Name: optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00
Duration: 9 min 52 s
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Os autores reconhecem com gratidão o Dr. Matthew Kay por orientação experimental útil, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL139472 para NGP, R01 HL139712 para NI), Children's Research Institute, Children's National Heart Institute e Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation.

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora os modelos de pesquisa cardiovascular variem das preparações celulares a in vivo, há um trade-off inerente entre relevância clínica e utilidade experimental. Neste espectro, o coração isolado Langendorff-perfundido continua a ser um compromisso útil para estudar a fisiologia cardíaca48. Todo o modelo cardíaco representa um nível mais elevado de integração funcional e estrutural do que monocamadas unicelulares ou de tecido, mas também evita as complexidades de confusão associadas aos modelos in vivo. Uma grande vantagem durante os experimentos de mapeamento óptico duplo é que a superfície epicardial do coração isolado pode ser observada, e imagens de fluorescência do potencial da transmembrana e manuseio de cálcio podem ser usadas para monitorar a fisiologia cardíaca34.
Os modelos de roedores são mais comumente usados para preparações cardíacas isoladas em oposição a animais maiores, em parte devido ao custo associado de up-sizing todos os elementos envolvidos (por exemplo, volume de solução, circuito de perfusão, quantidade de corantes e não acopladores mecânicos) juntamente com maior instabilidade e propensão para arritmias em animais maiores10,36,49. Uma vantagem para o uso de corações de porco é que eles se assemelham ao coração humano em estrutura, tamanho e taxa de contração, portanto, mais precisamente modelagem parâmetros hemodinâmicos como o fluxo sanguíneo coronariano e saída cardíaca. Da mesma forma, humanos e suínos têm manuseio de cálcio semelhante, intervalos de eletrocardiograma37,e morfologia potencial de ação, incluindo os canais subjacentes que representa12,50,51, 52. Este protocolo descreve em detalhes as etapas para a criação de um modelo animal grande reproduzível para caracterizar de forma abrangente a função do miocárdio. Imagens simultâneas de tensão transmembrana (RH237) e cálcio intracelular (Rhod2), utilizadas em conjunto com protocolos eletrofisiológicos estabelecidos, proporcionam a oportunidade de identificar mecanismos responsáveis por alterações cardíacas Função. A metodologia descrita pode ser usada para testes de segurança pré-clínicos, rastreamento toxicológico e investigação de patologias genéticas ou outras doenças. Além disso, a metodologia descrita pode ser modificada e adaptada para uso com outros modelos cardíacos (por exemplo, canino, humano), dependendo do foco específico da pesquisa53,54,55.
Há algumas modificações críticas a manter-se na mente ao transição de um modelo menor do roedor a um modelo maior do porco para preparações isoladas, inteiras do coração. Durante a preparação e configuração, recomendamos adicionar albumina ao perfusato para manter a pressão oncoética e reduzir o edema (mais antiespuma, se necessário)56,57,58,59. Além disso, perfusate contendo albumina também pode ajudar em estudos metabólicos que também exigem suplementação de ácidos graxos para a mídia60,61. Ao contrário dos corações do roedor, o coração maior do porco não precisa de ser submerso em meios mornos devido a sua relação menor da superfície à volume e ao volume aumentado de meios aquecidos que fluem através das embarcações coronárias que mantêm melhor a temperatura. Como observado anteriormente, colocamos sondas de temperatura dentro do ventrículo direito e na superfície epicardial de ventrículos direito e esquerdo, observando apenas pequenas flutuações de temperatura de 1 a 2 °C em todos os três locais ao longo do estudo. Importante, tais taxas de fluxo mais rápidas podem igualmente aumentar a probabilidade das bolhas e de um embolim potencial. Para contornar este problema, recomendamos o uso de uma armadilha de bolha com tubos de perfuração grande levando direto para a cânula da aorta. Da mesma forma, achamos mais útil ter dois indivíduos trabalhando em conjunto para cannular a aorta em um coração maior (e mais pesado): uma pessoa para manter a aorta aberta com hemostats resistentes e outra para garantir a aorta para a cânula usando fita umbilical. Na metodologia descrita, verificou-se que a perfusão com cardioplegia e desfibrilação foram vitais para a recuperação cardíaca, o que é contrário às preparações cardíacas de roedores. Em nossa experiência, apenas alguns corações extridos retomaram a atividade normal orientada pelo sinuoso sem cardioversão.
Para melhorar os pontos finais de imagem óptica, uma preparação cardíaca suspensa limitou o efeito do brilho que pode ocorrer com um coração submerso. Além disso, o coração pendurado também evita qualquer compressão ou comprometimento dos vasos coronarianos no aspecto posterior do coração que pode ocorrer ao colocar o coração para baixo horizontalmente para imagens verticais. Também descobrimos que carregar corantes fluorescentes após a armadilha da bolha (perto da cânula da aorta) melhorou muito a coloração de tecido e os sinais ópticos. Finalmente, para melhorar os desfechos da eletrofisiologia cardíaca, o uso de um eletrodo de estimulação coaxial maior facilitou o ritmo atrial bem sucedido. Embora descrevamos o uso de eletrocardiogramas para identificar a captura e a perda de captura para vários parâmetros de EP, cateteres intracardíacos ou eletrodos de gravação bipolar também podem ser usados.
Nosso estudo foi focado no desenvolvimento de uma metodologia para mapeamento óptico duplo e avaliação eletrofisiológica cardíaca em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto. Devido a semelhanças com o coração humano juvenil, o coração suíno continua a ser um modelo popular para estudos focados em cardiologia pediátrica ou defeitos cardíacos congênitos. É importante ressaltar que a abordagem descrita pode ser adaptada para uso com corações adultos de maior porte e/ou diferentes espécies de interesse. De fato, outros laboratórios podem achar que o uso de corações caninos ou humanos (doador ou doente) são mais aplicáveis para seu foco de pesquisa específico53,54,55. Outra limitação potencial para este estudo é o uso de um desacoplador mecânico para reduzir o artefato de movimento durante a imagem. Blebbistatin tornou-se o desacoplador de escolha em aplicações de imagem cardíaca devido aos seus efeitos mínimos sobre os parâmetros de ECG, ativação e refratários períodos41,62,63. BDM é uma escolha menos cara, que pode ser particularmente importante em grandes estudos com animais que exigem maiores volumes de desacoplado perfusato e mecânico, mas é conhecido por ter um maior impacto sobre as correntes de potássio e cálcio que podem alterar o potencial de ação morfologia64,65,66,67. Se bdm é usado, note que apd encurtamento aumenta a vulnerabilidade corações para choque induzida arrythmias68. Por outro lado, a principal limitação ao uso de blebbistatin é sua fotossensibilidade e fototoxicidade, embora formulações alternativas que reduziram esses efeitos69,70,71. Finalmente, a metodologia descrita utiliza um único sistema de câmera para dupla experimentação de mapeamento óptico, mas é importante notar que estudos de pesquisa focados na fibrilação ventricular e/ou rastreamento de ondas elétricas em toda a superfície epicardial precisaria musterio essa abordagem para incluir imagens panorâmicas tridimensionais, conforme descrito por outros15,19,72,73,74,75 .

A doença cardiovascular é uma das principais causas de doença e morte em todo o mundo. Como tal, um foco de pesquisa primária é otimizar metodologias que podem ser usadas para estudar a fisiologia cardíaca normal e mecanismos subjacentes que podem contribuir para a morbidade e mortalidade em seres humanos. A pesquisa cardiovascular básica tem tradicionalmente contado com pequenos modelos animais, incluindo roedores e coelhos1,2,3,devido à disponibilidade de espécies geneticamente modificadas4,5, menor custo, menor pegada experimental e maior rendimento. No entanto, o uso de um modelo de porco tem o potencial de fornecer dados mais clinicamente relevantes6. De fato, estudos anteriores documentaram semelhanças na eletrofisiologia cardíaca (EP) entre humanos e suínos, incluindo correntes de íons semelhantes7,ação potencial forma8, e respostas ao teste farmacológico9. Além disso, o coração suíno tem cinética contéci e relaxamento que são mais comparáveis aos seres humanos do que roedores ou coelhos10. Em comparação com um modelo canino, a anatomia coronariana porsina mais se assemelha a um coração humano11,12 e é o modelo de escolha para estudos focados no desenvolvimento cardíaco, cardiologia pediátrica e/ou defeitos cardíacos congênitos 13.Embora existam diferenças entre o porco eo coração humano8, essas semelhanças fazem o coração suíno um modelo valioso para a pesquisa cardiovascular14.
A perfusão retrógrada do coração tornou-se um protocolo padrão para estudar a dinâmica cardíaca ex vivo15 desde a primeira estabelecida por Oskar Langendorff16. Assim, a perfusão de Langendorff pode ser usada para suportar um coração isolado e intacto na ausência de influências autonônicas. Este modelo é uma ferramenta útil para comparar diretamente a eletrofisiologia cardíaca e a contratilidade entre corações saudáveis e não saudáveis. Uma vez que a dinâmica cardíaca é temporal e espacialmente complexa, uma ligeira alteração em uma região pode afetar drasticamente a capacidade do coração inteiro de trabalhar como um sincicamente17. Portanto, imagens de alta espaçotemporal de corantes sensíveis ao parâmetro é uma ferramenta útil para monitorar a função cardíaca em toda a superfície do coração18,19. De fato, a dupla imagem simultânea de sondas fluorescentes sensíveis à tensão e ao cálcio permite a avaliação da atividade elétrica, manuseio de cálcio e acoplamento de contração de excitação no nível do tecido20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusão e/ou técnicas de mapeamento óptico têm sido usadas anteriormente para documentar o declínio do desempenho cardíaco devido ao envelhecimento ou mutações genéticas, e para avaliar a segurança de agentes farmacológicos ou exposições ambientais29 30,31,32,33.
No ajuste clínico, um estudo cardíaco invasor da eletrofisiologia é usado frequentemente para investigar distúrbios do ritmo cardíaco, identificar patologias, e identificar opções possíveis do tratamento. Da mesma forma, descrevemos um protocolo de EP que pode ser usado para avaliar a função do nó sinuoso, medir a condução atrioventricular e identificar a refratação do tecido do miocárdio. O estudo de EP descrito pode ser realizado em conjunto com mapeamento óptico, ou optocardiografia34,para caracterizar totalmente a fisiologia cardíaca em corações isolados. No protocolo descrito, a imagem latente da fluorescência da resolução spatiotemporal elevada foi executada com uma combinação de corantes da tensão (RH237) e do cálcio (Rhod-2AM) em uma configuração dupla da emissão. Além disso, os parâmetros de eletrofisiologia cardíaca foram monitorados o ritmo do sinuoso e em resposta à estimulação elétrica programada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560-5MG</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-100G</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog signal interface</td>
			<td>emka Technologies</td>
			<td>itf16USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5758-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula, 5/16&#8221;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45509-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430641U-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>C77-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, sCMOS</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Zyla 4.2 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coaxial stimulation electrode (atria)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrillator</td>
			<td>Zoll</td>
			<td>M Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T660lpxrxt-UF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DP-304A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, calcium</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET585/40m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, voltage</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET710lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP stimulator (Bloom)</td>
			<td>Fisher Medical</td>
			<td>DTU-215B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>CT510/60bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lights</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SOLIS-525C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8147K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cartridge, polypropylene</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>PD-5-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter housing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9979T21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow transducer</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>ME6PXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemofilter</td>
			<td>Hemocor</td>
			<td>HPH 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>423-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-bore tubing, I.D. 3/8&#8221;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-169-7H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>DO-5095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image Alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm</td>
			<td>AD Instruments Inc.</td>
			<td>MLA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Humbug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>PolyStan</td>
			<td>A/S 1481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir, 2 liter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-34541-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2-AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode (ventricle)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical</td>
			<td>890186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing flow console</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>J0025UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath/circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89400-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage shears</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8448</td>
			<td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Dalwha Corp. Ltd.</td>
			<td>BA2ALD001</td>
			<td>Model: 200 Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7476</td>
			<td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8960</td>
			<td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8985</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>14.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501747</td>
			<td>11.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8980</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8828</td>
			<td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pediatric cross clamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7660</td>
			<td>Cooley-Derra Clamp 6.25&#34; 5mm Calibrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right angle forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501240</td>
			<td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>549-4</td>
			<td>Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8380</td>
			<td>Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Serrated forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500363</td>
			<td>Dressing Forceps 15.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamp</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501700</td>
			<td>Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner retractor</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501314</td>
			<td>Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2x3 Sharp Prongs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 prolene suture</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel loop</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>011001PBX</td>
			<td>Sterion&#174; Vessel Loop, 0.8 x 406mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardioplegia (Plegisol)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409-7969-05</td>
			<td>Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>300 U/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and Needle</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>60mL &#38; 18G respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>U12T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts

Pequenos modelos animais são mais comumente usados em pesquisas cardiovasculares devido à disponibilidade de espécies geneticamente modificadas e menor custo em comparação com animais maiores. No entanto, mamíferos maiores são mais adequados para questões de pesquisa translacional relacionadas à fisiologia cardíaca normal, fisiopatologia e testes pré-clínicos de agentes terapêuticos. Para superar as barreiras técnicas associadas ao emprego de um modelo animal maior em pesquisas cardíacas, descrevemos uma abordagem para medir parâmetros fisiológicos em um coração de leitão isolado, perfundido em Langendorff. Essa abordagem combina duas poderosas ferramentas experimentais para avaliar o estado do coração: estudo de eletrofisiologia (EP) e mapeamento óptico simultâneo de tensão transmembrana e cálcio intracelular usando corantes sensíveis ao parâmetro (RH237, Rhod2-AM). As metodologias descritas são adequadas para estudos translacionais que investigam o sistema de condução cardíaca, alterações na morfologia potencial de ação, manuseio de cálcio, acoplamento de excitação-contração e incidência de alternans cardíacos ou Arritmias.

A figura 1A mostra um diagrama do sistema isolado da perfusão cardíaca, que inclui o circuito da tubulação, a bomba, o filtro, o oxygenator, os reservatórios e os elementos de aquecimento. A colocação do ECG (configuração de chumbo II) e eletrodos de ritmo é mostrada na Figura 1B,e a configuração de imagem é retratada na Figura 1C. Um esquema dos componentes ópticos e caminhos de luz são mostrados na Figura 1D.
Estudos experimentais foram realizados em intactos, corações inteiros isolados de porcos juvenis de Yorkshire (14 a 42 dias, n = 18) que variaram em tamanho de 2,5 a 10,5 kg de peso corporal e 18 a 137 g de peso cardíaco (Figura 2A). Depois de transferir o coração isolado para um sistema Langendorff (37 °C), a frequência cardíaca estabilizou para 70 ± 4,5 bpm (média ± SEM) dentro de ~ 10 min de desfibrilação e permaneceu constante durante toda a duração do estudo (Figura 2B). Foi medida uma taxa média de fluxo de 184 ± 17 mL/min (média ± SEM), que diminuiu para 70 ± 7,5 mL/min após perfusão com mídia aquecida contendo um desacoplador mecânico (Figura 2C).
Os ECGs de chumbo II foram registrados ao longo da duração do estudo durante o ritmo do sinusite(Figura 3A)ou em resposta ao ritmo externo(Figura 3B-E)para quantificar parâmetros eletrofisiológicos. Para avaliação do EP, o ritmo dinâmico (S1-S1) foi aplicado ao átrio direito para identificar o WBCL e o SNRT (tempo de recuperação após o início do S1-S1, Figura 3C),onde o WBCL foi denotado como o PCL mais curto que iniciou a julgamento à condução ventricular. Um protocolo de estimulação S1-S2 foi implementado usando um eletrodo de estímulo bipolar no ventrículo esquerdo, a fim de identificar o menor intervalo de acoplamento que iniciou a despolarização ventricular, identificando assim o VERP (Figura 3D). Alternativamente, um protocolo de ritmo atrial S1-S2 é aplicado para identificar AVNERP (S1-S2), como mostrado na Figura 3E. Exemplos representativos de parâmetros de eletrofisiologia do coração de porco se alinham estreitamente com os37publicados anteriormente.
Experimentos de mapeamento óptico foram realizados durante o ritmo do sinusite, fibrilação ventricular espontânea (Figura 4),ou durante o ritmo dinâmico (S1-S1) do ventrículo esquerdo (LV) para gerar curvas elétricas e de restituição de cálcio descritas em Figura 5. Imagens representativas de um coração de leitão carregado de corante são mostradas na Figura 4 com potenciais de ação óptica correspondentes (Vm) e transientes de cálcio (Ca) coletados de duas regiões de interesse na superfície epicardial (ventrículo direito [RV] = azul, LV = vermelho) . Sinais não processados são exibidos durante o ritmo do sinuoso e durante a fibrilação ventricular. Como mencionado anteriormente, o ritmo dinâmico de epicardial (S1-S1) também foi usado durante experimentos de mapeamento óptico para normalizar qualquer pequena diferença na frequência cardíaca intrínseca (Figura 5A-E). Sinais brutos são exibidos (RV = azul, LV = vermelho), que foram usados para descrever o potencial de ação - tempo de acoplamento transitório de cálcio (Figura 5C),ativação e tempo de duração(Figura 5D),restituição elétrica e cálcio (Figura 5E). Para preparações de miocárdio espessa, filtragem espacial com tamanho de kernel ~ 3 mm x 3 mm é apropriado para potencial de ação epicardial ou análise transitória de cálcio19,47. Assim, imagens de alta resolução espacial (na configuração descrita 1240 x 1024 total, ou 620 x 512 por canal, 6,5 μm tamanho pixel) são muitas vezes espacialmente binned durante ou pós-aquisição (Figura 5C). O processamento de imagem pode ser realizado para gerar mapas de ativação e repolarização usando algoritmos personalizados23,33,43,45 ( Figura3D),com o tempo de ativação de cada pixel no coração foi definido como o derivado máximo do potencial de ação ou do upstroke transitório de cálcio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figura 1: Configuração experimental. (A)Diagrama do sistema isolado de perfusão cardíaca; setas denotam a direção do fluxo. (B) Um coração cannulado é mostrado com colocação de eletrodos. RA = atria direita, RV = ventrículo direito, LV = ventrículo esquerdo, ECG = eletrocardiograma de chumbo II. (C)A plataforma de imagem nas proximidades do tecido cardíaco. (D)A emissão de cada sonda complementar (tensão, cálcio) é separada por comprimento de onda usando um dispositivo de divisão de imagem com filtros de emissão apropriados e espelho dicroico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figura 2: Peso cardíaco, taxa e medidas de fluxo. (A)Peso cardíaco em relação ao peso corporal para cada leitão utilizado no estudo (n = 18). (B) Frequência cardíaca medida ~10 min após desfibrilação e novamente no final do estudo (aproximadamente 1 h). (C) O fluxo coronariano cai vertiginosamente após a perfusão com um desacoplar mecânico (+BDM) devido à redução da demanda de oxigênio. Barras de escala representam média ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figura 3: Exemplos representativos de gravações de eletrocardiograma de chumbo II coletadas durante o ritmo do sinusite ou em resposta ao ritmo externo. (A)Ritmo sinusa normal. (B) Exemplo de epicardial andando na duração do ciclo de 400 ms (S1-S1), que foi usado para experimentos de imagem. (C)Top: Atrial ritmo para identificar WBCL; captura bem sucedida é observada em S1 = 250 ms em que atrial para condução ventricular é observada. Note-se que o ritmo atrial pode ser usado para determinar SNRT (tempo para sinus node descarga, depois de iniciar o ritmo externo). Inferior: Como a duração do ciclo S1 é reduzida para 205 ms, a condução para o ventrículo falha. (D)Top: Epicardial andando (S1-S2) para identificar VERP; Captura bem sucedida é observada em S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Bottom: Como o comprimento do ciclo S2 é reduzido para 250 ms, o tecido ventricular não consegue capturar. (E)Atrial pacing (S1-S2) para identificar AVNERP. Top: Captura bem sucedida é observada em S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. Bottom: Como a duração do ciclo S2 é reduzida para 199 ms, a condução para o ventrículo falha. As setas azuis denotam picos de ritmo, setas vermelhas denotam captura ('C') ou nenhuma captura ('NC'). S1-S1 = ritmo dinâmico, S1-S2 = ritmo extraestímulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figura 4: Dados ópticos durante o ritmo do sinuoso e fibrilação ventricular. Esquerda: Imagens representativas de um coração de porco carregado de corantes (Vm = tensão, RH237; Ca = cálcio, Rhod2), vista anterior. Tensão transmembrana filtrada espacialmente filtrada e sinais fluorescentes intracelulares de cálcio de um coração de porco durante o ritmo do sinuoso (Centro). Sinais de tensão e cálcio durante a fibrilação ventricular (Direita). Tamanhos da região do sinal (15 x 15 pixels = 2.4 x 2.4 mm2,30 x 30 = 4.8 x 4.8 mm2 tamanho do kernel) representados como quadrados vermelhos e azuis. Unidades = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figura 5: Dados ópticos dos corações de porco sinuosos de Langendorff. Tensão transmembrana não processada, filtrada espacialmente(A)e(B)sinais intracelulares de fluorescência de cálcio da direita e da esquerda ventrículos durante o ritmo elétrico no ápice. Sinais não filtrados e espacialmente mediados retratam potenciais de ação óptica e transientes de cálcio de regiões de interesse (as unidades de sinal são ΔF/F). (C) Uma sobreposição de transientes normalizados ilustra o tempo de acoplamento transitório potencial-cálcio de ação (passe baixo filtrado a 75 Hz). (D)Processamento de sinais em toda a superfície epicardial para gerar mapas isocronais de parâmetros temporais, incluindo o tempo de ativação (tato)e 80% de tempo de repolarização. (E) Curvas de restituição transitória elétrica e cálcio geradas em múltiplas frequências (esquerda) com análise estatística (direita) para ilustrar tempo de repolarização mais longo em comprimentos mais lentos do ciclo de ritmo. Barras de escala = média ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Química</td>
			<td>Fórmula</td>
			<td>Peso molecular</td>
			<td>g/L G/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de sódio</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato de sódio</td>
			<td>C 6 H 11 Nao 7 C6H11Nao7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trihydrate do acetato de sódio</td>
			<td>C2H3NaO2•3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de potássio</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de magnésio (anidro)</td>
			<td>MgCl 2 MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4% Bicarbonato de sódio</td>
			<td>NaHCO 3 NahCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnésio</td>
			<td>MgSO 4 MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolaridade (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receita de cardioplegia de l Nido modificada.

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Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

O mau funcionamento cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. O modelo cardíaco isolado que apresentamos aqui pode servir como uma janela experimental para a dinâmica cardíaca humana. Esta abordagem combina um estudo de eletrofisiologia clássica com o mapeamento óptico simultâneo da tensão transmembrana e do cálcio intercelular para avaliar o estado do coração.Essa metodologia pode ser aplicada a estudos de modelagem de doenças, farmacologia e toxicologia. Por exemplo, uma de nossas áreas de foco é caracterizar os efeitos dos dimensionadores de vidro na eletrofisiologia cardíaca. Embora essa metodologia seja mais tecnicamente desafiadora do que um protocolo que utiliza um modelo animal menor, no geral, o protocolo é relativamente simples uma vez que todas as peças estão em vigor.É difícil descrever todos os componentes de um sistema de imagem e perfusão por texto, então a demonstração visual desse processo ajudará a reproduzir uma preparação bem sucedida. Depois de isolar o coração com a aorta ascendente intacta, mergulhe o órgão excisado em cardioplegia gelada e use um par de hemostatas para segurar a parede da aorta. Coloque o recipiente em uma cânula costelada presa a tubos ligados a um litro de meio cardioplegia gelado suspenso aproximadamente 95 centímetros acima do coração.Deixe o fluido encher a aorta até que o vaso transborde para evitar que quaisquer bolhas entrem na vasculatura e use fita umbilical para fixar a aorta na cânula. Amarre os hemostatos para suportar o peso do coração enquanto ele fica pendurado na cânula para proteger ainda mais o tecido e permitir que o meio frio para retrógrado perfume o coração a uma pressão constante de 70 milímetros de mercúrio pela gravidade. Transfira a ouvir para o sistema Langendorff Celsius de 37 graus sem introduzir ar na cânula.E permita que o ritmo sinusal normal dê descarga na vasculatura de qualquer sangue e cardioplegia restantes. Em caso de arritmias chocantes, coloque pás externas no ápice e na base do coração para desfibrilar o órgão, proporcionando um único choque em cinco joules e aumentando em cinco incrementos de joule até que 50 joules, cardioversão ou ritmo inalhockr é alcançado. Em seguida, lave o coração com pelo menos um litro de meio Krebs-Henseleit modificado sem recirculação para remover qualquer sangue residual e cardioplegia.Quando o meio correr livre pelo coração, feche o laço circulante para recircular o perfusado. Para registrar uma pista padrão ao ECG ao longo do estudo, conecte um eletrodo de agulha de 29 bitolas ao epicardium ventricular perto do ápice e conecte outro eletrodo no átrio direito. Conecte os insumos positivos e negativos de um bioamplificador diferencial ao ápice e ao átrio direito, respectivamente, e conecte um eletrodo de estímulo bipolar no átrio direito e um segundo eletrodo de estímulo bipolar ao ventrículo esquerdo lateral para fins de sossega.Acelere o coração usando um estimulador de eletrofisiologia, com a corrente inicial definida para o dobro do limiar diastólico e uma largura de pulso de um milissegundo. Para identificar o limiar de ritmo, aplique uma série de impulsos de estímulo de um a dois miliamperes com uma largura de pulso de um milissegundo em comprimentos de ciclo de ritmo definidos para garantir uma resposta consistente de estímulo. Realize um ritmo de estímulo extra usando um trem de ritmo S1, S1 ou S1, S2.Diminua o comprimento do ciclo de ritmo S2 em 10 milissegundos até que o ritmo não capture. Em seguida, pise até o penúltimo comprimento do ciclo de ritmo e diminua os comprimentos de ciclo em intervalos de um milissegundo para determinar o comprimento mais preciso do ciclo de ritmo antes da perda da captura. Para estabelecer o período refratário ventricular efetivo, utilize o eletrodo de estímulo no ventrículo esquerdo lateral para identificar o intervalo S1, S2 mais curto em que a batida prematura S2 inicia a despolarização ventricular.Para definir o comprimento do ciclo de Wenckebach, use o eletrodo de estímulo no átrio direito para encontrar o intervalo S1, S1 mais curto em que uma condução atrioventricular de um para um se propaga através da via de condução normal. Para definir o tempo de recuperação do nó sinusal, use o eletrodo de estímulo no átrio direito para aplicar um trem de ritmo S1, S1 e medir o atraso de tempo entre o último impulso no trem de ritmo e a recuperação da atividade mediada do nódulo sinoatrial espontâneo. Para estabelecer o nódulo arioventricular efetivo período refratário, use o eletrodo de estímulo no átrio direito.Encontre o intervalo de acoplamento S1, S2 mais curto no qual a estimulação atrial prematura é seguida por um potencial hisbundle que provoca um complexo QRS, significando despolarização ventricular. Para o mapeamento óptico da tensão transmembrana e do cálcio intracelular, primeiro adicione lentamente cinco mililitros de corante de tensão recém-preparado proximal à cânula aórtica seguida pela adição lenta de corante de cálcio recém-preparado. Em seguida, posicione o hardware de imagem para se concentrar em um campo de visão apropriado e conectar a câmera a uma estação de trabalho.Adquira imagens usando o software selecionado com um tempo de exposição de 5 a dois milissegundos. E realize um alinhamento de imagem com o auxílio de um software que pode dividir e sobrepor as regiões desejadas e exibir uma subtração em escala de cinza ou adição pseudocolorida a quaisquer desalinhamentos de destaque. Com a iluminação ambiente minimizada, teste as luzes LED para garantir uma iluminação épica uniforme e máxima, conforme determinado pela profundidade do sensor.Em seguida, imagem do miocárdio durante o ritmo sinusal, fibrilação ventricular ou ritmo dinâmico usando o eletrodo de estimulação posicionado no ventrículo esquerdo, começando com um comprimento de ciclo de ritmo de 350 milissegundos e diminuindo em 10 a 50 milissegundos para gerar curvas de restituição. Para confirmar a aquisição de um sinal óptico de qualidade durante todo o experimento, abra um arquivo de vídeo, selecione uma região de interesse e plote a fluorescência média ao longo do tempo. No final do experimento, remova o coração do sistema e drene o perfusado.Em seguida, enxágue o tubo do sistema e as câmaras com água purificada. Para manutenção de rotina, enxágue periodicamente o sistema com solução de detergente conforme necessário. Nesses estudos representativos, o procedimento foi realizado em modelos intactos, como demonstrado, que variaram em tamanho de 2,5 a 10,5 kg de peso corporal e 18 a 137 gramas de peso cardíaco.Depois de transferir o coração isolado para um sistema Langendorff, a frequência cardíaca estabiliza-se para cerca de 70 batimentos por minuto dentro de aproximadamente 10 minutos de desfibrilação e permanece constante durante toda a duração do estudo. Uma taxa média de fluxo de aproximadamente 184 mililitros por minuto é tipicamente medida. Ele desacelera para 70 mililitros por minuto depois de perfusar com meio aquecido contendo um desacoplador mecânico.Os ECGs de chumbo podem ser registrados ao longo da duração do estudo durante o ritmo sinusal ou em resposta ao ritmo externo para quantificar os parâmetros eletrofisiológicos. Experimentos de mapeamento óptico também podem ser realizados durante o ritmo sinusal e fibrilação ventricular espontânea. Imagens representativas de um coração carregado de corante podem ser obtidas com os potenciais de ação óptica correspondentes.E transitórios de cálcio podem ser coletados de duas regiões de interesse na superfície epicárardial. Além disso, o ritmo épico dinâmico pode ser usado durante os experimentos de mapeamento óptico para normalizar quaisquer pequenas diferenças nas frequências cardíacas intrínsecas. Os sinais brutos podem ser usados para retratar o tempo de acoplamento transitório de cálcio potencial de ação, o tempo de ativação e duração, e a restituição elétrica e de cálcio.É importante evitar permitir que bolhas entrem na aorta, minimizar o tempo de transferência do animal para o sistema, e apoiar o coração maior. Os dados de eletrofisiologia e sinal óptico podem ser analisados após a aquisição. Além disso, o coração pode ser preservado após o estudo para histologia, imunostaining ou análise de expressão genética.Estamos usando essa técnica para caracterizar o desenvolvimento cardíaco juvenil e examinar o impacto das exposições ambientais na fisiologia cardíaca. Os desacopladores mecânicos usados para minimizar o movimento e os produtos químicos anti-espuma usados para lidar com espuma de albumina são ambos tóxicos, por isso o uso do equipamento de proteção individual apropriado é absolutamente essencial.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Medicina

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

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Ex Infecção Vivo de tecido vivo com Vírus Oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

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Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...