Name: recapitulating suckling-to-weaning transition in vitro using fetal intestinal organoids
Uploaded: 2019-11-15T11:00:00
Duration: 8 min 15 s
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本研究は、アムステルダム大学動物実験倫理委員会が制定した実験動物のケアと使用に関する制度的ガイドラインに従って行われ、科学的目的のための動物の使用に関する欧州指令2010/63/EUに続く動物研究に関する国家法に完全に準拠しています(ALC312)。
1. 胎児小腸オルガノイドの単離
<ol><li>承認された倫理規定に従って、外科的なはさみで切断することによってE18-E20胎児を犠牲にする。</li>
	<li>安楽死の直後、腸はさみで胎児の下腹部を慎重に切り開き、腸全体を取り除く。 注:隔離は、インビトロで適切な吸引から離天への移行と成熟を達成するために、妊娠のE18とE20の間の腸で行う必要があります。</li>
	<li>2つの小さな鉗子で、腸を伸ばす。胃と付録をガイドとして使用して、小腸の近位および遠位部分を分解する。 メモ:解剖を慎重に行う場合は、同様にコロンを分離することが可能です。付録をガイドとして使用して分解します (図 1)。</li>
	<li>腸を縦に開かせる:長さ方向に配置されたカミソリの刃を使用して腸を固定し、カミソリの刃に沿って鉗子(カミソリブレードの両側の鉗子の片腕)をスライドさせて腸を引っ張ります。その後、開いた腸を1cmで切る。</li>
	<li>10 mL の氷冷リン酸緩衝生理食塩線(PBS)を含む2本の50mLチューブを用意します。小腸の近位および遠位部分(および該当する場合は結腸)をチューブに別々に移す。追加のマウスの腸を解剖しながら、氷の上にチューブを保ちます。同じチューブ内の1つのごみのすべての腸の部分を一緒に収集します。 注:1つのごみは通常6〜10胎児を持っています。すべての胎児の腸を組み合わせる必要があります。この量は、腸の部分ごとに、48ウェルプレートで、オルガノイドで4-8ウェルを生成するのに十分でなければなりません。</li>
	<li>前述の11に従ってオルガノイド分離を進める。要するに、 氷冷PBSで腸片を洗浄し、4°で2mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)で30分間インキュベートし、氷冷PBS+10%胎児子牛血清(FCS)で破片を過酷に洗浄して組織から納骨液を解離し、70μm細胞ストレーナーと遠心分離機を用いて15°50°で下剤を採取する。</li>
	<li>細胞外マトリックスゲルに暗号を有するプレート4〜8ウェルは、ペレットサイズに応じて、暖かい48ウェルプレート中にある。ウェルあたりの細胞外マトリックスゲルに懸濁した20μLのクリプトを使用します。細胞外マトリックスゲルを37°Cのインキュベーターで10分間固化させます。 注:孤立した暗号の40%から50%だけがオルガノイドを形成することを考えると、井戸当たり250〜300オルガノイドの密度を目指す。まず、必要以上に細胞外マトリックスゲルを添加します。最初の井戸をプラッタした後、顕微鏡の下を見て、隔離された暗号の密度が理想的であるかどうかを分析します。必要に応じて、細胞外マトリックスゲルを追加します。</li>
	<li>その間、ENR培地を調製する:14 mLのアドバンスド・ダルベッコの修飾イーグル培地/ハムのF-12(DMEM/F12)1:1 +++(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)1x、 L-グルタミン 0.01 M および 0.2U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン)、ノギン条件メディアの 4 mL、Rspondin 条件メディアの 2 mL、B27 サプリメント 1x の 400 μL、 N2サプリメント1xの200 μL、1.25 mM n-アセチルシステインの50 μL、0.05μg/mL表皮成長因子(EGF)の20μL。 注:大腸オルガノイドを培養する場合は、50%Wntのコンディショニングメディアを補う。</li>
	<li>ウェルごとに250 μLのENR培地を加えます。</li>
</ol>2. 胎児オルガノイドの培養
<ol><li>文化の培地を週3回変更する。オルガノイドの成熟は、培養の1ヶ月後に達成される。</li>
	<li>各通路の後の3日目に、光学顕微鏡を用いて回転楕円体とオルガノイドの数を数える。条件ごとに少なくとも3つの井戸と各井戸に存在するすべてのオルガノイドを定量する。 注: 回転楕円体の数は時間とともに減少し、オルガノイドの数は増加します(図2)。</li>
	<li>オルガノイドを週に1回、以下に説明するように機械的解離して通過する。<ol>
<li>ミディアムを取り外し、1 mL の氷冷アドバンスド DMEM/F12 1:1 +++ を追加します。オルガノイドを含むすべての細胞外マトリックスゲルを15 mLチューブに集めます。1000°Lフィルターチップの上に200°Lチップを使用し、ピペットを20回上下に使用してオルガノイドを破壊します。</li>
		<li>4 °Cで5分間150 x gで遠心分離機。上清を廃棄し、ウェル当たりの細胞外マトリックスゲルの20°Lでペレットを再サスペンドします。通常、胎児オルガノイドは1:2の比率で拡張することができる。</li>
		<li>細胞外マトリックスゲルを5~10分間固化させ、ウェルあたり250μLのENR培地を加えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNAおよびタンパク質レベルでの成熟解析
<ol><li>各通路の3日後に、1ヶ月の期間(すなわち、完全な成熟が達成される時間)の培養を分析する(図3)。 注:胎児オルガノイド培養は動的であり(ムービー1)、機械的破壊後のオルガノイドの正常な再生からの変動を避けるために、常に通過後の同じ日にサンプルを収集する必要があります。</li>
	<li>
RNA単離
	<ol>
<li>β-メルカプトエタノールの2μLを添加したRNAリシスバッファーの200°Lを使用してオルガノイドの3つのウェルを収集します。RNAリシスバッファー+β-メルカプトエタノールを井戸に添加した後、オルガノイドを持つすべての細胞外マトリックスゲルがRNaseフリーの1.5mLチューブに移管されていることを確認してください。</li>
		<li>渦を精力的に保ち、1ヶ月以内に-80°Cに保ちます。市販のシリカスピンカラムキットを使用してRNAを分離します。</li>
		<li>RNA品質を高めるために、洗浄工程後に80%EtOHの500μLを加え、カラムを反転して穏やかに混合します。カラムを完全に乾燥させるために11,000 x gで2分間遠心分離機。 注:グアニジンチオシアネートのすべての痕跡を取り除くために、チューブを3~5回逆さまにフリックして、チューブの蓋の内側を80%EtOHで洗ってください。</li>
		<li>RNA収率を高めるには、RNaseフリー水を塗布してから1~2分待ってから遠心分離機を行ってください。第1のフロースルー溶出をカラムに2回目に適用してRNAを再溶出します。 注:単離されたRNA品質は、ゲノム全体の発現解析での使用には十分です。RNA 整合性番号が 8 を超えるかどうかを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質分離
	<ol>
<li>250°Lの氷冷細胞回収液を1本の15mLチューブに使用して、オルガノイドの5つのウェルを収集します。氷上で少なくとも30分間インキュベートして細胞外マトリックスゲルを溶解する(これは細胞外マトリックスゲルからのタンパク質寄与を減少させる)。</li>
		<li>氷冷PBSで洗います。250 μL の細胞リシスバッファーを追加し、-80 °C で保存します。 注:超音波処理後、サンプルは、酵素活性またはウェスタンブロットを検出するために使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫染色
	<ol>
<li>250°Lの氷冷細胞回収液を15mLチューブに使用して、オルガノイドの2つのウェルを収集します。氷上で少なくとも30分間インキュベートし、細胞外マトリックスゲルを溶解する(これは染色の背景を減少させる)。氷冷PBSで洗います。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500°Lを4°Cで1時間使用してオルガノイドを固定します。氷冷PBSで洗います。全オルガノイド免疫蛍光またはパラフィン埋め込みに進み、公表されたプロトコル12に従う。 メモ:オルガノイドを処理するためにプラスチックパスツールピペットを使用してください。これにより、その構造の中断を回避できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 外因性因子(例としてデキサメタゾン)がオルガノイド成熟過程に及ぼす影響
<ol><li>培養の1日目に、オルガノイドに0.01Mデキサメタゾンを加える。培地が変化するたびに新しいデキサメタゾンを添加することにより、培養の1ヶ月間にデキサメタゾンでオルガノイドをインキュベートする。</li>
	<li>遺伝子発現解析
	<ol>
<li>上記のようにRNAを単離する。合成すると同時に、比較される全てのサンプルのcDNA(処理および未処理)を合成する。推奨qRTPCR法に進みます。</li>
		<li>GeNormを使用して、胎児オルガノイドで新しい治療法が使用されるたびに、2つの最も安定した参照遺伝子を同定します。相対発現の計算には、選択した 2 つの参照遺伝子の幾何平均を使用します。 注:マウス胎児オルガノイドを試験する参照遺伝子の提案:サイクロフィリン、ギャップ、βアクチン、36b4、Hprt、Rpl4、Rpl32、PpibおよびTbp。</li>
		<li>ある外因性因子が出生後マウス胎児成熟にどのような影響を与えるかを調べるには、以下のすべての遺伝子を評価する必要があります。<ol>
<li>胎児マーカーラクタゼ(Lct)、アルギニノコハク酸シンターゼ1(Ass1)、Bリンパ球誘発成熟タンパク質1(Blimp-1)および新生児Fc受容体(FcRn)が培養の最初の2週間の間に発現が低下し、残りの培養時間が欠けているかどうかを確認する(図4C)。このパターンが変更されているかどうかを分析します。</li>
			<li>成人マーカースクラーゼイソマルターゼ(シス)、アルギナス2(Arg2)、トレハラーゼ(トレ)およびリゾチーム(Lyz)の発現が2週間後に発現が増加するかどうかを確認する(図4D)。このパターンが外部因子によって変更されているかどうかを分析します。 注:デキサメタゾンは、胎児オルガノイドの成熟を促進し、他の外因性因子をテストすることを目的としたすべての実験で陽性対照として使用することができる外部因子です。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>酵素活性分析
	<ol>
<li>上記のようにタンパク質を単離する。ダールクヴィストとメッサー13、14によって公開されたプロトコルに従って腸のディス糖を検出する。</li>
		<li>0.625 Mマレイン緩衝液pH 6.0を調製する(4°Cで3ヶ月間保管する)。この緩衝液を使用して、0.05 Mラクトースを調製する(リソソームp-ガラクトシダーゼ活性を阻害する安定剤としてp-ヒドロキシメルクリベンゾエートナトリウムを添加);。0.05 Mマルトース;0.05 M スクロースと 0.05 M トレハロース. 注:これらのソリューションはすべて4°Cで5日間保持することができます。アッセイの準備をしながら氷の上に置き続けてください。</li>
		<li>超純水で5.56 Mグルコース溶液を希釈することによりアッセイ基準を準備し、次の濃度の溶液を得る: 0.125 M;0.1 M;0.075のメートル;0.05 M および 0.025 M. 注:溶液は4°Cで少なくとも3ヶ月間安定している。</li>
		<li>37 °Cで60分間96ウェルプレートでインキュベートする: - ラクトース30μLでオルガノイドリサートの30μL - スクロース30μLでオルガノイドリサートの30°L - マルトース30μLで10倍希釈オルガノイドリサートの30°L - トレハラーゼ30μLで5回希釈オルガノイドリサートの30μL - 30 μL の未希釈オルガノイドリサートを 30 μL のマレイン酸でサンプル背景として - 各グルコース標準の30°L - 超純水の30°L、ブランクとして - 陽性対照の30μL(希釈を最適化し、溶解した胎児腸組織はラクターゼ活性の制御として使用することができ、溶解した成人腸組織はスクラーゼ、マルターゼおよびトレハラーゼのコントロールとして使用することができる) 注:サンプルの希釈は、細胞溶解緩衝液で行う必要があります。アッセイを準備しながら、サンプルとプレートを氷の上に置いてください。</li>
		<li>それぞれの基質でインキュベーションした後にオルガノイド溶解物に存在する酵素によって産生されるグルコースの量を決定するには、PGO-color溶液の200μLを素早く加え、37°Cで30分間450nm毎に吸光度を測定します。 注:PGOカラーソリューションを新鮮にしてください。pH 7.0で0.5mol/LトリスHCl緩衝液で10 U/mLグルコースオキシダーゼ、2 U/mLペルオキシダーゼ、7.88 mmol/L o-ジアニシジンを使用してください。溶液は、プレートに添加する際に室温で行う必要があります。</li>
		<li>グルコース標準に従って活性を計算し、タンパク質の総量(ビシンコニン酸アッセイ(BCA)によって決定される)を補正します。酵素活性は、μMグルコース/μgタンパク質・min-1(図5B)として表す必要があります。 注:市販のアルギネアゼ活性アッセイキットを用いてアルギネアゼ活性を測定する。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.--><html><body>著者は何も開示することを宣言しない。

このプロトコルは、インビトロで吸引から二乳転移を模倣するために長時間にわたって後期胎児腸オルガノイドの培養を記述する。成熟のプロセスは、生体内のペースに等しく、培養の1ヶ月後に完了します。定量RNAおよびタンパク質技術を用いたこの培養物の下流分析が詳細である。
このプロトコルでは、E18-E20マウス胚由来の一次腸細胞が使用される。このプロトコルのオルガノイドを生成するために使用される一次マウス細胞の発達段階は特に重要である。以前の発達段階を使用すると、成人オルガノイド15、16への限定的な移行を伴う長期間にわたって特定の胎児遺伝子発現を維持する腸スフェロイドの生成をもたらす。唯一の後期胎児期回転楕円体は、インビトロ10で成人オルガノイドにトランジットすることができる。腸の成熟に対する外因性因子の影響に関して機会の窓を最大化するために、後期胎児期からの腸が推奨され、微生物や母乳にさらされた生まれた子犬からの腸ではない。特定の細菌代謝産物および乳成分が成熟プロセス17の修飾剤として作用することができると報告されている。
出生から成人までの全成熟を研究するために1ヶ月間培養を維持するのに十分な量の細胞を得るために、下流分析のためのサンプルを採取しながら、6〜8胚からの腸を出発原料として使用すべきである。培養物を生成するために同じ発達段階から胚を用いることが好ましい。発達段階のわずかな違いが成熟遺伝子の発現に影響を与える可能性があるので、異なるごみをプールすることはお勧めしません。
ここで説明するプロトコルは、腸の異なるセグメントの発達特徴を維持するために近位および遠位小腸からのオルガノイド生成を説明する。代わりに、腸全体を使用して、特定のマーカーの発現の増加/減少に関して全体的な成熟を調べることができる。後者の場合、培養を開始するために腸細胞を単離するために使用できる胚は少ない。
このプロトコルは、三次元オルガノイド培養を用いて開発される。オルガノイドは培養において動的な成長を受けるので、通過後の同時時点で下流分析のサンプルを収集することが重要です。このプロトコルでは、オルガノイドが堅牢な芽を含み、細胞死をほとんど含まない2つの分割間の中程度の時間を表すので、通過後3日目を選択しました。通過後の別の時間ポイントを使用できますが、実験全体で一貫性を保つ必要があります。オルガノイド内腔の死細胞の増加が結果に影響を与える可能性があるので、通過後7日間以上オルガノイドを増殖させないことをお勧めします。
我々の実験では、デキサメタゾンを例として、生体内9、18で腸の成熟を加速するために文献で示され、最もよく研究されている外因性因子の例として使用した。デキサメタゾンは、ゲノム経路と非ゲノム経路の両方を介してその効果を発揮します。例えば、ゲノム調節のレベルでは、Sis mRNAレベルの早熟な増加が観察され得る。非ゲノムレベルでは、トレハラーゼなどの消化酵素の活性の変化を観察します。いずれも、生体内19で観察される腸ブラシ境界酵素に対するスクラーゼ遺伝子活性化および非ゲノム活性化作用に関するデキサメタゾンの具体的な態様に従う。合成グルココルチコイドのような外因性因子が、オルガノイド培養における吸引から離乳移行の特定の態様を調節することができるという事実は、生体内で説明されるものと同様に、腸体の成熟の異なる種類の調節剤の調査のためのモデルとしてマウス胎児腸オルガノイドをさらに確立する。
ヒト腸上皮の形態学的成熟は22週の妊娠段階で子宮内で完了するが、腸の関門機能は摂食の種類と密接な関係で小児期まで成熟し、微生物叢および免疫応答。これらの発達段階でのヒト組織の利用可能性が限られているため、in vitroマウスモデルの翻訳値は、腸の成熟を調節することができる因子の高スループットスクリーンの可能性にあり、中から保存されるプロセス哺乳類を吸う。
重要なことに、研究における動物倫理に関して、このモデルは動物に対して行われる介入を含まないので、動物実験の精製に寄与することができる。研究の質問を1つまたは2つの文化のポイントに再設計することで、動物の数をさらに減らすことができます。

マウスや男性を含む多くの哺乳類種では、新生児腸には完全に成熟した腸上皮とは異なるいくつかの特徴がある。これらの特徴は主要な炭水化物として高脂肪および低炭水化物を含むミルクを消化し、吸収する新生児の腸細胞を促進する。新生児腸上皮細胞のブラシ境界は、ジサカリダーゼ・ラクタゼ・フロリジンヒドロラーゼ(Lct)1を発現し、乳二糖乳糖を消化する。吸引期間の後、腸細胞は複雑な炭水化物が豊富で脂肪分が少ない固形食品を消化するために適応します。これは、ラクターゼからスクラーゼイソマルターゼ(シス)およびトレハラーゼ(Treh)へのブラシボーダージサカリダーゼ発現のスイッチによって現れ、固形食品2に存在するより複雑な炭水化物を消化することができる。別の代謝スイッチは、牛乳中のアルギニンの低濃度に関連しています。.アルギニンの必要性を提供するために、新生児腸細胞は、アルギニン生合成における速度制限酵素を発現し、アルギニノコク酸シンターゼ-1(Ass1)、アルギニン3を合成する。対照的に、成体腸細胞はアルギニン2(Arg2)を発現し、固形食品に豊富なアルギニンを異化することができる酵素である。さらに、新生児腸上皮は、乳から循環/血流4への母体IgGの吸収を媒行する免疫グロブリン(FcRn)に対する新生児Fc受容体を発現する。FcRnの発現は、吸引から遠散への移行5の間に著しく低下する。マウスにおいて、パネス細胞の成熟は出生後に起こり、クリプトの形成および成熟と一致し、そしてリソソーム(Lyz)およびデフェンシン6の抗菌ペプチドの発現によって特徴付けられる。
これらの変化はすべて、吸引から遠乳への移行の一部であり、腸上皮が成熟成人状態に達したときに、生後1ヶ月から1ヶ月の年齢まで徐々に起こるプロセスである。吸引から遠性への移行は、本質的に調節され、腸管に発達的に設定されます。転写因子Bリンパ球誘発成熟タンパク質-1(Blimp-1)は、この本質的成熟プロセス7において重要な役割を果たす。Blimp-1は新生児上皮で高度に発現し、その発現は減少し、吸引から遠乳への移行中に失われるため、新生児腸上皮の信頼できるマーカーとして機能することができます。本質的なプロセスであるにもかかわらず、吸引から遠性への遷移は、外部要因によって変調することができます。例えば、コルチゾールの合成類似体は、デキサメタゾン、生体内8、9における腸の成熟を促進することが知られている。
吸引から切断への移行を含む腸の上皮成熟を研究するために使用される現在のインビトロモデルは、成人腸上皮の特徴を担う成人上皮細胞株および/または成人オルガノイドを利用する。我々は最近、後期胎児腸から単離された原発性腸上皮細胞が成熟し、オルガノイド10としてインビトロ成長した場合の吸引から離乳移行を再現することを実証した。さらに、この腸の成熟過程がインビボと同じペースで起こることを示した。最後に、デキサメタゾンを使用して、生体内研究で説明したのと同じ方法で成熟プロセスを加速しました。
ここでは、マウス後期胎児腸オルガノイドの単離および培養のための正確なプロトコルを概説する。長期にわたるオルガノイド培養のためのサンプルを収集する好ましい方法と、インビトロで吸引から遠乳への移行を監視する方法について説明する。このプロトコルは、このプロセスの腸上皮成熟および変調器のインビトロ研究に使用することができ、より高いスループット、データの品質と翻訳値の増加、および動物の使用の減少をもたらす。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12 1:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase Activity Assay Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAK112-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay Kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10741395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9803S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning B.V.</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70&#181;M</td>
			<td>BD/VWR</td>
			<td>734-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10,84,18,250</td>
			<td>EDTA Titriplex III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,00,98,31,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3625</td>
			<td>a-Lactose monohydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td>Maleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5885</td>
			<td>D-(+)-Maltose monohydrate &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning B.V.</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Acetylcystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-conditioned media</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-dianisidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>191248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>0,2 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGO-enzyme preparation</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7119-10CAP</td>
			<td>capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-hydroxymercuribenzoate sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-conditioned media</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5251</td>
			<td>D-Trehalose dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recapitulating suckling-to-weaning transition in vitro using fetal intestinal organoids

吸引期間の終わりに、多くの哺乳類種は、固形食品を消化する能力に関連する腸上皮に大きな変化を受ける。このプロセスは、吸引から遠性への移行と呼び、代謝および形態学的調整と手をつないで行く成人上皮と新生児上皮の置換をもたらす。これらの複雑な発達変化は、腸上皮細胞に内在する遺伝的プログラムの結果であるが、ある程度は外因性因子によって変調することができる。胎児期後期からのマウス原発性腸上皮細胞の長期培養は、インビトロで吸引から離離性の移行を再現する。ここでは、このプロセスをインビトロでモデル化するのに最も適したマウス胎児腸オルガノイド培養のための詳細なプロトコルについて説明する。我々は、時間の経過に伴う吸引から離れへの移行に関連する腸機能の変化を監視するために設計されたいくつかの有用なアッセイを説明する。さらに、インビトロで吸引から遠性への移行のタイミングを変調する表現として、生体内での吸引から二性移行に影響を与えることができる外因性因子の例を含む。このインビトロアプローチは、吸引から遠回しへの移行の分子機構と、このプロセスのモジュレーターを研究するために使用することができる。重要なことに、研究における動物倫理に関しては、このインビトロモデルによってin vivoモデルを置き換えることは、動物実験の精製に寄与し、場合によっては腸の成熟過程を研究するための動物の使用の減少に寄与する。

胎児腸上皮細胞の長期培養 インビトロで吸引から剥離移行を模倣するためのプロトコルは、長期培養中の胎児オルガノイドの正しい取り扱いに依存する。E18-E20マウス胎児から単離された近位腸と遠位腸は、示すように分離される(図1)。単離すると、上皮細胞は細胞外マトリックスゲルドームに播種される(図2)。胎児オルガノイドが成人状態まで成熟するには、通常4つの通路と約28〜30日間の培養が必要である。この間、成熟のさまざまな段階で細胞を採取することができます(図3)。
インビトロでの吸引から二人への移行の代表的な下流分析 単離された胎児オルガノイドが明らかに近位または遠位であることを確認するには、近位マーカーの発現量を比較する 1 つのカットドメイン ファミリー メンバー 2 (Onecut2) と GATA 結合タンパク質 4 (Gata4) と遠位マーカー脂肪酸結合タンパク質 6 (Fabp6) とグアニュレートシクラートアクティベーター 2A (Guca2a) の両方の間でインビトロでの吸引から解水への移行は、胎児(図4C)と成人マーカーの2組の遺伝子によって監視することができる(図4D)。胎児マーカーは培養の過程で徐々に減少し、成体マーカーの発現は徐々に増加するはずです(図4C,D)。
インビトロでの吸引から遠性遷移の修飾子として外因性因子を使用する このプロトコルでは、合成グルココルチコイドをデキサメタゾン、インビトロで吸引から二乳転移を改変することができる外因性因子の一例として用いた。図5の代表的なデータは、外因性因子の効果は、必ずしもゲノムであるはならないので、複数のアッセイによって決定するのが最善であることを示唆している。例えば、スクラーゼイソマルターゼの場合、RNAおよびタンパク質発現の両方がデキサメタゾン(図5A)で誘導されるのに対し、トレハ糖発現はタンパク質レベルでのみ変化する。(図 5B) 。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig01.jpg"> 図1:マウス胎児小腸の単離。(A)胃、近位および遠位小腸、付録および結腸を含む胎児腸を解剖および伸ばした写真。黒い線は、近位と遠位小腸を分割するために腸を切断する必要がある場所を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig02.jpg"> 図2:培養3日目、17日目及び28日目における近位および遠位胎児オルガノイド培養の代表的な顕微鏡画像。すべての画像は、通過後3日目に得られ、スフェロイド残業回数の減少を示す。スケールバー: 500 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig02large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>
動画1:胎児オルガノイド培養ダイナミクスを示す代表的なビデオ、4日目から6日目までの培養。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/culture_dynamics.avi" target="_blank">このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig03.jpg"> 図3:経時の腸の成熟を分析するためのオルガノイドコレクションの概略表現近位および遠位の胎児オルガノイド培養物は、1ヶ月間培養し、毎週通過する必要があります。成熟解析のサンプルは、分離後3日、各通過後3日ごとに収集する必要<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig03large.jpg" target="_blank">があります。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig04.jpg"> 図4:近位および遠位胎児オルガノイドにおける腸成熟マーカーの代表的なqRTPCR。(A)近位マーカーOnecut2およびGata4は主に近位オルガノイド培養において発現され、(B)遠位マーカーFabp6およびGuca2aは主に遠位オルガノイド培養で発現される。(C)胎児マーカーLct、Ass1、ブリンプ-1およびFcRn減少および(D)成人マーカーシス、Arg2、トレおよびLyzは、近位および遠位オルガノイド培養の両方において時間の経過とともに増加する。誤差範囲は SEM を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig04large.jpg" target="_blank">します。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig05.jpg"> 図5:外的因子デキサメタゾンは、胎児オルガノイドの成熟を調節することができる。(A)胎児マーカーBlimp-1の遺伝子発現は、対照オルガノイドと比較してデキサメタゾン処理オルガノイドにおける培養12日目に減少し、一方、成人マーカースクラーゼイソマルターゼ(シス)の遺伝子発現(B)および酵素活性(C)の両方が増加する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

このプロトコルは、30日間培養したマウス後期胎児腸オルガノイドを用いて、インビトロで吸引から離乳移行を模倣する方法を記述する。

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

このプロトコルは、インビトロで成人期に成熟を達成するのに最も適したマウス胎児腸細胞の培養を記述する。このインビトロアプローチは、吸引から乳への移行の分子メカニズムと、このプロセスのモジュレーターを研究し、実験動物のより効率的な使用を達成するために使用することができます。腸成熟のこのインビトロモデルは、胚の18日目から20日目の後期発達段階から原発性腸細胞を使用することが不可欠である。2つの小さな鉗子で、腸を伸ばす。胃と付録をガイドとして使用して、小腸の近位部と遠位部分を切り離します。付録をガイドとして使用し、コロンを切り離します。腸を縦方向に開くようにするには、かみそりの刃を腸に沿って縦に置き、カミソリの刃に沿って鉗子を滑らせて腸を引っ張ります。その後、開いた腸を1センチに切り取ります。氷冷PBSの10ミリリットルで3つの50ミリリットルチューブを準備します。小腸と結腸の近位部分と遠位部分をチューブに別々に移します。追加のマウスの腸を解剖しながら、氷の上にチューブを保ちます.同じチューブに一緒に1つのごみのすべての腸の部分を収集します。腸の部分を氷冷PBSで洗浄した後、2ミリモルEDTAで30分間インキュベートする。組織から暗号を解離するには、部分的に氷冷PBSと10%の子牛血清で片を洗浄し、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して新しいチューブにフィルターします。組織を2回洗浄し、濾過した溶液を組み合わせます。遠心分離剤は、ペレットとして納骨堂を収集するために摂氏4度で5分間Gの150倍の150倍の納骨堂を含む濾過溶液を圧縮する。15ミリリットルチューブと遠心分離機に再び納骨堂を移します。ウェルをプレートするには、必要な細胞外マトリックスゲルの総量をチューブに加え、ペレットを溶解します。溶かした納骨堂の20マイクロリットルを暖かい48ウェルプレートの各井戸に加えます。最初の井戸をめっきした後、顕微鏡の下を見て、井戸あたり約250〜300の納骨堂の密度を確認します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに10分間置き、細胞外マトリックスゲルを固化させます。次に、ENR培地を準備します。ENR培地の250マイクロリットルをゲルに各ウェルに加えます。週に3回培地を交換し、オルガノイドを週に1回通過します。1ヶ月間、各通過後3日ごとに、培養を分析する。各通過の3日後、2マイクロリットルのβメルカプトエタノールを添加したRNAリシスバッファーの200マイクロリットルをウェルに添加することによって、1つのウェルからRNAを分離する。その後、サンプルをアナーゼフリー1.5ミリリットルチューブに移します。インビトロ実験では、インビボで腸の成熟を促進することが知られている外部因子の一例としてデキサメトソゾンを用いた。タンパク質を単離するには、オルガノイドの5つの井戸に井戸あたり250マイクロリットルの氷冷細胞回収溶液を加え、それらをすべて15ミリリットルのチューブに集めます。氷上で少なくとも30分間インキュベートし、細胞外マトリックスゲルを溶解する。氷冷PBSで洗い、250マイクロリットルの細胞溶菌バッファーを加え、マイナス80度で保存します。酵素活性を分析するには、まずラクトース、スクロース、マルトース、トレハラーゼのpH 6および0.05モル溶液で0.625モルマリックバッファーを調製し、氷の上に保存します。5.56モルグルコース溶液を超純水で希釈し、5つの異なる濃度の溶液を得ることによって、アッセイ基準を調製します。次いで、96ウェルプレートに、原稿に従って標準および制御を含むそれぞれの基質を用いて8つの異なるオルガノイドリセート群を加える。摂氏37度で60分間インキュベートします。オルガノイド溶解物中に存在する酵素によって生成されるグルコースの量を決定するために、迅速に調製したPGO色溶液の200マイクロリットルを加え、37°Cで30分の間、5分ごとに450ナノメートルで分光光度計の吸光度を測定する。このプロトコルでは、近位および遠位腸をE18からE20マウス胎児に単離した。単離した後、上皮細胞を細胞外マトリックスゲルドームに播種した。約28〜30日後、胎児オルガノイドは成熟した成人状態に発達した。近位マーカーOnecut2とGata4は主に近位オルガノイド培養で発現され、遠位マーカーFabp6およびGuca2aは主に遠位オルガノイド培養で発現した。胎児マーカーラクターゼ、Ass1、Blimp-1および新生児Fc受容体は、その相対的発現および成人マーカーのスクラーゼイソマルターゼ、アルゲナーゼ2、トレハラーゼおよびリソザイムの近位および遠位オルガノイド培養物の時間の経過とともに増加した。外因因子の影響は必ずしもゲノムである必要はない。デキサメタゾン処理オルガノイドの胎児マーカーBlimp-1の遺伝子発現は、コントロールオルガノイドと比較して12日目に減少した。しかし、成人マーカーの遺伝子発現および酵素活性の両方がイソマルターゼを増強した。このプロトコルを使用する場合、後期胎児期オルガノイドのみがインビトロで成人オルガノイドに通過できることを認識することが重要です。この培養の出発点となる6~10人の胎児の数は、腸全体を使用して全体的な成熟を研究することによってさらに減らすことができる。このモデルの翻訳値は、高いグループエクストリームエフェクターが、哺乳動物の間で保存されるプロセスである腸成熟を調節することができる可能性にある。

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