Name: optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

作者感谢马修·凯博士的有益实验指导，以及马内尔·拉马丹和穆海明·乔杜里为技术援助。这项工作得到了国家卫生研究院（R01HL139472至NGP、R01 HL139712至NI）、儿童研究所、国家儿童心脏研究所和谢赫扎耶德儿科外科创新研究所的支持。

所有实验均按照《国家卫生研究院关于护理和使用实验室动物的指南》（第八版）进行。根据NIH发布的《实验室动物护理和使用指南》，这些研究中使用的所有方法和协议均获得国家儿童医院机构动物护理和使用协议委员会的批准。本研究中使用的所有动物均根据《实验室动物护理和使用指南》接受人道护理。
1. 准备
<ol><li>准备 6 L 的改性克雷布斯-亨塞利特溶液16 （mM： 118.0 纳Cl， 3.3 KCl， 1.2 MgSO4， 24.0 NaHCO3， 1.2 KH2PO4， 10.0 葡萄糖， 2.0 丙酸钠， 2% 白蛋白， 2.0 CaCl2.在实验当天添加CaCl2，因为随着时间的推移，在磷酸盐的存在下，氯化钙会以磷酸钙的形式从溶液中最终沉淀出来。</li>
	<li>无菌过滤后将 pH 值调整到 7.4（孔径：0.22 μm）。检查溶液渗透性，确保范围为 275~310 mOsm/kg。在心脏被切除后立即在冰上冷却1L。将 3 L 在水浴中加热至约 37°C，然后与卡博根（95% O2，5% CO2） 起泡。 注：由于冷液体具有更强的气体溶解能力，因此加热可最大限度地减少气泡和潜在的栓塞;因此，当经过改造的Krebs-Henseleit介质通过灌注系统并加热时，气体将作为气泡释放。</li>
	<li>准备2 L的心痛（修改的德尔尼多心痛溶液，表1）。在冰块托盘中冷冻足够的心痛，以填充 500 mL 烧杯。</li>
	<li>打开设置为 42 °C 的循环水浴。打开泵，在封闭的水力加热回路中循环渗透液（有关材料的完整列表，请参见材料表和图 1）。 注：加热循环水浴用于加热水套管和换热器。</li>
	<li>通过系统在水中运行 2 L 的 1% 通用洗涤剂溶液，清洁管道回路和腔室。用 >4 L 的纯净水冲洗兰根多夫系统的所有管路和腔室。运行泵，直到从系统中清除所有水。</li>
	<li>加入与灌注泵一致的综合膜过滤器（聚丙烯过滤器，孔径 >5 μm）。气体是一种超细纤维氧化器（溶油器），在 80 kPa 时具有 95% O2和 5% CO2。 注：使用白蛋白时，经常有与氧合和/或通过管道回路的泵送活动相关的泡沫。防泡化合物（消泡Y30乳液）可定期滴滴添加（每30分钟一次），以淬火。</li>
	<li>检查位于主塔上方或气泡陷阱中的压力传感器的两点校准（0 和 60 mmHg）;根据需要进行校准。</li>
	<li>紧接心脏切除之前，将介质倒入兰根多夫循环灌注系统。确保渗透通过微纤维氧化器（带氧的渗透剂），然后通过热交换器流动，以保持主塔的介质渗透温度为 37°C。</li>
	<li>将循环水浴设置为高于 37°C（如 42°C）的几个度，以考虑交流期间和整个系统的热损失。使用热电偶监控循环渗透温度。</li>
</ol>2. 心脏切除和朗根多夫灌注
<ol><li>用肌内（I.M.）注射氯胺酮（20毫克/千克）和木拉津（2毫克/千克）和插管内切管。对于诱导，进行静脉注射（I.V.）苯胺基（50微克/千克）和龙酮（1毫克/千克）。用吸入的硫兰（0.5⁄3%）、芬太尼（10~25微克/千克）和泛化（1毫克/千克）维持麻醉。 注：在这项原理证明研究中，使用约克郡的幼猪（14⁄42天，n = 18），体重在2.5~10.5公斤和18~137克心脏重量（图2）。如果需要额外的诱导注射，氯胺酮（10毫克/千克）可以注射I.M.</li>
	<li>一旦动物完全麻醉和无反应，进行绝育手术，以暴露上升主主和右中庭。
	<ol>
<li>使用手术刀，从胸腔入口的胸腔顶部进行中线切口，一端至胸腔过程。用烧灼（或剪刀），解剖潜在的脂肪和肌肉，直到胸骨可见。</li>
		<li>从西风处理，切割胸骨中线通过胸腔使用手术骨剪刀或骨锯。将缩回器插入切口以暴露心脏。</li>
	</ol></li>
	<li>使用18G针头和注射器，将血泡剂量的肝素（300U/kg）输送到右侧的胸腺，以尽量减少器官切除时的血块。将吸水垫放在胸腔和心脏周围冰中。</li>
	<li>用剪刀，仔细切开心周六，从周围的结缔组织钝切除主动脉，并夹住主动脉正心正心正动脉正心。使用带 18 G 针头的 50 mL 注射器，通过上升主塔顶部注射冰冷的心痛（20 mL/kg）。</li>
	<li>切开通向心脏的血管，在上升主道完好无损地切除心脏，将切除的心脏放入冰冷的心痛中。</li>
	<li>用一对止痛抓住主塔的墙壁，并将其滑到连接到管子上的带肋管上，导致1 L的冰冷心痛介质悬浮在心脏上方（+95 厘米，提供±70 mm Hg）。允许液体进入并填充主塔，直到其溢出，以防止任何气泡进入血管。 注：使用机械无耦合器（2，3-丁二酮单体 [BDM] 或白细胞丁）将降低冠状灌注率，因为组织的氧气需求下降。</li>
	<li>使用脐带将主盘固定到管上，并通过绑住止欲来承受心脏的重量，从而进一步将其固定（图1C）。允许冷介质逆行，通过重力在70 mmHg的恒定压力下将心脏注入。保持心脏淹没在冷心痛，直到准备转移到加热（37°C）兰根多夫灌注系统（<10分钟）。 注：小心脏的主塔（<50 g，长达2周大的猪）将承受心脏的重量，但较大的心脏有滑出管状的风险。在初始气罐期间和移动到加热系统时，防止空气进入主动脉，这可能导致冠状动脉。使用大孔管（>3/8"内径），使气泡上升的速度比进入主塔的溶液快。</li>
	<li>将心脏转移到兰根多夫系统（37°C），而不会将空气引入导管。允许正常的正心律冲洗任何剩余血液和心痛的血管。 注：在所述研究中，在孤立的幼猪心脏中观察到平均初始流速为184~17 mL/min。在与含有机械非耦合器（20 mM BDM）的加热介质注入后，流速降至70~7.5 mL/min（均值 = SEM）。不要淹没心脏组织，因为它会影响心脏成像。与啮齿动物相比，猪心脏的冠状流动保持组织温度，因为其体积较大，表面积更小。在全流量下，心内膜温度分别为35°C至37°C。 警告：使用机械不耦合器时，请佩戴适当的个人防护设备，包括眼部磨损。心脏可以迅速和意外地弹出媒体。</li>
	<li>在可休克性心律失常（心室心动过速、心室颤动）的情况下，通过在心脏的顶点和底部放置外部桨，并在 5 J 下提供单个冲击，以 5 J 增量增加（或由除颤器），直到50J，心电位，或不可震撼的节奏。必要时在 50 J 处重复冲击。 注：在所提出的研究中，89%的制剂需要除颤。平衡后（±10分钟），对幼猪心脏观察到平均心率为70~4.5 bpm（均值 = SEM）（图2）。</li>
	<li>用至少1L的改性克雷布斯-亨塞利特培养剂冲洗心脏，无需再循环，以去除任何残留的血液和心痛。一旦媒体在心脏中透明运行，关闭循环循环以循环渗透。</li>
</ol>3. 电生理学研究
<ol><li>要在整个研究过程中记录标准铅 II 心电图 （ECG），请将 29 G 针电极连接到顶点附近的心室心室，在右心房安装另一个电极。将差分生物放大器的正负输入分别连接到顶点和右心房。</li>
	<li>将一个双极刺激电极连接到右侧耳塞，将第二个双极刺激电极连接到左侧心室，用于起搏。</li>
	<li>使用电生理学刺激器心脏步调，初始电流设置为舒张阈值（1⁄2 mA）的两倍和1 ms脉冲宽度35，36。 注：如果刺激未能引起反应，脉冲宽度可增加到 2 ms。</li>
	<li>通过在定义的起搏周期长度 （PCL） 下应用一系列刺激脉冲（1⁄2 mA，1 ms 脉冲宽度）来确定起搏阈值，以确保一致的刺激响应。 注：一旦建立了内在速率，初始脉冲列车可能以稍短的PCL开始。</li>
	<li>
使用 S1+S1 或 S1+S2 起搏列车执行额外刺激步调，在后者中，6⁄8 脉冲 （S1） 的列车后跟单个脉冲 （S2）。将 S2 PCL 逐步减少 10 毫秒（即 200 毫秒、190 毫秒、180 毫秒等），直到无法捕获。升到倒数第二个PCL（即190毫秒），减少1毫秒的间隔，在捕获损失（即184毫秒）之前找到最精确的PCL。 注： S1 和 S2（1⁄2 mA，1 ms 脉冲宽度）使用相同的刺激参数。参见图3，了解具有代表性的示例，或以前发布的关于猪心脏电生理学测量值37。<ol>
<li>要确定心室有效耐火期 （VERP），请使用左侧心室上的刺激电极确定 S2（过早跳动）启动心室脱极的最短 S1_S2 间隔。 注：耐火期是可实现的最短 S1_S2 耦合间隔。</li>
		<li>要定义 Wenckebach 循环长度 （WBCL），请使用右中庭上的刺激电极查找最短的 S1_S1 间隔，其中 1：1 眼向传导通过正常传导路径传播。 注：未能做到这一点代表第2度心脏块。</li>
		<li>要定义正心节点恢复时间 （SNRT），请使用右中庭上的刺激电极应用起搏列车 （S1_S1），并测量起搏列车中最后一次脉冲与自发中庭节点介导活动的恢复之间的时间延迟。</li>
		<li>要建立三角结节有效耐火期 （AVNERP），请使用右中庭上的刺激电极找到最短的 S1_S2 耦合间隔，在该间隔内，过早心房刺激后跟一个引起 QRS 的捆绑电位复杂，表示心室去极化。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 跨膜电压和细胞内钙的光学映射
注：在光学映射期间，应使用机械不耦合器来尽量减少运动伪影，并避免缺氧3、38、39、40。(-/-)在5 mL的渗透剂（最终浓度的100倍）41中，可缓慢添加5μM循环浓度的博柳剂量0.5 mM。或者，BDM最初可能包含在渗透介质中，循环浓度为20 mM。
<ol><li>通过将 5 mg RH237 溶解成 4 mL 无水 DMSO 来制备电压染料。用高达 5 mL 的介质和涡流稀释染料等分。缓慢地将RH237（每500 mL的渗透剂62.1μg）添加到主动脉管中。 注：如果需要，心肌组织可以重新染色RH237，在整个实验过程中。</li>
	<li>通过将 1 毫克 Rhod2-AM 溶解成 1 mL 无水 DMSO 来制备钙染料。将染料与 50 μL 的普鲁辛酸混合，放入 37°C 的声波浴中长达 10 分钟，然后用高达 5 mL 的介质稀释。缓慢地将钙染料（每500 mL的渗透剂50μg）添加到主动脉管中。 注：为确保染料染色均匀，应缓慢添加染料（>30 s）。Rhod-2AM 需要 10 分钟才能达到荧光峰值，而 RH237 在 1⁄2 分钟内使心脏染色。 使用所述染料负载，电压和钙的信号噪声比 （SNR） 范围分别为 ±42+86 和 ±35+69。SNR 值可以计算为 SNR = （峰值到峰值计数）/（舒张间隔期间的标准偏差）42。</li>
	<li>如图所示，放置成像硬件（摄像机、图像分割器、镜头），以聚焦于适当的视野。 注：分光器配置有二色镜（660+nm），通过RH237并反映Rhod2发射光谱。高透射发射滤波器用于 RH237（710 nm 长通）和 Rhod2 （585 × 40 nm） 发射的光（长通 ET710，参见材料表）。宽孔 50 mm/F0.95l 镜头连接到图像分割器的前部。此配置导致足够的发射光分离，如先前验证的 43，44。</li>
	<li>将相机连接到工作站并使用选定的软件获取图像，曝光时间为 0.5⁄2 ms。此外，突出显示不对齐（请参阅软件选项的材料表）。</li>
	<li>关闭房间灯，以尽量减少环境照明对荧光的干扰。在开始成像之前测试 LED 灯 （525 nm，1.4 mW/mm2），以确保由传感器井深度决定的均匀和最大表观照明。 注：每个光线都通过激励过滤器（535 × 25 nm）定向。LED 灯可在拍摄前手动触发，以最大化信号线性度。从显微体发出的荧光通过图像分路器和发射滤波器。分割图像投影到高速传感器上。的视野范围约为 12 厘米 x 10 厘米，或每个分割图像的视角为 5.9 厘米 x 4.7 厘米，具体取决于镜头选择和与心脏的距离。</li>
	<li>对于光学映射研究，通过位于左心室的刺激电极（图5）在窦节、心室颤动（图4）或动态起搏（S1+S1，1⁄2 mA，1 ms脉冲宽度）期间对心肌进行成像。从起搏周期长度 350 ms 开始，递减 10–50 毫秒以生成恢复曲线 （图 5E）35，36。</li>
</ol>5. 清理
<ol><li>从系统中取出心脏，并排出所有渗透。用纯净水冲洗系统管和腔室。</li>
	<li>对于日常维护，根据需要定期使用洗涤剂溶液或稀释过氧化氢溶液冲洗系统。</li>
</ol>6. 数据处理
<ol><li>通过打开视频文件、选择感兴趣的区域以及使用适当的软件包或自定义算法绘制随时间而平均荧光，确认整个研究的光信号质量。</li>
	<li>
分析成像数据，如前面描述的23，33，43，45，46，以量化作用电位和钙瞬态参数，包括激活时间，电压-钙耦合时间（Vm 和 Ca 激活时间之间的差异）和再极化持续时间测量。
	<ol>
<li>应用阈值来隔离荧光表观像素并丢弃嘈杂的背景数据。 注：阈值将简化和加快跨大型视频的分析。</li>
		<li>空间过滤光信号在表观表面积与内核大小范围从3毫米x3毫米到5毫米x5毫米，如图4和图5所示。 注：后者将改善SNR而不扭曲作用的潜在特征，钙瞬态形态，或波前的整体轮廓19，47。如果使用具有较大像素的传感器或在采集过程中装箱，则可能没有必要这样做。</li>
		<li>使用数字低通滤波器（例如，第五阶巴特沃斯）对信号进行临时过滤，截止频率在100至75赫兹之间，以消除微不足道的信号含量45。 注：有关代表性处理跟踪的示例，请参阅图 5C。</li>
		<li>通过 Nth-阶多项式拟合应用漂移去除和减法，以尽量减少光漂白、运动或其他重要变异源的影响。</li>
		<li>处理整个视频的光学数据并规范化后，计算感兴趣的作用电位和钙瞬态参数。确定激活时间（定义为去极化期间最大导数的时间）和峰值荧光，以便计算重极化百分比时间和周期（操作电位持续时间 [APD] 和 [Ca2][i 持续时间 [CaD]，请参见图 5.</li>
		<li>计算时态参数后，生成等时图，使用自定义算法23、33来描绘整个影像表表面的单一动作电位或钙瞬态的各个方面。43，45，46. 注：有关示例，请参阅图 5D。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

虽然心血管研究模型从细胞制剂到体内制剂，但临床相关性和实验效用之间有着内在的权衡。在这个光谱上，孤立的兰根多夫心脏仍然是研究心脏生理学的有益折衷方案。与单细胞或组织单层相比，整个心脏模型代表了更高的功能和结构整合水平，但也避免了与体内模型相关的混淆复杂性。在双光学映射实验中，一个主要优点是可以观察到分离心脏的表观表面，并且可以利用跨膜电位和钙处理的荧光成像来监测心脏生理学34。
与大型动物相比，啮齿类模型最常用于隔离心脏制剂，部分原因在于所有相关元件的放大相关成本（例如，溶液体积、灌注回路、染料数量和机械不耦合器）伴随着更大的动物10、36、49的更大不稳定性和心律失常倾向。使用猪心脏的一个优点是，它们在结构、大小和收缩速率上与人的心脏非常相似，因此可以更准确地模拟冠状血流和心脏输出等血液动力学参数。同样，人类和猪有类似的钙处理，心电图间隔37，和行动潜力形态，包括它代表12，50，51的基础通道， 52.该协议详细介绍了创建可重现的大型动物模型以全面描述心肌功能的步骤。与已建立的电生理协议结合使用的同膜电压 （RH237） 和细胞内钙 （Rhod2） 的同步成像，为查明导致心脏改变的机制提供了机会功能。所述方法可用于临床前安全测试、毒理学筛查和遗传或其他疾病病理学调查。此外，根据具体的研究重点53、54、55，所述方法可以修改和调整，以便与其他心脏模型（如，人）一起使用。
从较小的啮齿动物模型过渡到更大的猪模型，用于隔离的整心准备时，需要牢记一些关键的修改。在准备和设置过程中，我们建议在渗透液中加入白蛋白，以保持粘液压力，减少水肿（如果需要，加上消泡） 56、57、58、59 。此外，含有白蛋白的渗透剂也有助于代谢研究，还需要补充脂肪酸的介质60，61。与啮齿动物的心脏不同，较大的猪心不需要被淹没在温暖的介质中，因为其表面体积比较小，并且流经冠状血管的加热介质体积增加，从而更好地保持温度。如前所述，我们在右心室和左右心室的表观表面放置了温度探头，在整个研究中，我们只观察到所有三个位置的1~2°C的轻微温度波动。重要的是，这种更快的流速也会增加气泡和潜在栓塞的可能性。为了规避此问题，我们建议使用带大孔管的气泡陷阱，直直通向主动脉管。类似地，我们发现，让两个人协同工作，将主塔放在一个更大（更重）的心脏上是很有用的;一个人用坚固的四分位保持主塔打开，另一个人用脐带将主塔固定到主塔。在所述方法中，我们发现，心痛和除颤灌注对心脏恢复至关重要，这与啮齿动物心脏制剂相反。根据我们的经验，只有少数被切除的心脏在没有心电图的情况下恢复了正常的坐着的坐交运动。
为了改善光学成像端点，挂心脏准备限制了眩光的影响，可能发生与淹没的心脏。此外，挂心脏还避免任何压缩或损害冠状血管在心脏后部，可能发生时，水平放下心脏垂直成像。我们还发现，在气泡陷阱（靠近主动脉管）后加载荧光染料可以大大改善组织染色和光信号。最后，为了改善心脏电生理学端点，使用更大的同轴刺激电极有助于成功的心房起搏。尽管我们描述了使用心电图来识别各种 EP 参数的捕获和捕获损失，但也可以使用心内导管或双极记录电极。
我们的研究重点是在孤立的、完整的猪心脏模型中开发双光学映射和心脏电生理学评估方法。由于与青少年心脏的相似性，猪心仍然是研究儿科心脏病学或先天性心脏缺陷的热门模式。重要的是，所述方法可以适应使用大尺寸的成人心脏和/或不同的兴趣物种。事实上，其他实验室可能会发现，使用人或人类心脏（无论是捐赠者或疾病）更适用于他们的特定研究重点53，54，55。这项研究的另一个潜在限制是使用机械不耦合器来减少成像过程中的运动伪影。Blebbistatin因其对心电图参数、活化和耐火期41、62、63的影响最小，已成为心脏成像应用中的首选。BDM 是一种较便宜的选择，在需要更大量的渗透和机械非耦合剂的大型动物研究中尤为重要，但已知对钾和钙电流的影响更大，可以改变作用电位形态学 64，65，66，67。如果使用BDM，请注意，APD缩短会增加心脏易感休克引起的阿瑞特米亚68。相反，使用比比沙丁的主要限制是它的光敏性和光毒性，虽然替代配方已经减少了这些影响69，70，71。最后，所述方法利用单一相机系统进行双光学映射实验，但需要注意的是，研究的重点是心室颤动和/或跟踪心室表面的电波需要修改这种方法，以包括三维全景成像，如其他人描述15，19，72，73，74，75.

心血管疾病是全世界疾病和死亡的主要原因。因此，主要的研究重点是优化可用于研究正常心脏生理学和有助于人类发病率和死亡率的基本机制的方法。基础心血管研究传统上依赖于小动物模型，包括啮齿动物和兔子1，2，3，由于转基因物种4，5，成本更低、实验占地面积更小、吞吐量更高。然而，使用猪模型有可能提供更临床相关的数据6。事实上，以前的研究已经记载了人类和猪在心脏电生理学（EP）上的相似性，包括类似的电电流7、作用电位形状8和对药理学测试9的反应。此外，猪心脏具有收缩和放松动力学，比啮齿动物或兔子10更可比人类。与一只虫模型相比，猪冠状动脉解剖学更类似于人的心脏11，12，是研究重点研究心脏发育、小儿心脏病学和/或先天性心脏缺陷的首选模型13.虽然猪和人类心脏8有区别，但这些相似性使得猪心脏成为心血管研究的宝贵模型。
自奥斯卡·兰根多夫16首次建立心脏动力学以来，心脏的逆行灌注已成为研究心脏动力学的标准方案。因此，朗根多夫灌注可用于在没有自主影响的情况下支持孤立的、完整的心脏。该模型是直接比较心脏电生理学和健康心脏与非健康心脏之间的收缩性的有用工具。由于心脏动力学在时间上和空间上都是复杂的，一个区域的轻微变化会极大地影响整个心脏作为同步17工作的能力。因此，参数敏感染料的高时空成像是监测心脏表面心脏功能的有用工具。事实上，同时对电压和钙敏荧光探头进行双成像，可以评估组织20、21、21的电活性、钙处理和激励收缩耦合。22，23，24，25，26，27，28。Langendorff 灌注和/或光学映射技术以前曾用于记录因老化或基因突变而导致的心脏性能下降，并评估药理剂或环境暴露的安全性29，30，31，32，33.
在临床环境中，侵入性心脏电生理学研究通常用于调查心脏节律障碍、识别病理和确定可能的治疗方案。同样，我们描述了一个EP协议，可用于评估坐面节点功能，测量眼间传导，并确定心肌组织的耐火性。所述EP研究可以结合光学映射或心电图34进行，以完全描述孤立心脏的心脏生理学。在所述协议中，在双发射设置中，使用电压 （RH237） 和钙 （Rhod-2AM） 染料的组合进行高时空分辨率荧光成像。此外，在正心节律下和对程序电刺激的反应下，对心脏电生理学参数进行了监测。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560-5MG</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-100G</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog signal interface</td>
			<td>emka Technologies</td>
			<td>itf16USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5758-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula, 5/16&#8221;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45509-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430641U-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>C77-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, sCMOS</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Zyla 4.2 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coaxial stimulation electrode (atria)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrillator</td>
			<td>Zoll</td>
			<td>M Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T660lpxrxt-UF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DP-304A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, calcium</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET585/40m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, voltage</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET710lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP stimulator (Bloom)</td>
			<td>Fisher Medical</td>
			<td>DTU-215B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>CT510/60bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lights</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SOLIS-525C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8147K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cartridge, polypropylene</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>PD-5-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter housing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9979T21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow transducer</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>ME6PXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemofilter</td>
			<td>Hemocor</td>
			<td>HPH 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>423-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-bore tubing, I.D. 3/8&#8221;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-169-7H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>DO-5095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image Alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm</td>
			<td>AD Instruments Inc.</td>
			<td>MLA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Humbug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>PolyStan</td>
			<td>A/S 1481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir, 2 liter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-34541-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2-AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode (ventricle)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical</td>
			<td>890186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing flow console</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>J0025UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath/circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89400-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage shears</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8448</td>
			<td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Dalwha Corp. Ltd.</td>
			<td>BA2ALD001</td>
			<td>Model: 200 Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7476</td>
			<td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8960</td>
			<td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8985</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>14.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501747</td>
			<td>11.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8980</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8828</td>
			<td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pediatric cross clamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7660</td>
			<td>Cooley-Derra Clamp 6.25&#34; 5mm Calibrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right angle forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501240</td>
			<td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>549-4</td>
			<td>Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8380</td>
			<td>Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Serrated forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500363</td>
			<td>Dressing Forceps 15.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamp</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501700</td>
			<td>Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner retractor</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501314</td>
			<td>Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2x3 Sharp Prongs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 prolene suture</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel loop</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>011001PBX</td>
			<td>Sterion&#174; Vessel Loop, 0.8 x 406mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardioplegia (Plegisol)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409-7969-05</td>
			<td>Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>300 U/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and Needle</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>60mL &#38; 18G respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>U12T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts

小型动物模型最常用于心血管研究，因为与大型动物相比，转基因物种的可得性较低，成本更低。然而，大型哺乳动物更适合于与正常心脏生理学、病理生理学和治疗剂临床前测试有关的转化研究问题。为了克服在心脏研究中采用大型动物模型相关的技术障碍，我们描述了一种在孤立的、兰根多夫（Langendorff）注入小猪心脏中测量生理参数的方法。这种方法结合了两个强大的实验工具来评估心脏的状态：电生理学（EP）研究和同时光学映射跨膜电压和细胞内钙使用参数敏感染料（RH237，Rhod2-AM）。上述方法非常适合研究心脏传导系统、运动电位形态变化、钙处理、激励收缩耦合和心脏变数或心律 失常。

图1A显示了隔离心脏灌注系统的图，包括管路、泵、过滤器、氧合器、储液罐和加热元件。ECG（引线II配置）和起搏电极的放置如图1B所示，成像设置如图1C所示。图1D显示了光学元件和光路原理图。
实验研究对从约克郡幼猪（14-42天，n = 18）中分离出来的完整整颗心脏进行了研究，其大小从2.5-10.5公斤体重到18-137克心脏重量（图2A）。将隔离的心脏转移到Langendorff系统（37°C）后，心率稳定在除颤10分钟内稳定到70±4.5 bpm（均值 = SEM），并在整个研究过程中保持不变（图2B）。测量的平均流速为 184 ± 17 mL/min （均值 = SEM），在与包含机械非耦合器的加热介质渗透后，流速减慢到 70 ± 7.5 mL/min （图 2C）。
铅II ECG在研究期间记录在正努斯节（图3A）或响应外部起搏（图3B-E），以量化电生理参数。对于 EP 评估，动态起搏 （S1_S1） 应用于右侧中庭，以精确定位 WBCL 和 SNRT（S1+S1 开始后恢复时间，图 3C），其中 WBCL 表示为启动心室传导的最短 PCL。S1_S2 起搏协议使用左心室的双极刺激电极实现，以识别启动心室除极化的最短耦合间隔，从而精确定位 VERP（图 3D）。或者，S1_S2 心房起搏协议用于精确定位 AVNERP （S1_S2），如图3E所示。猪心脏电生理学参数的代表性例子与先前发表的37例非常一致。
在窦节律、自发心室颤动（图4）或左心室（LV）的动态起搏（S1+S1）期间进行光学映射实验，以生成中所示的电和钙恢复曲线。图5.图 4显示了从表观表面两个感兴趣区域收集的相应光学作用电位 （Vm） 和钙 （Ca） 瞬变（右心室 [RV] = 蓝色、LV = 红色）的代表性图像。.未处理的信号在正心节和心室颤动期间显示。如前所述，在光学映射实验中也使用动态表观步速（S1_S1），以规范内在心率的任何细微差异（图5A-E）。显示原始信号（RV = 蓝色，LV = 红色），用于描述作用电位 = 钙瞬态耦合时间（图 5C）、激活和持续时间（图 5D）、电和钙恢复（图 5E）。对于厚厚的心肌制剂，内核尺寸为±3 mm x 3 mm的空间过滤适用于心肌作用电位或钙瞬态分析19，47。因此，高空间分辨率图像（在所述设置中共 1240 x 1024，或每个通道 620 x 512，像素大小为 6.5 μm 像素大小）通常在采集期间或采集后的空间单元（图 5C）。图像处理可以使用自定义算法23、33、43、45 （图 3D）进行生成激活和再极化映射，激活时间为心脏上的每个像素被定义为作用电位或钙瞬态上冲程的最大衍生物。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> 图 1：实验设置。（A） 隔离心脏灌注系统的图;箭头表示流动方向。（B） 一个可口的心脏用电极放置显示。RA = 右心房，RV = 右心室，LV = 左心室，心电图 = 铅 II 心电图。（C） 靠近心脏组织的成像平台。（D） 使用具有适当发射滤波器和二色镜的图像分割装置，每个互补探针（电压、钙）的发射按波长分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> 图2：心脏重量、速率和流量测量值。（A） 研究中使用的每头小猪的心脏重量与体重之比（n = 18）。（B） 除颤后10分钟测量的心率，并在研究结束时再次测量（约1小时）。（C） 冠状动脉流量在用机械非耦合器（+BDM）灌注后急剧下降，原因是氧气需求减少。比例尺代表平均值 = SEM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> 图3：在主心律失常期间或响应外部起搏时收集的铅II心电图记录的代表性示例。（A） 正常正心律。（B） 周期长度为 400 ms （S1_S1） 的表观步起搏示例，用于成像实验。（C） 顶部：心房起搏以识别 WBCL;在S1=250 ms处观察到成功的捕获，其中心房到心室传导被观察到。请注意，心房起搏可用于确定 SNRT（开始外部起搏后到鼻信节点放电的时间）。底部：当 S1 循环长度减小到 205 ms 时，心室的传导失败。（D） 顶部： 表接步 （S1_S2） 以识别 VERP;在 S1 = 450 ms、S2 = 300 ms 底部观察到成功捕获：由于 S2 周期长度减小到 250 ms，心室组织无法捕获。（E） 心房起搏 （S1_S2） 识别 AVNERP。顶部：在 S1 = 450 ms、S2 = 200 ms 底部观察到成功的捕获：由于 S2 循环长度减少到 199 毫秒，因此对心室的传导失败。蓝色箭头表示起搏尖，红色箭头表示捕获（"C"）或无捕获（"NC"）。S1_S1 = 动态起搏，S1_S2 = 刺激步调。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> 图4：心律和心室颤动期间的光学数据。左图：染料加载猪心脏的代表性图像（Vm = 电压，RH237;Ca = 钙，Rhod2），前视图。空间过滤的跨膜电压和细胞内钙荧光信号从猪的心脏在sinus节律（中心）。心室颤动期间的电压和钙信号（右）。信号区域大小（15 x 15 像素 = 2.4 x 2.4 mm2，30x 30 × 4.8 x 4.8 mm2内核大小）表示为红色和蓝色方块。单位 = +F/F.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> 图5：来自兰根多夫注入猪心脏的光学数据。未加工的、 空间过滤的 （A） 跨膜电压和 （B） 细胞内荧光信号来自左右心室，在顶点进行电气起搏。未经过滤的空间平均信号描绘了来自感兴趣区域的光学作用电位和钙瞬变（信号单元为 μF/F）。（C） 规范化瞬态的叠加说明了作用电位-钙瞬态耦合时间（低通过滤在 75 Hz）。（D） 处理跨表观表面的信号，以生成时态参数的等时图，包括激活时间 （t行为）和 80% 重极化时间。（E） 在多频率（左）生成电气和钙瞬态恢复曲线，通过统计分析（右），以说明在较慢的起搏周期长度下更长的重极化时间。比例尺 = 均值 = SEM.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>公式</td>
			<td>分子量</td>
			<td>克/升</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钠</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖酸钠</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>醋酸钠三水合物</td>
			<td>C2H3NaO2+3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>氯化钾</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化镁（无水）</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.4% 碳酸氢钠</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>甘露醇</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸镁</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>渗透性（摩尔/升）</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表1：修改德尔尼多的心痛食谱。

Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

本研究的目的是建立一种使用转化动物模型调查心脏动力学的方法。所述的实验方法将双发射心电图与电生理学研究相结合，以评估孤立、完整的猪心脏模型中的电活动。

前维沃·兰根多夫注入心脏的心电生理学研究

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

心血管故障是全世界死亡的主要原因。我们在这里展示的孤立的心脏模型可以作为人类心脏动力学的实验窗口。这种方法结合了经典的电生理学研究与跨膜电压和细胞间钙的同步光学映射，以评估心脏的状态。这种方法可以应用于疾病建模、药理学和毒理学研究。例如，我们的重点领域之一是描述玻璃尺寸器对心脏电生理学的影响。尽管这种方法在技术上比使用较小动物模型的协议更具挑战性，但总体而言，一旦所有部分都到位，该协议就相对简单。很难用文本来描述成像和灌注系统的所有组件，因此，此过程的可视化演示将有助于重现成功的制备。将心脏与上升的大干管隔离完后，将切除的器官插入冰冷的心绞痛中，并使用一对海管抓住大干的壁。将容器滑到连接到连接到一升冰冷的心痛介质的管子上的带肋管上，悬浮在心脏上方约 95 厘米处。让液体充满大母，直到容器溢出，以防止任何气泡进入血管，并使用脐带固定大血管到管。将血小板系上，以承受心脏的重量，因为它挂在管上，以进一步固定组织，并允许冷介质逆行，使心脏在70毫米的汞的恒定压力下受到重力的影响。将声音传输到 37 摄氏度的兰根多夫系统，无需将空气引入管中。并允许正常的鼻窦节律冲洗任何剩余血液和心痛的血管。在出现可震性心律失常时，将外部桨放在心脏的顶点和底部以除颤器官，在五焦耳处进行单次冲击，并在五焦耳增量中增加，直到达到50焦耳、心向或不可休克的节奏。然后，用至少一升改良的 Krebs-Henseleit 介质冲洗心脏，无需再循环即可去除任何残留的血液和心痛。当介质穿过心脏时，关闭循环循环以再循环香水。要在整个研究过程中记录到心电图的标准引线，请将 29 量针电极连接到顶点附近的心室，并在右中庭中连接另一个电极。将差分生物增压器的正负输入分别连接到顶点和右中庭，并在右心房上连接一个双极刺激电极和第二个双极刺激电极，用于起搏目的。使用电生理学刺激器对心脏进行步速，初始电流设置为舒张阈值的两倍，脉冲宽度为一毫秒。要确定起搏阈值，请应用一系列一到两毫安的刺激脉冲，其脉冲宽度为一毫秒，且具有定义的起搏周期长度，以确保一致的刺激响应。使用 S1、S1 或 S1、S2 起搏列车执行额外的刺激起搏。逐步将 S2 起搏周期长度缩短 10 毫秒，直到起搏无法捕获。然后，逐步到倒数第二个起搏周期长度，并在一毫秒间隔内减少循环长度，以确定在捕获丢失之前最精确的起搏周期长度。要建立心室有效耐火期，请使用左心室的刺激电极确定最短的 S1、S2 间隔，S2 过早节拍启动心室去极化。要定义温克巴赫循环长度，请使用右中庭上的刺激电极找到最短的 S1，S1 间隔，其中一对一的间歇传导通过正常传导通路传播。要定义鼻窦节点恢复时间，请使用右中庭上的刺激电极应用S1、S1起搏列车，测量起搏列车最后一次脉冲与自发中心节点中庭活动恢复之间的时间延迟。要建立心室节点有效耐火期，请使用右心庭上的刺激电极。查找最短的 S1，S2 耦合间隔，在该间隔下，过早心房刺激后跟一个 Hisbundle 电位，该电位引起 QRS 复合物，表示心室去极化。对于跨膜电压和细胞内钙的光学映射，首先缓慢地将新准备的电压染料近到大音管中加入五毫升，然后缓慢添加新鲜准备的钙染料。接下来，将映像硬件定位到适当的视野，然后将摄像机连接到工作站。使用所选软件获取图像，曝光时间为 5 到 2 毫秒。并借助软件执行图像对齐，该软件可以拆分和覆盖所需的区域，并显示灰度减法或伪颜色添加到任何高光错位。最小化环境照明后，测试 LED 灯，以确保由传感器井深决定的均匀和最大的史诗般的照明。然后，使用位于左心室的刺激电极，在鼻窦节律、心室颤动或动态起搏期间对肌卡，从 350 毫秒的起搏周期长度开始，并减少 10 到 50 毫秒以生成恢复曲线。要在整个实验中确认获得质量光信号，请打开视频文件，选择感兴趣的区域，并绘制一段时间内平均荧光。在实验结束时，将心脏从系统中取出并排空。然后，用纯净水冲洗系统管和室。对于日常维护，根据需要定期使用洗涤剂溶液冲洗系统。在这些具有代表性的研究中，如证明，手术是在完好无损的模型上进行的，其大小从2.5公斤到10.5公斤的体重和18至137克的心脏重量不等。将分离的心脏转移到兰根多夫系统后，心率在大约10分钟的除颤内稳定到每分钟70次左右，并在研究期间保持不变。通常测量每分钟约 184 毫升的平均流量。使用含有机械未coupler的加热介质后，每分钟可减速至70毫升。铅两个心电图可以在鼻窦节律期间或响应外部起搏以量化电生理参数期间记录。光学映射实验也可以在鼻窦节律和自发心室颤动期间进行。染料加载心脏的代表性图像可以获得相应的光学作用电位。钙瞬变可以从两个感兴趣的区域收集在史诗表面。此外，在光学映射实验中可以使用动态史诗起搏来使内在心率的任何细微差异正常化。原始信号可用于描述作用潜力钙瞬态耦合时间、激活和持续时间，以及电和钙恢复。重要的是避免气泡进入大母，尽量减少从动物转移到系统的时间，并支持更大的心脏。电生理学和光信号数据采集后可以分析。此外，在组织学、免疫控制或基因表达分析研究之后，心脏可以保留下来。我们利用这项技术来描述青少年心脏发育，并检查环境暴露对心脏生理学的影响。用于最大程度降低运动的机械解耦合器和用于处理白化泡沫的防泡沫化学品都是有毒的，因此使用适当的个人防护设备是绝对必要的。

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

患者组织及基因传递考试前的体外培养

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

科研

医学

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

前溶瘤病毒的活组织的体内感染

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

步骤人类隐静脉<em&gt;前体内</em&gt;灌注和外部强化

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

纳米抗体和基于抗体的验证<em&gt;在体内</em&gt;肿瘤异种移植NIRF成像的小鼠实验使用<em&gt;离体</em&gt;流式细胞仪和显微镜

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

诱导和缺血再灌注损伤评估中的Langendorff灌注鼠心

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

体外肺转移及微环境的实时成像

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

体外常温肝灌注的小动物模型

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

心内神经元对体外 Langendorff 系统心脏电生理和心脏交感神经的影响

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

生理条件下猪心的切片和培育

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...