Name: optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Forfatterne takknemlig erkjenner Dr. Matthew Kay for nyttig eksperimentell veiledning, og Manelle Ramadan og Muhaymin Chowdhury for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01HL139472 til NGP, R01 HL139712 til NI), Children ' s Research Institute, Children ' s National Heart Institute og Sheikh Zayed Institute for pediatric kirurgisk innovasjon.

Alle eksperimenter ble gjennomført i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr (åttende utgave). Alle metoder og protokoller som brukes i disse studiene har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Protocol Committee ved Children ' s National Hospital følge retningslinjene for Stell og bruk av laboratorium dyr publisert av NIH. Alle dyrene anvendt i denne studere mottatt Human bekymre inne medgjørlighet med det guide for omsorgen og bruk av laboratorium dyrene.
1. forberedelse
<ol><li>Forbered 6 L av modifisert Krebs-Henseleit løsning16 (mM: 118,0 NaCl, 3,3 KCl, 1,2 MgSO4, 24,0 NAHCO3, 1,2 KH2PO4, 10,0 glukose, 2,0 natrium pyruvat, 2% albumin, 2,0 CaCl2). Legg CaCl2 på dagen av eksperimentet, siden over tid, i nærvær av fosfater, kalsiumklorid vil døds utfelling ut av løsningen som kalsium fosfat.</li>
	<li>Juster pH til 7,4 etter steril filtrering (pore størrelse: 0,22 μm). Sjekk løsnings osmolalitet for å sikre en rekke 275 − 310 mOsm/kg. Cool 1 L på isen for bruk umiddelbart etter at hjertet er excised. Varm 3 L i et vannbad til ca 37 ° c før bobler med carbogen (95% O2,5% co2). Merk: Oppvarming minimerer bobler og potensiell emboli, siden kald væske har en økt kapasitet på gass for å oppløse; Derfor, som den modifiserte Krebs-Henseleit Media passerer gjennom systemet og varmer, gassen vil bli utgitt som bobler.</li>
	<li>Forbered 2 L av cardioplegia (modifisert del Nido cardioplegia løsning, tabell 1). Frys nok cardioplegia i en Ice Cube skuff å fylle en 500 mL beger.</li>
	<li>Slå på sirkulerende vannbad satt til 42 ° c. Slå på pumpene for å sirkulere perfusate i en lukket hydroniske varme sløyfe (for en fullstendig liste over materialer, se tabell over materialer og figur 1). Merk: Et oppvarmet sirkulasjons vannbad brukes til å varme opp vann Jacketed rør og varmevekslere.</li>
	<li>Rengjør rør kretser og kamre ved å kjøre 2 L av en 1% løsning av Universal vaskemiddel i vann gjennom systemet. Skyll alle rør kretser og Langendorff-systemet med > 4 L av renset vann. Kjør pumper til alt vannet er fjernet fra systemet.</li>
	<li>Tilsett en syntetisk membran filter i tråd med pumpe pumpene (polypropylen filter, pore størrelse > 5 μm). Gass en mikrofiber oxygenator (hemofilter) med 95% O2 og 5% co2 på 80 kPa. Merk: Ved bruk av albumin, er det ofte skumme forbundet med oksygenering og/eller pumping aktivitet gjennom slangen kretsen. En anti-skum sammensatte (skumdemper Y30 emulsjon) kan legges dråpevis periodisk (~ hver 30 min) for å slukke det som det skjer.</li>
	<li>Kontroller en to-punkts kalibrering (0 og 60 mmHg) for trykkgiveren som befinner seg over aorta eller i boble fellen; kalibrere etter behov.</li>
	<li>Umiddelbart før hjertet forbrukeravgift, helle mediene inn i Langendorff loop system. Sørg for at perfusate passerer gjennom mikrofiber oksygenat (hemofilters) gasset med oksygenrikt perfusate, som deretter renner gjennom Varmevekslere for å opprettholde en medie perfusate temperatur på 37 ° c ved aorta.</li>
	<li>Sett sirkulerende vannbad til et par grader høyere enn 37 ° c, for eksempel 42 ° c, for å gjøre rede for varmetap under bytte og i hele systemet. Overvåk den sirkulerende perfusate temperaturen med thermocouples.</li>
</ol>2. hjertet forbruker-og Langendorff
<ol><li>Sedate grisen med en intramuskulær (IM) injeksjon av ketamin (20 mg/kg) og xylazine (2 mg/kg) og intubere med et endotrakeal rør. For induksjon, Administrer en intravenøs (IV) bolus injeksjon av fentanyl (50 μg/kg) og rocuronium (1 mg/kg). Oppretthold anestesi med inhalert isoflurane (0,5 − 3%), fentanyl (10 − 25 μg/kg) og pancuronium (1 mg/kg). Merk: For denne studien med bevis for prinsippet ble juvenile Yorkshire Pigs (14 − 42 dager gammel, n = 18) brukt som varierte fra 2,5 − 10,5 kg kroppsvekt og 18 − 137 g hjerte vekt (figur 2). Hvis en ekstra injeksjon for induksjon er nødvendig, kan ketamin (10 mg/kg) injiseres im</li>
	<li>Når Dyret er helt anesthetized og ikke-responsive, utføre en sternotomy å avdekke stigende aorta og høyre Atrium.
	<ol>
<li>Ved hjelp av en skalpell, lage en midtlinjen snitt fra toppen av brystbenet ved bryst innløpet, ned til xiphoid prosessen. Med en cauterization (eller saks), analysere det underliggende Basin og muskelen til det brystbenet er synlig.</li>
		<li>Fra xiphoid prosessen, skjær brystbenet midtlinjen opp gjennom manubrium med enten kirurgisk bein saks eller en bein sag. Sett sårhaker inn i snittet for å avdekke hjertet.</li>
	</ol></li>
	<li>Lever en bolus dose heparin (300 U/kg) til høyre Atria, ved hjelp av en 18 G nål og sprøyte, for å minimere blot klumper på organ forbrukeravgift. Plasser absorberende pads i brystet hulrom og is rundt hjertet.</li>
	<li>Med saks, forsiktig skjære gjennom pericardium, isolere aorta av Butt disseksjon fra det omliggende bindevevet, og klemme aorta like under den første arteriell gren på aorta buen. Bruk en 50 mL sprøyte med en 18 G nål, Injiser iskald cardioplegia (20 mL/kg) gjennom toppen av den stigende aorta.</li>
	<li>Skjær gjennom fartøyene som fører til hjertet og fjerne hjertet med stigende aorta intakt og stupe den excised hjertet i iskald cardioplegia.</li>
	<li>Ta tak i veggene i aorta med et par hemostats og slip den på en ribbet kanyle festet til slangen fører til 1 L av iskald cardioplegia medier suspendert over hjertet (~ 95 cm for å gi ~ 70 mm HG). Tillat væske å gå inn og fylle aorta til den overskrider for å hindre noen boble fra å komme inn i blodkar. Merk: Bruk av en mekanisk uncoupler (2, 3-butanedione monoxime [BDM] eller blebbistatin) vil senke hjertefrekvensen når oksygen behovet i vevet synker.</li>
	<li>Sikre aorta til kanyle ved hjelp av navle tape og videre forankre det ved å binde opp hemostats å bære vekten av hjertet, som nå henger fra kanyle (figur 1C). La de kalde mediene retrograd perfuse hjertet ved et konstant trykk på 70 mmHg via tyngdekraften. Hold hjertet nedsenket i kaldt cardioplegia til det er klart til å bli overført til det varme (37 ° c) Langendorff (< 10 min). Merk: Aorta på mindre hjerter (< 50 g, opp til 2 uke gamle gris) vil bære vekten av hjertet, men større hjerter står i fare for å skli av kanyle. Under den innledende kanyleringen og når du flytter til varmet systemet, hindre luft fra å komme inn i aorta, som kan forårsake koronar lungeemboli. Bruk stor bore slange (> 3/8 "innvendig diameter) som gjør at boblene kan stige raskere enn løsningen inn i aorta.</li>
	<li>Overfør hjertet til Langendorff-systemet (37 ° c) uten å innføre luft inn i kanyle. Tillat normal sinus rytme å skylle blodkar av gjenværende blod og cardioplegia. Merk: I den beskrevne studien en gjennomsnittlig innledende strømningshastighet på 184 ± 17 mL/min ble observert i isolerte juvenile Piglet hjerter. Strømningshastigheten gikk ned til 70 ± 7,5 mL/min (gjennomsnittlig ± SEM) etter perfusing med varmet medium som inneholder en mekanisk uncoupler (20 mM BDM). Ikke Senk hjertevevet, da det kan impinge på CARDIAC Imaging. Tissue temperatur opprettholdes av koronar flyt i gris hjertet på grunn av sin større volum og mindre areal, sammenlignet med gnagere. Under full strømning varierte epicardium og endocardium temperaturer fra henholdsvis 35 ° c til 37 ° c. Forsiktig: Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert øye slitasje når du arbeider med mekaniske uncouplers. Hjertet kan løse ut medier raskt og uventet.</li>
	<li>Defibrillate hjertet i tilfelle av sjokkbar arytmi (ventrikkel takykardi, ventrikkel atrieflimmer) ved å plassere eksterne årer på toppen og bunnen av hjertet og levere et enkelt sjokk på 5 J, øker i 5 J trinn (eller som velges av defibrillator) inntil 50 J, kardioversjon eller un-sjokkbar rytme. Gjenta støt ved 50 J etter behov. Merk: I den presenterte studien, 89% av forberedelsene som kreves defibrillering. Etter likevekts (~ 10 min), ble det observert en Gjennomsnittlighjertefrekvens på 70 ± 4,5 BPM (gjennomsnittlig ± SEM) for juvenile Piglet hjerter (figur 2).</li>
	<li>Skyll hjertet med minst 1 L av modifiserte Krebs-Henseleit-medier, uten resirkulering, for å fjerne rester av blod og cardioplegia. Når mediene går klart gjennom hjertet, lukker sirkulerende loop til recirculate perfusate.</li>
</ol>3. elektrofysiologi studie
<ol><li>For å spille inn en standard bly II elektro (EKG) i løpet av studiet, feste en 29 G nål elektroden til ventrikkel epicardium nær Apex, med en annen elektrode i riktig Atrium. Koble den positive og negative innganger av en differensial bioamplifier til Apex og høyre Atrium, henholdsvis.</li>
	<li>Fest en bipolar stimulans elektroden på høyre Atria, og en andre bipolar stimulans elektroden til lateral venstre ventrikkel for pacing formål.</li>
	<li>Pace hjertet ved hjelp av en elektrofysiologi stimulator, med den første gjeldende satt til to ganger diastolisk terskelen (1 − 2 ma) og en 1 MS pulsbredde35,36. Merk: Hvis stimulering unnlater å lokke fram et svar, kan pulsen bredden økes opp til 2 ms. mer strøm (~ 10x) er nødvendig med store koaksial elektroder (bipolar stimulering).</li>
	<li>Identifiser Fremdrifts terskelen ved å bruke en rekke stimulans impulser (1 − 2 mA, 1 MS pulsbredde) i definerte tempo syklus lengder (PCL) for å sikre konsekvent stimulans respons. Merk: Når den iboende satsen er etablert, kan det innledende impuls tog begynne på en litt kortere PCL.</li>
	<li>
Utfør extrastimulus tempo ved hjelp av enten et S1 − S1-eller S1-S2 tempo tog, i sistnevnte ble et tog på 6 − 8 impulser etterfulgt av en enkelt impuls (S2). Reduser S2 PCL-trinnvis med 10 ms (dvs. 200 MS, 190 MS, 180 MS, etc.) til den ikke fanger opp. Gå opp til den nest siste PCL (dvs. 190 MS) og nedgang i 1 MS intervaller for å finne den mest presise PCL før tap av fangst (dvs. 184 MS). Merk: de samme stimulering parametrene brukes for både S1 og S2 (1 − 2 MA, 1 MS pulsbredde). Se Figur 3 for representative eksempler, eller tidligere publiserte verdier på svin hjerte elektrofysiologi målinger37.<ol>
<li>For å etablere ventrikkel effektive ildfast periode (VERP), bruk stimulans elektroden på lateral venstre ventrikkel for å identifisere den korteste S1 − S2 intervall der S2 (prematur beat) initierer ventrikkel depolarization. Merk: Den ildfaste perioden er det korteste, oppnåelige koplings intervallet på S1 − S2.</li>
		<li>For å definere Wenckebach syklus lengde (WBCL), bruk Stimulus elektroden på høyre Atrium for å finne det korteste S1 − S1-intervallet der 1:1 atrioventrikulær Lednings overføring via den normale Lednings veien. Merk: Unnlatelse av å gjøre dette representerer 2nd grad hjerteblokk.</li>
		<li>For å definere sinus node utvinning tid (SNRT), bruk stimulans elektroden på høyre Atrium for å bruke et pacing tog (S1 − S1) og måle tidsforsinkelsen mellom den siste impuls i pacing tog, og gjenvinning av spontane sinoatriell node-mediert aktivitet.</li>
		<li>For å etablere atrioventrikulær node effektiv ildfast periode (AVNERP), bruk stimulans elektroden på høyre Atrium for å finne den korteste S1-S2 koplings intervall der for tidlig atrieflimmer er etterfulgt av en hans bunt potensial som utløser en QRS kompleks, noe som betyr ventrikkel depolarization.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. optisk kartlegging av transmembrane penning og intracellulære kalsium
Merk: En mekanisk uncoupler bør brukes for å minimere bevegelses artefakter under optisk kartlegging og for å unngå hypoksi3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 μM sirkulerende konsentrasjon) kan tilsettes langsomt som en bolus dose på 0,5 mM i 5 mL perfusate (100% av endelig konsentrasjon)41. Alternativt kan BDM være i utgangspunktet inkludert i perfusate Media ved en sirkulerende konsentrasjon på 20 mM.
<ol><li>Forbered spenningen fargestoff ved å oppløse 5 mg RH237 i 4 mL vannfri DMSO. Fortynne fargestoff alikvot med opp til 5 mL av media og Vortex. Sakte tilsett RH237 (62,1 mikrogram per 500 mL perfusate) proksimale til aorta kanyle. Merk: Hjerteinfarkt vev kan bli re-farget med RH237, om nødvendig, gjennom hele varigheten av eksperimentet.</li>
	<li>Forbered kalsium fargestoff ved oppløsning 1 mg Rhod2-AM i 1 mL vannfri DMSO. Bland fargestoffet med 50 μL av pluronic syre, plasser i en 37 ° c sonikere bad i opptil 10 min, og deretter fortynne med opptil 5 mL medier. Langsomt tilsett kalsium fargestoff (50 mikrogram per 500 mL perfusate) proksimale til aorta kanyle. Merk: For å sikre enhetlig fargestoff farging, bør fargestoffer legges sakte (> 30 s). Rhod-2AM tar opptil 10 minutter å nå topp fluorescens, mens RH237 flekker hjertet innen 1 − 2 min. ved hjelp av den beskrevne fargestoff lastingen kan det forventes signal til støyforhold (SNR) på henholdsvis ~ 42 − 86 og ~ 35 − 69 for spenning og kalsium. SNR-verdier kan beregnes som SNR = (peak-to-peak teller)/(standard avvik under diastolisk intervall)42.</li>
	<li>Plasser bilde maskinvaren (kamera, bilde splitter, linse) som vist i figur 1, for å fokusere på et passende synsfelt. Merk: Splitter er konfigurert med en dichroic speil (660 + NM) som passerer RH237 og reflekterer Rhod2 utslipp Spectra. Høy transmisjon utslipps filtre brukes for RH237 (710 NM Long pass) og Rhod2 (585 ± 40 nm) slippes lys (lang pass ET710, se tabell over materialer). En bred-elev 50 mm/F 0.95 l linsen er festet til fronten av bildet splitter. Denne konfigurasjonen resulterer i tilstrekkelig utslipps lys separasjon, som tidligere validert43,44.</li>
	<li>Koble kameraet til en arbeidsstasjon og Skaff bilder ved hjelp av valgt programvare, med eksponeringstid på 0,5 − 2 ms. Utfør Bildejustering ved hjelp av programvare som kan splitte de ønskede regionene, overlappe og vise en gråskala subtraksjon eller pseudo-farge i tillegg til å fremheve forskyvning (se tabell over materialer for programvare alternativ).</li>
	<li>Slå av lyset på rommet for å minimere fluorescens forstyrrelser fra omgivelsesbelysningen. Test LED-lampene (525 NM, 1,4 mW/mm2) før starten av bildebehandling for å sikre ensartet og maksimal epicardial belysning, som bestemmes av sensor brønn dybden. Merk: Hvert lys ledes gjennom et eksitasjon filter (535 ± 25 NM). LED-lys kan utløses manuelt før filming for å maksimere signal linearitet. Slippes ut fluorescens fra epicardium føres gjennom bilde splitteren og utslipps filtrene. Delte bilder projiseres på en høyhastighets sensor. Synsfeltet er ca 12 cm x 10 cm, eller 5,9 cm x 4,7 cm for hvert delt bilde, avhengig av objektiv valg og avstand fra hjertet.</li>
	<li>Ved optiske kartleggings studier er bildet av myokard under sinus rytme, ventrikkel atrieflimmer (Figur 4) eller dynamisk tempo (S1 − S1, 1 − 2 MA, 1 MS pulsbredde) via en stimulering elektrode plassert på venstre ventrikkel (figur 5). Begynn med en tempo syklus lengde på 350 MS, og Reduser med 10 − 50 MS for å generere restitusjon-kurver (figur 5e)35,36.</li>
</ol>5. opprydding
<ol><li>Fjern hjertet fra systemet og Tøm alle perfusate. Skyll system slangen og kamrene med renset vann.</li>
	<li>For rutinemessig vedlikehold, periodisk skylle systemet med vaskemiddel løsning eller en fortynnet hydrogen peroxide løsning, etter behov.</li>
</ol>6. behandling av data
<ol><li>Bekreft optisk signalkvalitet gjennom hele studien ved å åpne en videofil, velge en region av interesse, og plotting bety fluorescens over tid ved hjelp av en passende programvarepakke eller egendefinert algoritme.</li>
	<li>
Analysere bildedata som tidligere beskrevet23,33,43,45,46, for å kvantifisere handlings potensialet og kalsium forbigående timelige parametre, inkludert aktiveringstid, spennings-kalsium koplings tid (forskjellen mellom VM og ca aktiverings tider), og repolarisasjon varighet målinger.
	<ol>
<li>Påfør terskelverdi for å isolere fluorescerende epicardial piksler og forkaste støyende bakgrunnsdata. Merk: Terskelverdi vil forenkle og fremskynde analyser på tvers av store videoer.</li>
		<li>Romlig filtrerer optiske signaler over et epicardial overflateareal med kjerne størrelser som spenner fra 3 mm x 3 mm til 5 mm x 5 mm, som vist i Figur 4 og figur 5. Merk: Sistnevnte vil forbedre SNR uten forvrenger handling potensielle funksjoner, kalsium forbigående morfologi, eller generell kontur av wavefronts19,47. Dette kan være unødvendig hvis du bruker en sensor med store piksler, eller hvis binning under anskaffelsen.</li>
		<li>Filtrer signaler midlertidig med et digitalt lavbassfilterbryter filter (for eksempel 5th-Order Butterworth) med en grensefrekvens mellom 100 og 75 Hz for å eliminere ubetydelig signal innhold45. Merk: Se figur 5c for et eksempel på representative behandlede spor.</li>
		<li>Påfør drift fjerning og subtraksjon, via NTH-Order Polynom montering, for å minimere effekten av photobleaching, bevegelse, eller andre viktige kilder til variasjon.</li>
		<li>Etter prosessering og normalisering av optiske data på tvers av en hel video, beregne handling potensial og kalsium forbigående parametre av interesse. Bestem aktiveringstid, definert som tidspunktet for maksimal avledning under depolarization, og topp fluorescens for å beregne repolarisasjon prosentvise tider og perioder (handlings potensiell varighet [APD] og [ca2 +] i varighet [CaD], se Figur 5).</li>
		<li>Etter at timelige parametre er kalkulert, Generer isochronal kart for å skildre aspekter ved en enkelt handling potensial eller kalsium transient over hele avbildet epicardial overflate ved hjelp av tilpassede algoritmer23,33, 43,45,46. Merk: Se figur 5D for et eksempel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Selv om hjerte-forskning modeller spenner fra Cellular til in vivo forberedelser, det er en iboende trade-off mellom klinisk relevans og eksperimentell nytte. På dette spekteret, fortsatt den isolerte Langendorff-perfusert hjertet et nyttig kompromiss for å studere hjerte fysiologi48. Hele hjerte modellen representerer et høyere nivå av funksjonell og strukturell integrasjon enn enkelt celle-eller vevs monolagere, men unngår også den forvirrende kompleksiteten forbundet med in vivo-modeller. En stor fordel i løpet av dobbelt optisk kartlegging eksperimenter er at epicardial overflaten av det isolerte hjertet kan observeres, og fluorescens avbildning av transmembrane potensial og kalsium håndtering kan brukes til å overvåke hjerte fysiologi34.
Gnagere modeller er mest brukt for isolerte hjerte preparater i motsetning til større dyr, på grunn av den tilhørende kostnaden for opp-dimensjonering alle elementene som er involvert (f. eks, løsnings volum, modell krets, mengde fargestoffer og mekaniske uncouplers) sammen med større ustabilitet og tilbøyelighet til arytmi i større dyr10,36,49. En fordel å bruke gris hjerter er at de ligner den menneskelige hjertet i struktur, størrelse og hastighet på sammentrekning, derfor mer presist modellering hemodynamisk parametre som koronar blodstrøm og CARDIAC output. På samme måte, mennesker og griser har lignende kalsium håndtering, elektro intervaller37, og handling potensial morfologi inkludert de underliggende kanalene som den representerer12,50,51, i 52. Denne protokollen beskriver i detalj fremgangsmåten for å skape en reproduserbar stor dyremodell for å omfattende karakterisere hjerteinfarkt funksjon. Samtidig bilde av transmembrane penning (RH237) og intracellulære kalsium (Rhod2), som brukes sammen med etablerte elektrofysiologisk protokoller, gir mulighet til å finne mekanismer som er ansvarlig for endrede CARDIAC Funksjonen. Den beskrevne metodikken kan brukes til prekliniske sikkerhetstesting, toksikologiske undersøkelser og etterforskning av genetiske eller andre sykdoms sykdommer. Videre kan den beskrevne metodikken modifiseres og tilpasses for bruk med andre CARDIAC modeller (f. eks, canine, Human) avhengig av den spesifikke forskningen fokus53,54,55.
Det er noen kritiske modifikasjoner å huske på når overgangen fra en mindre gnager modell til en større gris modell for isolerte, hele hjerte forberedelser. Under forberedelse og oppsett, anbefaler vi å legge albumin til perfusate å opprettholde oncotic trykk og redusere ødem (pluss skumdemper, om nødvendig)56,57,58,59. Dess, perfusate inneholder albumin kan også hjelpe i metabolske studier som også krever fettsyrer-tilskudd til Media60,61. I motsetning til gnager hjerter, det større gris hjertet ikke trenger å være neddykket i varme medier på grunn av sin mindre overflate til volumforhold og økt volum av varmet Media strømmer gjennom koronar fartøy som bedre opprettholder temperaturen. Som nevnt tidligere plasserte vi temperatur sonder i høyre ventrikkel og på den epicardial overflaten til både høyre og venstre ventriklene, og observerer bare små temperatursvingninger på 1 − 2 ° c på alle tre steder i løpet av studien. Viktigere, kan slike raskere strømningsrater også øke sannsynligheten for bobler og en potensiell emboli. For å omgå dette problemet, anbefaler vi å bruke en boble felle med stor bore slange som fører rett ned til aorta-kanyle. Tilsvarende fant vi det mest nyttig å ha to personer som arbeider i tandem å kannelerer aorta på en større (og tyngre) hjerte; en person til å holde aorta åpen med solid hemostats og en annen for å sikre aorta til canula ved hjelp av navle tape. I den beskrevne metodikk, fant vi at cardioplegia og defibrillering var avgjørende for CARDIAC utvinning, som er i strid med gnagere hjerte preparater. I vår erfaring, bare noen få excised hjerter gjenopptatt normal sinus-drevet aktivitet uten kardioversjon.
For å forbedre optiske Imaging endepunkter, en hengende hjerte forberedelse begrenset effekten av gjenskinn som kan oppstå med et nedsenket hjerte. Videre unngår hengende hjerte også noen kompresjon eller kompromiss av koronar fartøy på bakre aspekt av hjertet som kan oppstå når du legger hjertet ned horisontalt for vertikal bildebehandling. Vi fant også at lasting fluorescerende fargestoffer etter boble felle (nær aorta kanyle) sterkt forbedret vev flekker og optiske signaler. Til slutt, for å forbedre CARDIAC elektrofysiologi endepunkter, bruk av en større koaksial stimulering elektroden tilrettelagt vellykket atrieflimmer pacing. Selv om vi beskriver bruken av elektrokardiogrammer for å identifisere fangst og tap av fangst for ulike EP parametere, intrakardielle katetre eller bipolar opptaks elektroder kan også brukes.
Vår studie var fokusert på å utvikle en metodikk for dobbel optisk kartlegging og CARDIAC elektrofysiologisk vurdering i en isolert, intakt svin hjerte modell. På grunn av likheter med juvenile menneskets hjerte, forblir svin hjerte en populær modell for studier fokusert på pediatric kardiologi eller medfødt hjertefeil. Viktigere, den beskrevne tilnærmingen kan tilpasses til bruk med større størrelse voksne hjerter og/eller ulike arter av interesse. Faktisk kan andre laboratorier finner at bruk av canine eller menneskelige hjerter (enten donor eller syk) er mer aktuelt for deres spesifikke forskning fokus53,54,55. En annen potensiell begrensning til denne studien er bruk av en mekanisk uncoupler for å redusere bevegelse gjenstand under bildebehandling. Blebbistatin har blitt den uncoupler av valg i CARDIAC Imaging applikasjoner på grunn av sin minimale effekter på EKG-parametre, aktivisering og ildfaste perioder41,62,63. BDM er et rimeligere valg, som kan være spesielt viktig i store dyrestudier som krever større volumer av perfusate og mekaniske uncoupler, men det er kjent for å ha en større innvirkning på kalium og kalsium strømmer som kan endre handlings potensialet morfologi64,65,66,67. Hvis BDM brukes, Merk at APD forkortelse øker hjertene sårbarhet for sjokk-indusert arrythmias68. Omvendt, den viktigste begrensningen for å bruke blebbistatin er dens foto og Phototoksisitet, selv om alternative formuleringer som har redusert disse effektene69,70,71. Til slutt, den beskrevne metodikken utnytter et enkelt kamera system for dobbelt optisk kartlegging eksperimentering, men det er viktig å merke seg at forskningsstudier fokusert på ventrikkel atrieflimmer og/eller sporing av elektriske bølger over epicardial overflaten ville nød å endre denne adgang å inkludere tre-dimensjonal Panoramic tenkelig, idet beskrevet av andre15,19,72,73,74,75 .

Kardiovaskulær sykdom er en ledende årsak til sykdom og død over hele verden. Som sådan er en primær forsknings fokus å optimalisere metoder som kan brukes til å studere normal hjerte fysiologi og underliggende mekanismer som kan bidra til sykelighet og dødelighet hos mennesker. Grunnleggende kardiovaskulær forskning har tradisjonelt støttet seg på små dyremodeller, inkludert gnagere og kaniner1,2,3, på grunn av tilgjengeligheten av genmodifiserte arter4,5, lavere kostnad, mindre eksperimentell fotavtrykk og høyere gjennomstrømming. Bruken av en gris modell har imidlertid potensial til å gi mer klinisk relevante data6. Faktisk har tidligere studier dokumentert likheter i CARDIAC elektrofysiologi (EP) mellom mennesker og griser, inkludert lignende ion7, action potensial form8, og svar på farmakologisk testing9. Videre har svin hjertet kontraktile og avslapping Kinetics som er mer sammenlignbare med mennesker enn enten gnagere eller kaniner10. Sammenlignet med en canine modell, den svin koronar anatomi tettere ligner en menneskelig hjerte11,12 og er modellen av valget for studier fokusert på hjerte utvikling, pediatric kardiologi og/eller medfødt hjertefeil 13. selv om det er forskjeller mellom gris og menneskehjertet8, disse likhetene gjør svin hjertet en verdifull modell for kardiovaskulær forskning14.
Retrograd av hjertet har blitt en standard protokoll for å studere CARDIAC dynamikk ex vivo15 siden først etablert av Oskar Langendorff16. Følgelig kan Langendorff brukes til å støtte et isolert, intakt hjerte i fravær av autonome påvirkninger. Denne modellen er et nyttig verktøy for direkte sammenligne CARDIAC elektrofysiologi og contractility mellom sunne og ikke-sunne hjerter. Siden CARDIAC dynamikk er både timelig og romlig kompleks, en liten endring i en region kan dramatisk påvirke hele hjertets evne til å fungere som en syncytium17. Derfor er høy spatiotemporal Imaging av parameter sensitive fargestoffer et nyttig verktøy for overvåking hjertefunksjon over overflaten av hjertet18,19. Faktisk gjør samtidig dual Imaging av spenning og kalsium-sensitive fluorescerende sonder for vurdering av elektrisk aktivitet, kalsium håndtering og eksitasjon-sammentrekning kopling på vevet nivå20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-og/eller optisk kartlegging teknikker har tidligere blitt brukt til å dokumentere nedgangen i CARDIAC ytelse på grunn av aldring eller genetiske mutasjoner, og å vurdere sikkerheten til farmakologiske midler eller miljømessige eksponeringer29 ,30,31,32,33.
I klinisk setting, en invasiv CARDIAC elektrofysiologi studie brukes ofte til å undersøke hjerterytme forstyrrelser, identifisere patologi, og finne mulige behandlingsalternativer. Tilsvarende beskriver vi en EP-protokoll som kan brukes til å vurdere sinus node funksjon, måle atrioventrikulær ledning, og identifisere ingen respons av hjerteinfarkt vev. Den beskrevne EP studien kan utføres i forbindelse med optisk kartlegging, eller optocardiography34, å fullt karakterisere hjerte fysiologi i isolerte hjerter. I den beskrevne protokollen ble høy spatiotemporal oppløsning fluorescens Imaging utført med en kombinasjon av spenning (RH237) og kalsium (Rhod-2AM) fargestoffer i et dobbelt utslipp oppsett. I tillegg ble CARDIAC elektrofysiologi parametre overvåket under både sinus rytme og som svar på programmert elektrisk stimulering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560-5MG</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-100G</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog signal interface</td>
			<td>emka Technologies</td>
			<td>itf16USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5758-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula, 5/16&#8221;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45509-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430641U-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>C77-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, sCMOS</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Zyla 4.2 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coaxial stimulation electrode (atria)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrillator</td>
			<td>Zoll</td>
			<td>M Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T660lpxrxt-UF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DP-304A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, calcium</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET585/40m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, voltage</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET710lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP stimulator (Bloom)</td>
			<td>Fisher Medical</td>
			<td>DTU-215B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>CT510/60bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lights</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SOLIS-525C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8147K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cartridge, polypropylene</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>PD-5-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter housing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9979T21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow transducer</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>ME6PXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemofilter</td>
			<td>Hemocor</td>
			<td>HPH 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>423-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-bore tubing, I.D. 3/8&#8221;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-169-7H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>DO-5095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image Alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm</td>
			<td>AD Instruments Inc.</td>
			<td>MLA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Humbug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>PolyStan</td>
			<td>A/S 1481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir, 2 liter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-34541-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2-AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode (ventricle)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical</td>
			<td>890186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing flow console</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>J0025UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath/circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89400-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage shears</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8448</td>
			<td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Dalwha Corp. Ltd.</td>
			<td>BA2ALD001</td>
			<td>Model: 200 Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7476</td>
			<td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8960</td>
			<td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8985</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>14.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501747</td>
			<td>11.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8980</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8828</td>
			<td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pediatric cross clamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7660</td>
			<td>Cooley-Derra Clamp 6.25&#34; 5mm Calibrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right angle forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501240</td>
			<td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>549-4</td>
			<td>Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8380</td>
			<td>Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Serrated forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500363</td>
			<td>Dressing Forceps 15.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamp</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501700</td>
			<td>Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner retractor</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501314</td>
			<td>Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2x3 Sharp Prongs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 prolene suture</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel loop</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>011001PBX</td>
			<td>Sterion&#174; Vessel Loop, 0.8 x 406mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardioplegia (Plegisol)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409-7969-05</td>
			<td>Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>300 U/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and Needle</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>60mL &#38; 18G respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>U12T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts

Små dyremodeller er mest brukt i kardiovaskulær forskning på grunn av tilgjengeligheten av genmodifiserte arter og lavere kostnader i forhold til større dyr. Likevel, større pattedyr er bedre egnet for translational forskning spørsmål knyttet til normal hjerte fysiologi, patofysiologi, og prekliniske testing av terapeutiske midler. For å overkomme de tekniske barrierene forbundet med å ansette en større dyremodell i CARDIAC forskning, beskriver vi en tilnærming for å måle fysiologiske parametre i et isolert, Langendorff-perfusert Piglet hjerte. Denne tilnærmingen kombinerer to kraftige eksperimentelle verktøy for å evaluere tilstanden i hjertet: elektrofysiologi (EP) studie og samtidig optisk kartlegging av transmembrane penning og intracellulære kalsium ved hjelp av parameter sensitive fargestoffer (RH237, Rhod2-AM). De beskrevne metodene egner seg godt til translational studier som undersøker hjerte ledningssystemet, endringer i Handlings potensialet morfologi, kalsium håndtering, eksitasjon og forekomsten av CARDIAC alternans eller Arytmier.

Figur 1a viser et diagram over det isolerte hjerte pumpesystemet, som inkluderer slange kretsen, pumpen, filteret, oxygenator, reservoarene og varmeelementer. Plassering av EKG (Lead II-konfigurasjon) og tempo elektroder vises i figur 1B, og bildeoppsettet er avbildet i figur 1C. En skjematisk fremstilling av de optiske komponentene og lys banene er vist i figur 1d.
Eksperimentelle studier ble utført på intakt, hele hjerter isolert fra juvenile Yorkshire griser (14-42 dager, n = 18) som varierte i størrelse fra 2,5 − 10,5 kg kroppsvekt og 18-137 g hjerte vekt (figur 2a). Etter overføring av det isolerte hjertet til et Langendorff-system (37 ° c), stabiliseres hjertefrekvensen til 70 ± 4,5 BPM (gjennomsnittlig ± SEM) innen ~ 10 min av defibrillering og forble konstant gjennom hele studie varigheten (figur 2b). En gjennomsnittlig strømningshastighet på 184 ± 17 mL/min (gjennomsnittlig ± SEM) ble målt, noe som avtok til 70 ± 7,5 mL/min etter perfusing med varme medier som inneholdt en mekanisk uncoupler (figur 2C).
Bly II EKG ble registrert gjennom hele studien under sinus rytme (figur 3a) eller som svar på ekstern pacing (Figur 3B-E) for å kvantifisere elektrofysiologisk parametre. For EP-vurdering ble dynamisk tempo (S1 − S1) påført riktig Atrium for å finne WBCL og SNRT (Gjenopprettingstid etter S1 − S1 starter, figur 3c), karakterisert ved at WBCL ble betegnet som den korteste PCL som igangsatte atrieflimmer til ventrikkel ledning. En S1 − S2 pacing-protokoll ble implementert ved hjelp av en bipolar stimulans elektrode på venstre ventrikkel for å identifisere den korteste koplings intervallet som startet ventrikkel depolarization, og dermed pinpointing VERP (figur 3D). Alternativt brukes en S1 − S2 atrieflimmer-protokoll for å finne AVNERP (S1 − S2), som vist i figur 3e. Representative eksempler på gris hjerte elektrofysiologi parametre align tett med de tidligere publiserte37.
Eksperimenter med optisk kartlegging ble utført under sinus rytme, spontan ventrikkel atrieflimmer (Figur 4), eller under dynamisk pacing (S1 − S1) av venstre VENTRIKKEL (lv) for å generere elektriske og kalsium hvile kurver avbildet i Figur 5. Representative bilder av et fargestoff lastet Piglet hjerte er vist i Figur 4 med tilsvarende optiske action potensialer (VM) og kalsium (ca) transienter samlet inn fra to områder av interesse på epicardial overflaten (høyre VENTRIKKEL [RV] = blå, LV = rød) . Ubehandlede signaler vises under sinus rytme og under ventrikkel atrieflimmer. Som tidligere nevnt, ble dynamisk epicardial pacing (S1 − S1) også brukt under optiske kartleggings eksperimenter for å normalisere en liten forskjell i den indre hjertefrekvensen (figur 5A-E). Rådata signaler vises (RV = blå, LV = rød), som ble brukt til å skildre handlingen potensial-kalsium forbigående koblingstid (figur 5c), aktivering og varighet tid (figur5D), elektrisk og kalsium restitusjon (figur 5e). For tykt hjerteinfarkt preparater, romlig filtrering med kernel størrelse ~ 3 mm x 3 mm er hensiktsmessig for epicardial handling potensial eller kalsium transient analyse19,47. Følgelig, høy romlig resolution profilen (inne det beskrevet setup 1240 x 1024 sum, eller 620 x 512 per kanalen, 6,5 μm pixel størrelse) er ofte romlig binned i løpet av eller stolpe-oppkjøpet (skikkelsen 5c). Image bearbeiding kan utført å utvikle aktivisering og repolarisasjon kart benytter skikk og bruk algoritmer23,33,43,45 (skikkelsen 3D), med det aktivisering tid av hver piksel på hjertet ble definert som den maksimale deriverte av handlingen potensial eller kalsium forbigående oppstrekningen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figur 1: eksperimentelt oppsett. (A) diagram av det isolerte hjerte-systemet; pilene angir strømningsretningen. (B) et kanylert hjerte vises med elektrodeplassering. RA = høyre Atria, RV = høyre ventrikkel, LV = venstre ventrikkel, EKG = bly II elektro. (C) bildebehandlings plattformen i umiddelbar nærhet til hjertevevet. (D) utslipp av hver supplerende sonde (spenning, kalsium) er adskilt av bølgelengde ved hjelp av en bilde deling enhet med egnede utslipps filtre og dichroic speil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figur 2: hjerte vekt, frekvens og strømnings måling. (A) hjerte vekt til kroppsvekt forhold for hver Piglet som brukes i studien (n = 18). (B) hjertefrekvens målt ~ 10 min etter defibrillering og igjen ved slutten av studien (ca 1 time). (C) koronar flyt dråper precipitously etter å ha tatt med en mekanisk uncoupler (+ bdm) på grunn av redusert oksygenforbruk. Scale barer representerer bety ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figur 3: representative eksempler på bly II elektro innspillinger samlet inn under sinus rytme eller som svar på eksterne pacing. (A) normal sinus rytme. (B) eksempel på epicardial tempo ved syklus lengde på 400 MS (S1 − S1), som ble brukt til bilde eksperimenter. (C) Top: atrieflimmer pacing å identifisere WBCL; vellykket fangst er observert ved S1 = 250 MS hvor atrieflimmer til ventrikkel ledning er observert. Merk at atrieflimmer kan brukes til å bestemme SNRT (tid til sinus node utladning, etter å ha startet ekstern pacing). Nederst: som S1 syklus lengden er redusert til 205 MS, ledning til ventrikkel svikter. (D) topp: Epicardial pacing (S1 − S2) for å identifisere VERP; vellykket fangst er observert ved S1 = 450 MS, S2 = 300 MS. bunn: som S2 syklus lengden er redusert til 250 MS, ventrikkel vevet ikke klarer å fange. (E) atrieflimmer (S1 − S2) for å identifisere AVNERP. Topp: vellykket fangst er observert ved S1 = 450 MS, S2 = 200 MS. bunn: som S2 syklus lengden er redusert til 199 MS, ledning til ventrikkel svikter. Blå piler angir tempo topper, røde piler angir Capture (' C') eller no Capture (' NC '). S1 − S1 = dynamisk tempo, S1 − S2 = extrastimulus pacing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figur 4: optiske data under sinus rytme og ventrikkel atrieflimmer. Venstre: representative bilder av et fargestoff lastet gris hjerte (VM = spenning, RH237; Ca = kalsium, Rhod2), fremre visning. Romlig filtrert transmembrane penning og intracellulære kalsium fluorescerende signaler fra en gris hjerte under sinus rytme (Center). Spenning og kalsium signaler under ventrikkel atrieflimmer (høyre). Signal region størrelser (15 x 15 piksler = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kjerne størrelse) representert som røde og blå firkanter. Units = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figur 5: optiske data fra Langendorff-perfusert gris hjerter. Ubehandlet, romlig filtrert (A) transmembrane spenning og (B) intracellulære kalsium fluorescens signaler fra høyre og venstre ventriklene under elektrisk pacing på toppen. Ufiltrert, romlig gjennomsnitt signaler skildre optisk handling potensialer og kalsium transienter fra områder av interesse (signal enheter er ΔF/F). (C) en overlapping av normalisert transienter illustrerer handling potensial-kalsium forbigående koblingstid (low-pass filtrert på 75 Hz). (D) prosessering signaler over epicardial overflaten for å generere isochronal kart over timelige parametre, inkludert aktiveringstid (tact) og 80% repolarisasjon tid. (E) elektriske og kalsium transient restitusjon kurver generert ved flere frekvenser (til venstre) med statistisk analyse (til høyre) for å illustrere lengre repolarisasjon tid ved lavere tempo syklus lengder. Skala barer = Mean ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kjemiske</td>
			<td>Formel</td>
			<td>Molekylær vekt</td>
			<td>finans</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumklorid</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58,44</td>
			<td>5,26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium gluconate</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218,14</td>
			<td>5,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium acetate trihydrat</td>
			<td>C2H3NaO2• 3h2O</td>
			<td>136,08</td>
			<td>3,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalium klorid</td>
			<td>KCl</td>
			<td>74,55</td>
			<td>0,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium klorid (vannfri)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95,21</td>
			<td>0,1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4% natrium bikarbonat</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84,01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182,17</td>
			<td>16,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium sulfat</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120,37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7,4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>OSMOLARITETSSYSTEM (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: modifisert del Nido ' s cardioplegia oppskrift.

Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Målet med denne studien var å etablere en metode for å undersøke CARDIAC dynamikk ved hjelp av en translational dyr modell. Den beskrevne eksperimentelle tilnærmingen inkorporerer dual-utslipp optocardiography i forbindelse med en elektrofysiologisk studie for å vurdere elektrisk aktivitet i en isolert, intakt svin hjerte modell.

Optocardiography og elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-perfusert Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Kardiovaskulær funksjonsfeil er den ledende dødsårsaken over hele verden. Den isolerte hjertemodellen som vi presenterer her kan tjene som et eksperimentelt vindu til menneskelig hjertedynamikk. Denne tilnærmingen kombinerer en klassisk elektrofysiologistudie med samtidig optisk kartlegging av transmembranespenning og intercellulært kalsium for å evaluere hjertets tilstand.Denne metodikken kan brukes på sykdomsmodellering, farmakologi og toksikologistudier. For eksempel karakteriserer et av våre fokusområder effekten av glassstørrelser på hjerteelektrofysiologi. Selv om denne metodikken er mer teknisk utfordrende enn en protokoll som benytter en mindre dyremodell, er protokollen samlet sett relativt grei når alle brikkene er på plass.Det er vanskelig å beskrive alle komponentene i et bilde- og perfusjonssystem med tekst, så visuell demonstrasjon av denne prosessen vil bidra til å reprodusere et vellykket preparat. Etter å ha isolert hjertet med den stigende aorta intakt, stup det utskåret organet i iskald kardioplegi og bruk et par hemostater for å gripe veggen av aorta. Sett fartøyet på en ribbet kanyle festet til rør koblet til en liter iskald kardioplegi medium suspendert ca 95 centimeter over hjertet.La væsken fylle aortaen til fartøyet renner over for å hindre at bobler kommer inn i vaskulaturen og bruker navlestrengtape for å feste aortaen til kanylen. Bind hemostatene for å bære hjertets vekt når den henger fra kanylen for å sikre vevet ytterligere og la det kalde mediet retrogradere perfuse hjertet ved et konstant trykk på 70 millimeter kvikksølv ved tyngdekraften. Overfør høre til 37 grader Celsius Langendorff-systemet uten å introdusere luft i kanylen.Og la den normale sinusrytmen skylle vaskulaturen til gjenværende blod og kardioplegi. I tilfelle sjokkerende arytmier, plasser eksterne padleårer på toppen og bunnen av hjertet for å defibrillere orgelet, og gir et enkelt sjokk på fem joules og øker i fem joule trinn til 50 joules, kardioversjon eller usjokkerbar rytme oppnås. Skyll deretter hjertet med minst en liter modifisert Krebs-Henseleit medium uten resirkulering for å fjerne gjenværende blod og kardioplegi.Når mediet går klart gjennom hjertet, lukk den sirkulerende sløyfen for å resirkulere perfusat. For å registrere en standard føre til EKG gjennom hele studiet, fest en 29-gauge nålelektrode til ventrikulært epiardium nær toppunktet og fest en annen elektrode i høyre atrium. Koble de positive og negative inngangene til en differensialbioamplifier til henholdsvis toppunktet og høyre atrium, og fest en bipolar stimulanselektrode til høyre atrium og en annen bipolar stimulanselektrode til den laterale venstre ventrikkelen for pacing formål.Tempo hjertet ved hjelp av en elektrofysiologi stimulator, med den første strømmen satt til to ganger diastolisk terskel og en ett millisekund pulsbredde. For å identifisere tempoterskelen, bruk en serie på en til to-milliamp stimulus impulser med en ett millisekundpulsbredde ved definerte temposykluslengder for å sikre en konsekvent stimulansrespons. Utfør ekstra stimulans pacing ved hjelp av enten en S1, S1 eller S1, S2 pacing tog.Reduser S2 pacing-syklusen på hver trinn med 10 millisekunder til tempoet ikke fanger opp. Deretter, gå opp til nest siste pacing syklus lengde og redusere sykluslengder i ett millisekund intervaller for å bestemme den mest presise pacing syklus lengde før tap av fangst. For å etablere ventrikkel effektiv refraktær periode, bruk stimulanselektroden på den laterale venstre ventrikkelen for å identifisere det korteste S1, S2-intervallet hvor S2 for tidlig slag initierer ventrikulær depolarisering.For å definere Wenckebach sykluslengde, bruk stimulanselektroden til høyre atrium for å finne det korteste S1, S1-intervallet der en en-til-en atrioventrikulær ledning forplanter seg via den normale ledningsbanen. For å definere sinus node utvinning tid, bruk stimulanselektroden til høyre atrium for å bruke en S1, S1 pacing tog og måle tidsforsinkelsen mellom den siste impulsen i pacing toget og utvinning av spontan sinoatrial node mediert aktivitet. For å etablere atrioventrikulær node effektiv ildfast periode, bruk stimulanselektroden på høyre atrium.Finn det korteste S1, S2 koblingsintervallet der den for tidlige atriestimuleringen etterfølges av et Hisbundle-potensial som fremkaller et QRS-kompleks, noe som betyr ventrikulær depolarisering. For optisk kartlegging av transmembranespenningen og intracellulært kalsium, legg først sakte opp til fem milliliter nylaget spenningsfargestoff proksimalt til aorta cannula etterfulgt av den langsomme tilsetningen av nylaget kalsiumfargestoff. Deretter plasserer du bildemaskinvaren for å fokusere på et passende synsfelt og koble kameraet til en arbeidsstasjon.Hent bilder ved hjelp av den valgte programvaren med en eksponeringstid på 5 til to millisekunder. Og utføre en bildejustering ved hjelp av programvare som kan splitte og overlegge de ønskede områdene og vise en gråtone subtraksjon eller pseudo-farge tillegg til noen høydepunkt feiljusteringer. Med omgivelsesbelysningen minimert, test LED-lysene for å sikre en jevn og maksimal episkarmial belysning, som bestemt av sensorens brønndybde.Deretter kan du se myokardiet under sinusrytmen, ventrikulær fibrillering eller dynamisk tempo ved hjelp av stimuleringselektroden plassert på venstre ventrikkel, som begynner med en temposykluslengde på 350 millisekunder og reduseres med 10 til 50 millisekunder for å generere restitusjonskurver. For å bekrefte oppkjøpet av et optisk signal om kvalitet gjennom hele eksperimentet, åpne en videofil, velg en interesseregion og plott den gjennomsnittlige fluorescens over tid. På slutten av eksperimentet, fjern hjertet fra systemet og tøm perfusate.Skyll deretter systemslangen og kamrene med renset vann. For rutinemessig vedlikehold, skyll systemet med vaskemiddelløsning med jevne mellomrom etter behov. I disse representative studiene ble prosedyren utført på intakte modeller, som demonstrert, som varierte i størrelse fra 2,5 til 10,5 kilo kroppsvekt og 18 til 137 gram hjertevekt.Etter å ha overført det isolerte hjertet til et Langendorff-system, stabiliserer hjertefrekvensen seg til ca. 70 slag per minutt innen ca. 10 minutter etter defibrillering og forblir konstant gjennom hele studiet. En gjennomsnittlig strømningshastighet på ca. 184 milliliter per minutt måles vanligvis. Det bremser til 70 milliliter per minutt etter perfusing med oppvarmet medium som inneholder en mekanisk uncoupler.Bly to EKG kan registreres gjennom hele studiens varighet under sinusrytme eller som svar på ekstern tempo for å kvantifisere elektrofysiologiske parametere. Optiske kartleggingseksperimenter kan også utføres under sinusrytmen og spontan ventrikulærflimmer. Representative bilder av et fargelastet hjerte kan oppnås med tilsvarende optiske handlingspotensialer.Og kalsiumtransienter kan samles fra to områder av interesse på den episeksuelle overflaten. I tillegg kan dynamisk epiardial tempo brukes under de optiske kartleggingseksperimentene for å normalisere eventuelle små forskjeller i de indre hjertefrekvensene. Råsignalene kan brukes til å skildre virkningen potensiell kalsiumtransient koblingstid, aktiverings- og varighetstid, og elektrisk og kalsiumreitusjon.Det er viktig å unngå å tillate bobler å komme inn i aorta, for å minimere tidspunktet for overføring fra dyret til systemet, og for å støtte det større hjertet. Elektrofysiologi og optiske signaldata kan analyseres etter oppkjøpet. I tillegg kan hjertet bevares etter studien for histologi, immunsmakende eller genuttrykksanalyse.Vi bruker denne teknikken til å karakterisere juvenil hjerteutvikling og for å undersøke virkningen av miljøeksponeringer på hjertefysiologi. De mekaniske uncouplers brukes til å minimere bevegelse og anti-skum kjemikalier som brukes til å løse albumin skummende er begge giftige, så bruk av riktig personlig verneutstyr er helt avgjørende.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Prosedyre for menneske saphena Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusjons og ekstern forsterkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validering av Nanobody og antistoff Based<em&gt; I Vivo</em&gt; Tumor Xenotransplantat NIRF-bildebehandling Eksperimenter i Mus Bruke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrisystemer og Mikros

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Levende Imaging av Lung Metastase og deres mikromiljøet

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten dyr modell av Ex Vivo Normothermic lever perfusjon

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Virkningen av Intracardiac Neurons Cardiac Electrophysiology og Arrhythmogenesis i en Ex Vivo Langendorff System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Slicing og culturing gris hjerter under fysiologiske forhold

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...