Name: recapitulating suckling-to-weaning transition in vitro using fetal intestinal organoids
Uploaded: 2019-11-15T11:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids at JoVE.com

Ни один.

<ol>
	<li>Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development:+coordination+of+feeding,+digestion,+and+metabolism.">Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism.</a> American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).</li><li>Krasinski, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+intestinal+hydrolase+biosynthesis+during+postnatal+development+in+rats.">Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats.</a> American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).</li><li>Hurwitz, R., Kretchmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+arginine-synthesizing+enzymes+in+mouse+intestine.">Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine.</a> American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).</li><li>Rath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunologic+functions+of+the+neonatal+Fc+receptor+for+IgG.">The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG.</a> Journal of Clinical Immunology. 33, 9-17 (2013).</li><li>Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenetic+development+and+distribution+of+antibody+transport+and+Fc+receptor+mRNA+expression+in+rat+intestine.">Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine.</a> Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).</li><li>Bry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cell+differentiation+in+the+developing+intestine+of+normal+and+transgenic+mice.">Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).</li><li>Muncan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blimp1+regulates+the+transition+of+neonatal+to+adult+intestinal+epithelium.">Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium.</a> Nauret Communications. 2, 452 (2011).</li><li>Beaulieu, J. F., Calvert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+dexamethasone+on+the+maturation+of+fetal+mouse+intestinal+mucosa+in+organ+culture.">Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture.</a> Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).</li><li>Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+sucrase-isomaltase+gene+expression+in+rat+intestine:+responsiveness+to+glucocorticoids.">Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids.</a> American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).</li><li>Navis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fetal+intestinal+organoids:+new+model+to+study+epithelial+maturation+from+suckling+to+weaning.">Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning.</a> EMBO Reports. 20 (2), (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids.">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).</li><li>Dahlqvist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+intestinal+disaccharidases.">Assay of intestinal disaccharidases.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).</li><li>Messer, M., Dahlqvist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+ultramicro+method+for+the+assay+of+intestinal+disaccharidases.">A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases.</a> Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).</li><li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury.">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lgr5-independent+spheroid-generating+progenitors+of+the+mouse+fetal+intestinal+epithelium.">Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium.</a> Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).</li><li>Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Oligosaccharides+Influence+Intestinal+Epithelial+Cell+Maturation+In+Vitro.">Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).</li><li>Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+glucocorticoid-responsiveness+in+mouse+intestine.">Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine.</a> Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).</li><li>Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dexamethasone+on+the+development+of+rat+intestinal+brush+border+enzymes+in+organ+culture.">The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture.</a> Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).</li></ol>

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.--><html><body>Авторы ничего не разглашают.

Этот протокол описывает культивирование поздних органов кишечника плода в течение длительного времени, чтобы имитировать сосание к отлучению перехода в пробирке. Процесс созревания равен темпам in vivo и завершается через месяц в культуре. Анализ этой культуры ниже по течению подробно описан.
В этом протоколе используются первичные клетки кишечника из эмбрионов мыши E18-E20. Особенно важна стадия развития первичных клеток мыши, используемых для генерации органоидов для этого протокола. Использование более ранней стадии развития приведет к генерации кишечных сфероидов, которые поддерживают их специфическую экспрессию генов плода в течение длительного периода времени с ограниченным переходом к взрослым органоидам15,16. Только поздние сфероиды стадии плода способны в переходе к взрослым органоидам в пробирке10. Для максимального использования возможностей в отношении воздействия экстримовых факторов на созревание кишечника рекомендуется кишечник с поздней стадии плода, а не кишечник а у рожденных щенков, подвергшихся воздействию микробов и материнского молока. Сообщается, что некоторые бактериальные метаболиты и молочные компоненты могут выступать в качестве модификаторов процесса созревания17.
Для получения достаточного количества клеток для поддержания культуры в течение одного месяца для изучения всего созревания от рождения до взрослой жизни, при сборе образцов для анализа вниз по течению, кишечник из 6-8 эмбрионов должны быть использованы в качестве исходного материала. Предпочтительно использовать эмбрионы из той же стадии развития для генерации культуры. Мы не рекомендуем объединять различные пометы, так как небольшие различия в стадии развития могут влиять на экспрессию генов созревания.
Описанный здесь протокол предусматривает органоидное поколение из проксимального и дистального тонкого кишечника для поддержания особенностей развития различных сегментов кишечника. В качестве альтернативы, весь кишечник может быть использован для исследования общего созревания в отношении увеличения / уменьшения экспрессии конкретных маркеров. В последнем случае меньшеэмбрионов может быть использовано для изоляции клеток кишечника для начала культуры.
Этот протокол разработан с использованием трехмерных органоидных культур. Поскольку органоиды проходят динамический рост в культуре, важно собирать образцы для анализа ниже по течению в то же время после прохождения. В этом протоколе, мы выбрали день 3 после прохождения, так как он представляет собой среднее время между двумя расколами, на которых органоиды содержат надежные почки и практически не клеточной смерти. Альтернативная точка времени после прохождения может быть использована, но она должна быть последовательной в течение всего эксперимента. Мы не рекомендуем выращивать органоиды более 7 дней после прохождения, так как увеличение клеток смерти в органоидном просвете может повлиять на результаты.
В наших экспериментах мы использовали дексаметазон в качестве примера восхводного фактора, который показан и лучше всего изучается в литературе для ускорения созревания кишечника в vivo9,18. Дексаметазон оказывает действие как по геномным, так и по негеномическим маршрутам. Например, на уровне геномного регулирования можно наблюдать преждевременное повышение уровня sis mRNA. На негеномическом уровне мы наблюдаем изменения в активности пищеварительных ферментов, таких как трехалаза. Оба находятся в соответствии с описанными специфическими аспектами дексаметазона на активации генов sucrase и негеномического активирования влияние на кишечные ферменты кисти границы наблюдается in vivo19. Тот факт, что экстримальные факторы, такие как синтетические глюкокортикоиды, могут модулировать некоторые аспекты сосание к отлучению перехода в органоидной культуре, подобно описанному в vivo, еще больше устанавливает органоиды кишечного плода в качестве модели для исследования различных видов модуляторов созревания кишечника.
Несмотря на то, что морфологическое созревание эпителия кишечника человека завершается внутриутробно на стадии гестационного заболевания 22 недель, функция кишечного барьера созревает до детства в тесной связи с типом кормления, развитием микробиоты и иммунный ответ. Из-за ограниченной доступности тканей человека на этих стадиях развития, переводное значение модели in vitro murine заключается в возможности высокой пропускной способности экранов факторов, способных модулировать созревание кишечника, процесс, сохраненный среди сосание млекопитающих.
Важно отметить, что в отношении этики животных в исследованиях, эта модель может способствовать уточнению экспериментов на животных, поскольку она не включает в себя вмешательства, выполняемые на животных. Количество животных может быть дополнительно сокращено путем реорганизации научно-исследовательских вопросов в один или два временных точек культуры, которые позволят тестирование нескольких компонентов в рамках одной культуры.

У многих видов млекопитающих, втом есть мыши и мужчины, неонатальный кишечник имеет несколько особенностей, которые отличаются от полностью зрелого эпителия кишечника. Эти функции облегчают неонатальный энтероцитов для переваривания и поглощения молока, которое содержит высокие жиры и низкие углеводы, с лактозой в качестве основного углевода. Кисть границы неонатальных кишечных эпителиальных клеток выразить disaccharidase лактазы-флоризина гидролазы (Lct)1 переварить молоко дисахарида лактозы. После периода сосания, энтероциты адаптироваться к переваривания твердой пищи, которая богата сложными углеводами и низким содержанием жира. Это проявляется переключатель в кисти границы disaccharidase выражение от лактазасы к sucrase-изомальтазы (Sis) и trehalase (Treh), который может переварить более сложные углеводы, присутствующие в твердой пищи2. Другой метаболический переключатель связан с низкой концентрацией аргинина в молоке. Чтобы обеспечить потребность в аргинине, неонатальные энтероциты выражают скорость ограничения фермента в биосинтезе аргинина, аргиносуцинат синтаза-1 (Ass1), синтезировать аргинин3. В отличие от взрослых энтероцитов экспресс аргиназы 2 (Arg2), фермент, способный катаболизации аргинин, который в изобилии в твердой пищи. Кроме того, неонатальный кишечный эпителий выражает неонатальный рецептор FC для иммуноглобулинов (FcRn), который опосредует поглощение материнской IgG из молока в циркуляцию/ кровоток4. Выражение FcRn значительно снижается во время сосание к отлучению перехода5. У мышей созревание клеток Панета происходит послеродово, совпав с образованием и созреванием склепов, и характеризуется экспрессией антимикробных пептидов лизосомы (Лиз) и дефенсинов6.
Все эти изменения являются частью сосание к отлучению перехода, процесс, происходящий постепенно после рождения до одного месяца возраста у мышей, когда кишечный эпителий достигает своего зрелого взрослого состояния. Сосание к отлучению перехода внутренне регулируется и развития установить в кишечнике трубки. Транскрипционный фактор B лимфоцитов индуцированной созревания белка-1 (Blimp-1) играет ключевую роль в этом процессе внутренней созревания7. Blimp-1 высоко выражен в неонатальном эпителии, в то время как его экспрессия уменьшается и теряется во время сосание к отлучению перехода и, следовательно, может служить надежным маркером неонатального кишечного эпителия. Несмотря на то, что внутренний процесс, сосание к отлучению перехода может быть модулировано внешними факторами. Например, синтетический аналог кортизола, дексаметазон, как известно, ускорить созревание кишечника в vivo8,9.
Текущие модели in vitro, используемые для изучения кишечного эпителиального созревания, включая переход от отлучение от отлучение, используют взрослые эпителиальные клеточные линии и/или взрослые органоиды, которые несут характеристики эпителия кишечника у взрослых. Недавно мы показали, что первичные кишечные эпителиальные клетки, изолированные от позднего кишечника плода созрели и резюмировать сосание к отлучению перехода при выращивании в пробирке, как органоиды10. Мы также показали, что этот процесс созревания кишечника в пробирке происходит в том же темпе, что и in vivo. Наконец, мы использовали дексаметазон для ускорения процесса созревания таким же образом, описанным для исследований in vivo.
Здесь мы наметили точный протокол для изоляции и культуры мыши поздних кишечных органоидов плода. Мы описываем предпочтительный способ сбора образцов для длительной органоидной культуры и методы для мониторинга сосание к отлучению перехода в пробирке. Этот протокол может быть использован для исследования in vitro кишечного эпителиального созревания и модуляторов этого процесса и приводит к более высокой пропускной способностью, повышению качества и трансляционной ценности данных и сокращению использования животных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12 1:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase Activity Assay Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAK112-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay Kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10741395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9803S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning B.V.</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70&#181;M</td>
			<td>BD/VWR</td>
			<td>734-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10,84,18,250</td>
			<td>EDTA Titriplex III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,00,98,31,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3625</td>
			<td>a-Lactose monohydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td>Maleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5885</td>
			<td>D-(+)-Maltose monohydrate &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning B.V.</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Acetylcystein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-conditioned media</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>o-dianisidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>191248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>0,2 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGO-enzyme preparation</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7119-10CAP</td>
			<td>capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-hydroxymercuribenzoate sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-conditioned media</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5251</td>
			<td>D-Trehalose dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recapitulating suckling-to-weaning transition in vitro using fetal intestinal organoids

В конце периода сосания, многие виды млекопитающих претерпевают значительные изменения в кишечном эпителии, которые связаны с возможностью переваривать твердую пищу. Этот процесс называется сосание к отлучению перехода и приводит к замене неонатального эпителия с эпителием для взрослых, который идет рука об руку с метаболическими и морфологическими корректировками. Эти сложные изменения в развитии являются результатом генетической программы, которая присуща кишечным эпителиальным клеткам, но может, в некоторой степени, быть модулирована нависшие стороны. Длительная культура мыши первичных кишечных эпителиальных клеток от позднего периода плода, резюмирует сосание к отлучению перехода в пробирке. Здесь мы описываем подробный протокол для мыши плода кишечной органоидной культуры лучше всего подходит для моделирования этого процесса в пробирке. Мы описываем несколько полезных анализов, предназначенных для мониторинга изменения функций кишечника, связанных с сосанием к отлучению перехода с течением времени. Кроме того, мы включаем пример экстримового фактора, который способен влиять на сосание к отлучению перехода in vivo, как представление модулирования сроков сосания к отлучению перехода в пробирке. Этот подход in vitro может быть использован для изучения молекулярных механизмов перехода от отлучения от лёгких, а также модуляторов этого процесса. Важно отметить, что в отношении животных этики в исследованиях, замена in vivo моделей этой модели in vitro способствует уточнению экспериментов на животных и, возможно, сокращению использования животных для изучения процессов созревания кишечника.

Длительная культура эпителиальных клеток кишечника плода Протокол для имитации сосание к отлучению перехода в пробирке зависит от правильного обращения с фетальными органоидами во время длительной культуры. Проксимальный и дистальный кишечник, изолированные от плодов мыши E18-E20, разделены, как представлено в(Рисунок 1). После изоляции эпителиальные клетки посеяны в внеклеточных куполах матричного геля(рисунок 2). Это обычно занимает четыре прохода и примерно 28-30 дней культуры для фетальных органоидов созреть до взрослого состояния. За это время можно собирать клетки на различных стадиях созревания(рисунок 3).
Представитель вниз по течению анализ сосание к отлучению перехода в пробирке Чтобы подтвердить, что изолированные органоиды плода отчетливо проксимальны или дистальные, сравните уровень экспрессии проксимальных маркеров One cut domain family member 2 (Onecut2) и GATA связывающий белок 4 (Gata4) и дистальные маркеры жирных кислот связывающих белков 6 (Fabp6) и Guanylate Циклазы Органатор 2A (Guca2a) между обеими proxioid. Сосание к отлучению перехода in vitro можно контролировать двумя наборами генов: плода(рисунок 4C)и взрослых маркеров(рисунок 4D). Фетальные маркеры должны постепенно уменьшаться в течение культуры, в то время как выражение маркеров для взрослых должно постепенно увеличиваться(рисунок 4C,D).
Использование экстримового фактора в качестве модификатора сосание к отлучению перехода in vitro В этом протоколе дексаметазон синтетический глюкокортикоид, был использован в качестве примера экстримового фактора, способного изменять сосание к отлучению перехода в пробирке. Репрезентативные данные на рисунке 5 свидетельствуют о том, что воздействие находинных факторов лучше всего определять несколькими анализами, поскольку они не обязательно должны быть геномными. Например, в случае сукрас-изомальтезе и РНК, и выражение белка индуцируются с дексаметазоном(рисунок 5А),в то время как экспрессия тремалаза изменяется только на уровне белка. (Рисунок 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig01.jpg"> Рисунок 1: Изоляция мыши плода тонкой кишки. (A) Фотография расчлененной и растянутой кишки плода, в ключая желудок, проксимальный и дистальный тонкий кишечник, аппендикс и толстая кишка. Черная линия указывает, где кишечник должен быть сокращен, чтобы разделить проксимальной и дистальной тонкой кишки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig02.jpg"> Рисунок 2: Представитель микроскопические изображения проксимальной и дистальной культуры органоидов плода на 3-й день, день 17 и день 28 культуры. Все изображения были получены на 3-й день после прохождения и показывают уменьшение количества сфероидов сверхурочно. Шкала бар: 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Фильм 1: Представитель видео, показывающее динамику культуры органоидов плода, с 4-го по 6-й день культуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/culture_dynamics.avi" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig03.jpg"> Рисунок 3: Схематическое представление органоидной коллекции для анализа созревания кишечника с течением времени. Проксимальные и дистальные органоидные культуры плода должны культивируется в течение одного месяца и проходить каждую неделю. Образцы для анализа созревания должны быть собраны через 3 дня после <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig03large.jpg" target="_blank">изоляции</a> и каждые 3 дня после каждого прохода.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig04.jpg"> Рисунок 4: Представитель qRTPCRs маркеров созревания кишечника в проксимальных и дистальных органоидов плода. (A) Проксимальные маркеры Onecut2 и Gata4 в основном выражаются в проксимальной органоидной культуре, в то время как (B)дистальные маркеры Fabp6 и Guca2a в основном выражены в дистальной органоидной культуре. (C) Фетальные маркеры Lct, Ass1, Blimp-1 и FcRn снижение и (D) взрослых маркеров Sis, Arg2, Treh и Lyz увеличение с течением времени в проксимальной и дистальной органоидных культур. Бары ошибок представляют SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig05.jpg"> Рисунок 5: Внешний фактор дексаметазон может модулировать созревание органоидов плода. ( A ) Выражение гена фетального маркера Blimp-1 уменьшается на 12 день культуры в дексаметазон лечение органоидов по сравнению с контрольными органоидами, в то время как экспрессиягенов(B) и ферментной активности (C) взрослых маркер sucrase-isomaltase (Sis) увеличивается. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids at JoVE.com

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Этот протокол описывает, как имитировать сосание к отлучению перехода в пробирке с помощью мыши позднего плода кишечных органоидов культивируется в течение 30 дней.

Повторяя сосание к отнятию Переход в пробирке с использованием плода кишечных органоидов

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Этот протокол описывает культуру мыши плода кишечных клеток, что лучше всего подходит для достижения созревания для взрослых этапе in vitro. Этот подход in vitro может быть использован для изучения молекулярных механизмов перехода от сосания к отею, а также модуляторов этого процесса и для достижения более эффективного использования экспериментальных животных. Это важно для этой модели in vitro созревания кишечника использовать первичные кишечные клетки с поздней стадии развития, между эмбриональным днем 18 и 20.С двумя мелкими типсами, растянуть кишечник. Используя желудок и аппендикс в качестве направляющих, разрежьте проксимальные и дистальные части тонкой кишки. Используя аппендикс в качестве руководства, разрежьте толстую кишку на части.Чтобы сделать кишечник открытым продольно, поместите лезвие бритвы вдоль кишечника и потяните кишечник, скользя миппы вдоль лезвия бритвы. Впоследствии разрежьте открытый кишечник на одну сантиметровую кусочки. Подготовь три 50-миллилитровые трубки с десятью миллилитров ледяного PBS.Передача проксимальных и дистальных частей тонкой кишки и толстой кишки отдельно в трубы. Держите трубки на льду во время вскрытия кишечника дополнительных мышей. Соберите все кишечные части одного помета вместе в одной трубке.После мытья кишечных частей с ледяной PBS, инкубировать с двумя миллимолярд EDTA в течение 30 минут. Чтобы отмежевать склепы от ткани, частично мыть кусочки с ледяной PBS и десять процентов икроножной сыворотки и фильтр через 70 микрон клеток ситечко в новую трубку. Повторите мытье ткани еще два раза и объединить фильтрованный раствор.Центрифуга фильтрованного раствора, содержащего склепы при 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы собрать склепы в качестве гранулы. Перенесите склепы в 15 миллилитровую трубку и центрифугу снова. Чтобы пластины скважин, добавить общее количество внеклеточного матричного геля, необходимого в трубку и растворить гранулы.Добавьте 20 микролитров растворенных склепов в каждую колодец теплой пластины из 48 колодец. После покрытия первой колодец, посмотрите под микроскопом, чтобы подтвердить плотность около 250 до 300 склепов на колодец. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение десяти минут, чтобы внеклеточный матричный гель затвердеть.Затем подготовьтесь к enR-среде. Добавьте 250 микролитров среды ENR в каждый колодец на гель. Изменение среды три раза в неделю и прохождение органоидов один раз в неделю.В течение одного месяца, каждые три дня после каждого отрывка, анализировать культуру. Через три дня после каждого прохода изолируйте РНК из одной хорошо, добавив 200 микролитров буфера РНК-лиза, дополненного двумя микролитров бета меркаптоэтанола в колодец. Затем перенесите образец из колодец в RNAse-бесплатную 1,5 миллилитровую трубку.В наших экспериментах in vitro мы использовали дексаметзон в качестве примера внешнего фактора, который, как известно, ускоряет созревание кишечника in vivo. Чтобы изолировать белок, добавьте 250 микролитров раствора восстановления холодных клеток на скважину в пять колодцев органоидов и соберите их все в 15 миллилитровую трубку. Инкубировать в течение по крайней мере 30 минут на льду, чтобы растворить внеклеточный матричный гель.Вымойте ледяным PBS, добавьте 250 микролитров буфера клеточного лиза и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для анализа активности ферментов сначала приготовьте 0,625 молярного мужского буфера при рН 6 и 0,05 молярных растворов лактозы, сахарозы, мальтозы и трегалазы и храните их на льду. Подготовка стандартов анализа путем разбавления 5,56 раствора молярной глюкозы с ультра-чистой водой для получения растворов с 5 различными концентрациями.Затем, в пластину из 96 колодец, добавьте восемь различных групп органоидных лизатов с их соответствующими субстратами, включая стандарты и контроль в соответствии с рукописью. Инкубировать в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию. Чтобы определить количество глюкозы, вырабатываемой ферментами, присутствующими в органоидном лизате, быстро добавьте 200 микролитров свежеприготовленного цветового раствора PGO и измерьте абсорбции на спектрофотометре на 450 нанометров каждые пять минут в течение тридцати минут при 37 градусах Цельсия.В этом протоколе проксимальные и дистальные кишечники были изолированы от E18 до E20 плода мыши. После изоляции эпителиальные клетки были посеяны во внеклеточных матричных куполах геля. Примерно через 28-30 дней культуры органоиды плода развились до зрелого взрослого состояния.Проксимальные маркеры Onecut2 и Gata4 были в основном выражены в проксимальной органоидной культуре, в то время как дистальные маркеры Fabp6 и Guca2a были в основном выражены в дистальной органоидной культуре. Фетальные маркеры лактазы, Ass1, Blimp-1 и неонатального рецептора Fc уменьшились в их относительной экспрессии и взрослых маркеров sucrase isomaltase, argenase 2, трегалазы и лизозима увеличилось с течением времени как в проксимальной и дистальной органоидной культуры. Последствия внешних факторов не обязательно должны быть геномными.Экспрессия гена фетального маркера Blimp-1 была уменьшена на 12-й день для органовоидов, обработанных дексаметазоном, по сравнению с контрольными органоидами. Однако, как экспрессия генов, так и активность ферментов взрослых маркеров sucrase isomaltase были увеличены. При использовании этого протокола, важно понимать, что только поздней стадии плода органоиды способны транзита взрослых органоидов в пробирке.Число от шести до десяти плодов в качестве отправной точки этой культуры может быть дополнительно уменьшено с помощью всего кишечника для изучения общего созревания. Переводная ценность этой модели заключается в возможности высокогрупповой экстремум-эффекторов, способных модулировать созревание кишечника, которое является процессом, сохраненным между сосание млекопитающих.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Иммуно люминесцентные маркировки микротрубочек и Centrosomal белков в Ex Vivo кишечных тканей и 3D в Vitro кишечных Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Внутривенно и интраамниальной In Utero трансплантации мышиных модели

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Высокочастотный ультразвук для анализа развития плода и плаценты в естественных условиях

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Культивирование и измерение фетального и новорожденного Мурина длинные кости

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Трехмерная система ассеаа ассеа ангиогенеза с использованием сокультурных сфероидов, сформированных эндотелиальными колоний формирования клеток и мезенхимальных стволовых клеток

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...