены из плюрипотентных или взрослых стволовых клеток, и первичных опухолевых клеток, соответственно5,6. За последние несколько лет, опухолевые органоиды были созданы из большого количества разнообразных опухолевых тканей7,в том числе толстой кишки8,9, мочевого пузыря10, поджелудочной железы11,12, простаты13, печени14, и молочной железы15 опухолевых тканей. Такие опухолевые органоиды имитируют свои оригинальные опухоли фенотипически и генетически. Из-за их сходства с инвиво опухолевых тканей и их многочисленных практических применений, исследователи приняли их в качестве новых моделей заболеваний в исследовании патогенеза рака.
Здесь изложены процедуры по установке опухолевых органоидов из канцерогенно-индуцированной муринининальной опухоли16. N-butyl-N-(4-гидроксибутил) нитрозамин (BBN) используется в качестве канцерогена, чтобы вызвать инвазивную уротелиальную карциному у мышей17 и опухолевых органоидов, которые демонстрируют патологические характеристики мышечно-инвазивных опухолей мочевого пузыря, устанавливаются из BBN-индуцированного мочевого пузыря16. Метод генетического манипулирования опухолевыми органоидами иллюстрируется с помощью лецивирусно-опосредованного трансдукции для разработки модельной системы для изучения молекулярной основы развития рака мочевого пузыря. Кроме того, описан метод трансплантации органоидов ортотопически в мочевой пузырь для изучения роли местной среды мочевого пузыря в раке мочевого пузыря.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter (PES membrane)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030-702-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29 G 1/2 insulin syringe</td>
			<td>SHINA</td>
			<td>B299473538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>Norm-ject</td>
			<td>N7.A03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>stock concentration: 25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>4023-2304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>039010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>stock concentration: 50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon 5/0-13mm</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17100017</td>
			<td>stock concentration: 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17100015</td>
			<td>stock concentration: 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyrovial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM(Dulbecco&#39;s modified minimum essential media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO(Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Healthcare</td>
			<td>DIN: 02169428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES009B-KC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>BB001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Hana Pharm Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen (Anafen)</td>
			<td>Merial</td>
			<td>DIN: 02150999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced (GFR) 
			Growth Factor 
			Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>use for organoid culture in plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel high concentration (HC)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>use for organoid transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LT1 transfection reagent</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine EGF(epidermal growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>stock concentration: 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>stock concentration: 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td>stock concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV.R 8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22036</td>
			<td>Packaging plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Envelope plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene(hexadim ethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9286</td>
			<td>stock concentration: 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSiCoR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11579</td>
			<td>Lentiviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline buffer</td>
			<td>JW Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>58656-2500KUCN</td>
			<td>stock concentration: 250 KU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Abmole</td>
			<td>M1817</td>
			<td>stock concentration: 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture, manipulation, and orthotopic transplantation of mouse bladder tumor organoids

Развитие передовых моделей опухоли уже давно поощряется, потому что нынешние модели рака показали ограничения, такие как отсутствие трехмерной (3D) архитектуры опухоли и низкое отношение к раку человека. Исследователи недавно разработали 3D в пробирке модели рака называют опухоли органоидов, которые могут имитировать характеристики родной опухоли в культуре блюдо. Здесь подробно описаны экспериментальные процедуры для создания органов опухоли мочевого пузыря из канцерогенно-индуцированной опухоли мочевого пузыря, включая культуру, прохождение и поддержание полученных 3D-опухолевых органоидов in vitro. Кроме того, описаны протоколы для манипулирования установленными органоидными линиями опухолевых опухолей мочевого пузыря для генной инженерии с использованием трансдукции опосредованного лецивируса, включая оптимизированные условия для эффективного внедрения новых генетических элементов в опухоль органоиды. Наконец, выложена процедура ортотопической трансплантации органоидов опухолевых мочевого пузыря в стенку мочевого пузыря для дальнейшего анализа. Методы, описанные в этой статье может способствовать созданию модели in vitro для рака мочевого пузыря для разработки лучших терапевтических вариантов.

В пробирке культуры органов опухоли мочевого пузыря мыши Количество опухолевых клеток, отделенных от опухоли, вызваннойBBN, составляет не менее 4 х 105 клеток. Когда клетки первоначально посеяны в подвале мембраны матрицы, нераковые клетки и мусора могут наблюдаться. Мусор постепенно разбавлялся, продолжая субкультуру. На рисунке 1B показаны изображения культивированных органоидов в разных точках времени. Если опухолевые клетки не образуют опухолевые органоиды, клетки потенциально мертвы во время этапа диссоциации. В таком случае процедуры диссоциации, включая инкубационное время с ферментом, должны быть скорректированы для повышения жизнеспособности клеток.
Выражение GFP в органоидах опухоли мочевого пузыря с использованием лецивирусно-опосредованных генетических манипуляций Органоиды опухоли мочевого пузыря продемонстрировали сильные сигналы GFP с успешной лентивирусной инфекцией(рисунок 2B). После концентрации, в общей сложности 250 qL вирусосодержащих средств массовой информации было достаточно, чтобы заразить 3 х 104 одиночных опухолевых клеток на матрице мембраны подвала, сохраняя 90%-100% эффективность инфекции. Сигналы GFP могут быть обнаружены из органов опухоли мочевого пузыря через 3 дня после лентивирусной трансдукции. Если сигналы флуоресценции низки, эффективность вирусной инфекции потенциально низка. Это может быть связано с многочисленными факторами, такими как низкий вирусный титр, и процедуры должны быть скорректированы соответствующим образом.
Ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолевых пузырей Аллотрансплантат опухоли мочевого пузыря, полученный из BBN-индуцированных органоидов опухоли мочевого пузыря представлен на рисунке 3B16. Аллотрансплантаты опухоли мочевого пузыря были собраны через 3 недели после ортотопической трансплантации. Гистология пересаженной опухоли мочевого пузыря была проанализирована с помощью H и E окрашивания. Ортотопические трансплантации опухолевых органоидов могут расти как опухоли мочевого пузыря в течение 2-3 недель.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig01.jpg"> Рисунок 1: В пробирке культуры мышечного мочевого пузыря опухоли органоидов. (A) Схемаическая диаграмма для создания органов опухоли мочевого пузыря мыши. (B) Представитель изображения для культуры органоидов опухоли мочевого пузыря в разных точках времени. Органоиды опухоли мочевого пузыря мыши были установлены и культивированы в течение 9 дней. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig02.jpg"> Рисунок 2: Выражение GFP в органоидов опухоли мочевого пузыря с использованием лецивирусо-опосредованных генетических манипуляций. (A) Схематическая диаграмма лентивиральной трансфекции и трансдукции органоидов опухоли мочевого пузыря. (B) Репрезентативные изображения органоидов опухоли мочевого пузыря, выражающие GFP. Шкала баров 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig03.jpg"> Рисунок 3: Ортотопическая трансплантация органов опухоли мочевого пузыря. (A) Схемаальная схема ортотопической трансплантации органоидов опухоли мочевого пузыря обнаженной мыши. (B) Представитель изображения мочевых пузырей и H и E окрашенных разделов от мышей ортотопически пересажены с органоидами опухоли мочевого пузыря. Увеличенные виды коробочные области в средних панелях отображаются в левой панели. Шкала бар 500 мкм. Эта цифра была воспроизведена на рисунке 1-Рисунок Дополнение 1, Ким и др.16, опубликованные в соответствии с Creative Commons Атрибуция 4.0 Международная общественная лицензия (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Органоиды опухоли мочевого пузыря мыши средние</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расширенный DMEM/F-12 (базовая среда)</td>
			<td>10 мМ HEPES (pH 7.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 мМ Никотинамид</td>
			<td>0.5x Безсыворотка дополнение</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 мМ L-аланил-L-глутамиин дипептид</td>
			<td>1% Пенициллин/Стрептомицин</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 мМ Н-ацетил-L-цистеин</td>
			<td>50 нг/мл Мурин эпидермального фактора роста</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 мкм А 83-01</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Состав органоидной среды опухоли мочевого пузыря.

Watch this Scientific Journal Video about Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids at JoVE.com

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Этот протокол предоставляет подробные экспериментальные шаги по созданию трехмерной культуры in vitro опухолевых органоидов мочевого пузыря, полученных от рака, индуцированного мочевого пузыря. Описаны культурные методы, включая пропускную связь, генную инженерию и ортотопическую трансплантацию опухолевых органоидов.

Культура, манипуляция и ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолей мышелового пузыря

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Опухолевые органоиды широко используются в качестве модели рака in vitro для изучения биологии опухолей. Наш протокол обеспечивает подробную процедуру изоляции, культуры и генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, выступающей в качестве важного инструмента для изучения различных аспектов в биологии рака. Используя наш протокол, мы можем генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, чтобы выразить или выбить ген нашего интереса.Кроме того, с помощью нашего метода ортотопической трансплантации, мы можем создать нетронутую опухоль микроокноронии опухолевых органоидов. Демонстрацией процедуры будет юбин Ким, аспирант нашей лаборатории. Начните с установления органоидов опухоли мочевого пузыря из опухоли мочевого пузыря.Добавьте один миллилитр 10 миллимолярной HEPES в DMEM к фрагментам опухоли и измельчите ткань стерилизованным лезвием бритвы. Чтобы разобщить фрагменты в клеточную суспензию, добавьте девять миллилитров DMEM с HEPES, коллагеназы типа один и два, и термолизин к опухолевым частям, и инкубировать их в течение 1,5 до двух часов при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа на орбитальном шейкере. После инкубации перенесите подвесную клетку в 50-миллилитровую трубку.Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант. Resuspend гранулы в пять миллилитров ACK лизай буфера и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение трех-пяти минут, чтобы вынизыть любые красные кровяные тельца. Между тем, пальто хорошо в 24-хорошо пластины с 150 микролитров ледяного фактора роста снижение мембранной матрицы подвала и поместите пластину в инкубатор в течение 30 минут.Добавьте 20 миллилитров DMEM в трубку с клетками и повторите центрифугу. Аспирировать супернатант и повторно процедить гранулы в один миллилитр 0,25%трипсина ЭДТА и 10 микромолейных Y-27632 дигидрохлорида. Инкубировать трубку в течение пяти минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане.Затем нейтрализуем трипсин, добавив 10 миллилитров DMEM с 10%FBS. Фильтровать подвеску клетки через 100 микрометровый клеточный ситечко на новой 50-миллилитровой трубке для удаления непереваренного мусора. Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант.Затем повторно посчитайте гранулы одним миллилитром DMEM и подсчитайте клетки с гемоцитометром. Перенесите три-четыре раза по 10 четырем опухолевым клеткам на микротрубки 1,5 миллилитров на льду и центрифуга в 400 раз г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант и повторно поместите клетки в 500 микролитров довоенной органоидной среды и 10 микромоляров Y-27632.Перенесите подвесную оболочку в ранее подготовленную мембранную матрицу, покрытую хорошо, и поместите 24-хорошую пластину обратно в инкубатор. Замените среду каждые два дня 500 микролитров довоенной органоидной среды. Разделите органоиды опухоли за 12 часов до постивирусной опосредованной трансдукции.На следующий день, быстро оттаивать вирус, содержащий aliquot в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Добавьте оттаявный вирус в 250 микролитров органоидной среды с 10 микромоляными Y-27632 и восемью микрограммами на миллилитр бромистого гексадиметрина. Замените органоидную среду в 24-хорошо пластины с 500 микролитров вируса, содержащего средний и инкубировать пластины в течение 12 до 16 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.Для подготовки органоидов опухоли мочевого пузыря для ортотопической трансплантации добавьте 500 микролитров коллагеназы в органоидную среду в 24-хорошо пластины. Pipette матрицы мембраны подвала и средних вверх и вниз, то инкубировать пластины в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. После инкубации, собрать клетки в 15 миллилитров трубки и добавить пять миллилитров предварительной DMEM.Затем центрифуга трубки в 400 раз g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и аспирировать супернатант. Переусердуйте гранулы с помощью одного миллилитра DMEM и перенесите раствор в 90-миллиметровую чашку Петри. Под микроскопом, забрать от 10 до 100 опухолевых органоидов с P200 пипетки и собирать их в микротрубки на льду.Центрифугайте микротрубку и аккуратно удалите супернатант. Затем поддерживать гранулы на льду, пока мыши не будут готовы к операции. Перед пересадкой стенки субмукоза мочевого пузыря держите шприцы, наконечники пипеток и мембранную матрицу подвала на льду до готовности к использованию.После того, как мышь была анестезирована, положите ее в положение на спине и поддерживайте анестезию путем вдыхания маски 2%vaporized isoflurane. Нанесите йод повидоне стерильной марлей и протрите его 70%этанолом. Сделайте небольшой поперечный разрез в коже и мышечной стенке нижней части живота средней линии с помощью стерильных хирургических ножниц.Выставить мочевой пузырь из брюшной полости и поддержать его солевым пропитанным ватным тампоном. Повторное использование органоидных гранул в 80 микролитров органоидной среды, содержащей 50%-ную концентрацию мембранной матрицы, и впрыскивает суспензию в передний аспект купола мочевого пузыря с помощью инсулинового шприца. Закройте разрез 4-0 нейлоновым швом и дезинфицировать хирургическое отделение йодом повидона и 70%этанолом.Позвольте мыши восстановиться под инфракрасным облучением в течение 10-15 минут. Затем снова следите за мышью, пока она не приходит в сознание. Опухолевые органоиды мышей были созданы и культуры в течение девяти дней.Если опухолевые клетки не образуют органоиды опухоли, они потенциально были убиты во время шага диссоциации и время энзиматических пищеварения, возможно, потребуется настроить. Органоиды опухоли мочевого пузыря продемонстрировали сильные сигналы GFP с успешной лентивирусной инфекцией. После концентрации, в общей сложности 250 микролитров вируса, содержащего средства массовой информации было достаточно, чтобы заразить 30000 одиночных опухолевых клеток на мембранной матрице подвала и поддерживать от 90 до 100% эффективности инфекции.Алографы опухоли мочевого пузыря были собраны через три недели после ортотопической трансплантации, а гистология опухоли была проанализирована с помощью окрашивания H и E. Ортопедические трансплантации опухолевых органоидов могут расти как опухоли мочевого пузыря в течение двух-трех недель. После этой процедуры, исследователи могут выполнять иммуногистохимии в результате опухолевых органоидов или провести количественные RT-PCR для генов, представляющих интерес.Эти эксперименты могут еще больше охарактеризовать опухолевые органоиды. Наш протокол позволяет нам манипулировать генами в раковых клетках легко по сравнению с моделью мыши, сохраняя при этом виво характеристики опухолей для того, чтобы изучить конкретные функции различных генов, участвующих в tumorigenesis рака мочевого пузыря.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Флуоресцентные Ортотопическая Мышь Модель панкреатического рака

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Опухоль Модель и опухолевой мышиной цистопластики Система обнаружения

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ультразвуковая ортотопическая имплантация мурин поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ортотопическая трансплантация опухолей молочной железы как доклинические модели рака молочной железы

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Ортотопическая резекционная мышиная модель рака поджелудочной железы

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

Культура органоидов рака мочевого пузыря как инструменты прецизионной медицины

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Субкультура и криоконсервация органоидов аденокарциномы пищевода: плюсы и минусы одноклеточного пищеварения

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...