Name: optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Авторы с благодарностью признают д-ра Мэтью Кей за полезное экспериментальное руководство, и Манелл Рамадан и Muhaymin Чоудхури за техническую помощь. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01HL139472 в NGP, R01 HL139712 в NI), Детским научно-исследовательским институтом, Детским национальным институтом сердца и Институтом детских хирургических инноваций имени Шейха Заида.

Авторам нечего раскрывать.

Хотя модели сердечно-сосудистых исследований варьируются от клеточных до препаратов in vivo, существует неотъемлемый компромисс между клинической актуальностью и экспериментальной полезностью. На этом спектре, изолированные Langendorff-перфированные сердца остается полезным компромиссом для изучения сердечной физиологии48. Вся модель сердца представляет собой более высокий уровень функциональной и структурной интеграции, чем монослои одной клетки или ткани, но также позволяет избежать сложностей, связанных с моделями in vivo. Основным преимуществом во время двойных оптических картографических экспериментов является то, что эпикардиальная поверхность изолированного сердца может наблюдаться, а флуоресцентная визуализация трансмембранного потенциала и обработки кальция может быть использована для мониторинга сердечной физиологии34.
Модели грызунов чаще всего используются для изолированных препаратов сердца, в отличие от крупных животных, отчасти из-за связанных с этим расходов на увеличение размера всех элементов,участвующих (например, объем раствора, перфузионная схема, количество красителей и механических разъемов) наряду с большей нестабильностью и склонностью к аритмии у крупных животных10,36,49. Одним из преимуществ использования свиных сердец является то, что они очень похожи на человеческое сердце по структуре, размеру и скорости сокращения, поэтому более точно моделируя гемодинамические параметры, такие как коронарный кровоток и сердечный выброс. Аналогичным образом, люди и свиньи имеют аналогичные обработки кальция, электрокардиограмма интервалы37, и действия потенциальной морфологии, включая основные каналы, которые он представляет12,50,51, 52. Этот протокол подробно описывает шаги по созданию воспроизводимой большой животной модели для всесторонней характеристики функции миокарда. Одновременное изображение трансмембранного напряжения (RH237) и внутриклеточного кальция (Rhod2), используемого в сочетании с установленными электрофизиологическими протоколами, дает возможность определить механизмы, которые отвечают за изменение сердечного Функции. Описанная методология может быть использована для доклинического тестирования безопасности, токсикологического скрининга и исследования генетических или других патологий заболеваний. Кроме того, описанная методология может быть изменена и адаптирована для использования с другими сердечными моделями (например, собачьими, человеческими) в зависимости от конкретного исследовательского фокуса53,54,55.
Есть несколько критических изменений, чтобы иметь в виду при переходе от меньшего модели грызунов к более крупной модели свиньи для изолированных, все сердца препаратов. Во время подготовки и установки, мы рекомендуем добавить альбумин в перфусат для поддержания онкотического давления и уменьшить отек (плюс антипены, если это необходимо)56,57,58,59. Кроме того, перфусат, содержащий альбумин может также помочь в метаболических исследований, которые также требуют жирных кислот добавок к средствам массовой информации60,61. В отличие от сердца грызунов, больше сердце свиньи не должны быть погружены в теплые носители из-за его меньшей поверхности к объему соотношение и увеличение объема разогретых носителей, протекающих через коронарные сосуды, которые лучше поддерживает температуру. Как отмечалось ранее, мы разместили температурные зонды внутри правого желудочка и на эпикардиальной поверхности как правого, так и левого желудочков, наблюдая лишь незначительные колебания температуры в размере 1,2 градуса Цельсия во всех трех местах на протяжении всего исследования. Важно отметить, что такие более быстрые скорости потока могут также увеличить вероятность пузырьков и потенциальной эмболии. Чтобы обойти эту проблему, мы рекомендуем использовать пузырь ловушку с большими трубками, ведущими прямо к аортной канюле. Аналогичным образом, мы сочли наиболее полезным иметь двух человек, работающих в тандеме, чтобы канюляции аорты на большем (и тяжелее) сердце; один человек, чтобы держать аорту открытым с крепкими hemostats и другой, чтобы обеспечить аорту в канулу с помощью пупочной ленты. В описанной методологии, мы обнаружили, что перфузия с кардиоплегией и дефибрилляции имеют жизненно важное значение для восстановления сердца, что противоречит препаратов сердца грызунов. По нашему опыту, лишь немногие вырезанные сердца возобновили нормальную синусовые действия без кардиоверсии.
Для улучшения оптических конечных точек изображения, подвесной препарат сердца ограничил эффект блики, которые могут возникнуть с погруженным сердцем. Кроме того, висячие сердца также избегает каких-либо сжатия или компромисса коронарных сосудов на задней аспект сердца, которые могут возникнуть при укладке сердца вниз горизонтально для вертикальной визуализации. Мы также обнаружили, что погрузка флуоресцентных красителей после пузырька ловушки (близко к аорты канюли) значительно улучшилось окрашивание тканей и оптических сигналов. Наконец, для улучшения конечных точек сердечной электрофизиологии, использование более крупного коаксиального электрода стимуляции способствовало успешному темпу предсердий. Хотя мы описываем использование электрокардиограмм для выявления захвата и потери захвата для различных параметров EP, интракардиальный катетеры или биполярные электроды записи также могут быть использованы.
Наше исследование было сосредоточено на разработке методологии двойного оптического картирования и сердечной электрофизиологической оценки в изолированной, нетронутой модели сердца. Из-за сходства с ювенильным человеческим сердцем, свиное сердце остается популярной моделью для исследований, ориентированных на детскую кардиологию или врожденные пороки сердца. Важно отметить, что описанный подход может быть адаптирован для использования с большим размером взрослых сердец и / или различных видов, представляющих интерес. Действительно, другие лаборатории могут обнаружить, что использование собачьих или человеческих сердец (либо доноров или больных) являются более применимыми для их конкретного исследования фокус53,54,55. Еще одним потенциальным ограничением для этого исследования является использование механического разъединения для уменьшения артефакта движения во время визуализации. Blebbistatin стал uncoupler выбора в сердечных приложений визуализации из-за его минимального воздействия на параметры ЭКГ, активации и огнеупорных периодов41,62,63. BDM является менее дорогостоящим выбором, который может быть особенно важным в крупных исследованиях на животных, которые требуют больших объемов перфузата и механического разъединения, но это, как известно, имеют большее влияние на калий и кальций токов, которые могут изменить потенциал действия морфология64,65,66,67. Если БДМ используется, обратите внимание, что сокращение APD увеличивает уязвимость сердца к шок-индуцированных арритмии68. И наоборот, основным ограничением к использованию блеббистатина является его фоточувствительность и фототоксичность, хотя альтернативные формулировки, которые уменьшили эти эффекты69,70,71. Наконец, описанная методология использует единую систему камер для двойного оптического картографирования экспериментов, но важно отметить, что исследования сосредоточены на фибрилляции желудочков и / или отслеживания электрических волн по всей эпикардиальной поверхности необходимо будет изменить этот подход, чтобы включить трехмерные панорамные изображения, как описанодругими 15,19,72,73,74,75 .

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной болезней и смерти во всем мире. Таким образом, основной исследовательский фокус заключается в оптимизации методологий, которые могут быть использованы для изучения нормальной сердечной физиологии и основных механизмов, которые могут способствовать заболеваемости и смертности у людей. Основные сердечно-сосудистые исследования традиционно опирались на мелкие модели животных, в том числе грызунов и кроликов1,2,3, в связи с наличием генетически модифицированных видов4,5, более низкой стоимости, меньше экспериментального следа, и более высокой пропускной всей. Тем не менее, использование модели свиней имеет потенциал, чтобы обеспечить более клинически значимые данные6. Действительно, предыдущие исследования документально сходства в сердечной электрофизиологии (EP) между людьми и свиньями, в том числе аналогичные ионные токи7, действие потенциальной формы8, и ответы на фармакологическое тестирование9. Кроме того, свиное сердце имеет сократительный и релаксации кинетики, которые более сопоставимы с людьми, чем либо грызунов или кроликов10. По сравнению с собачьей моделью, свиная коронарная анатомия больше напоминает сердце человека11,12 и является моделью выбора для исследований, ориентированных на развитие сердца, детскую кардиологию и/или врожденные пороки сердца 13. Хотя Есть различия между свиньей и человеческим сердцем8, эти сходства сделать свиное сердце ценную модель для сердечно-сосудистых исследований14.
Ретроградная перфузия сердца стала стандартным протоколом для изучения сердечной динамики ex vivo15 с момента первого создания Оскаром Лангендорфом16. Соответственно, Лангендорф-перфузия может быть использована для поддержки изолированного, нетронутого сердца при отсутствии вегетативных воздействий. Эта модель является полезным инструментом для непосредственного сравнения сердечной электрофизиологии и соотношения между здоровыми и нездоровыми сердцами. Поскольку сердечная динамика является как временной, так и пространственно сложной, небольшое изменение в одном регионе может резко повлиять на способность всего сердца работать как синцитий17. Таким образом, высокая пространственно-временной визуализации параметра чувствительных красителей является полезным инструментом для мониторинга сердечной функции по всей поверхности сердца18,19. Действительно, одновременные двойные изображения напряжения и чувствительных к кальцию флуоресцентных зондов позволяет оценить электрическую активность, обработку кальция и возбуждение-сокращение соединения на уровне ткани20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Лангендорф-перфузии и / или оптических методов картирования ранее были использованы для документирования снижения сердечной деятельности из-за старения или генетических мутаций, а также для оценки безопасности фармакологических агентов или воздействия на окружающую среду29 ,30,31,32,33.
В клинических условиях, инвазивные сердечной электрофизиологии исследование часто используется для исследования нарушений сердечного ритма, выявление патологий, и определить возможные варианты лечения. Аналогичным образом, мы описываем протокол EP, который может быть использован для оценки функции синусового узла, измерения атриовентрикулярной проводимости и определения огнеупорности ткани миокарда. Описанное исследование EP может быть выполнено в сочетании с оптическим картографией, или оптокардиографией34, чтобы полностью охарактеризовать физиологию сердца в изолированных сердцах. В описанном протоколе, высокое пространственно-временное разрешение флуоресценции изображения была выполнена с сочетанием напряжения (RH237) и кальция (Rhod-2AM) красителей в двойной установки выбросов. Кроме того, параметры сердечной электрофизиологии отслеживались как в синусовом ритме, так и в ответ на запрограммированную электрическую стимуляцию.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560-5MG</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-100G</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog signal interface</td>
			<td>emka Technologies</td>
			<td>itf16USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5758-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula, 5/16&#8221;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45509-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430641U-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>C77-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, sCMOS</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Zyla 4.2 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coaxial stimulation electrode (atria)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrillator</td>
			<td>Zoll</td>
			<td>M Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T660lpxrxt-UF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DP-304A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, calcium</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET585/40m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, voltage</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET710lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP stimulator (Bloom)</td>
			<td>Fisher Medical</td>
			<td>DTU-215B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>CT510/60bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lights</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SOLIS-525C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8147K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cartridge, polypropylene</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>PD-5-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter housing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9979T21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow transducer</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>ME6PXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemofilter</td>
			<td>Hemocor</td>
			<td>HPH 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>423-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-bore tubing, I.D. 3/8&#8221;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-169-7H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>DO-5095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image Alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm</td>
			<td>AD Instruments Inc.</td>
			<td>MLA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Humbug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>PolyStan</td>
			<td>A/S 1481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir, 2 liter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-34541-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2-AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode (ventricle)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical</td>
			<td>890186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing flow console</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>J0025UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath/circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89400-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage shears</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8448</td>
			<td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Dalwha Corp. Ltd.</td>
			<td>BA2ALD001</td>
			<td>Model: 200 Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7476</td>
			<td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8960</td>
			<td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8985</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>14.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501747</td>
			<td>11.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8980</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8828</td>
			<td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pediatric cross clamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7660</td>
			<td>Cooley-Derra Clamp 6.25&#34; 5mm Calibrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right angle forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501240</td>
			<td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>549-4</td>
			<td>Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8380</td>
			<td>Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Serrated forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500363</td>
			<td>Dressing Forceps 15.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamp</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501700</td>
			<td>Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner retractor</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501314</td>
			<td>Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2x3 Sharp Prongs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 prolene suture</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel loop</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>011001PBX</td>
			<td>Sterion&#174; Vessel Loop, 0.8 x 406mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardioplegia (Plegisol)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409-7969-05</td>
			<td>Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>300 U/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and Needle</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>60mL &#38; 18G respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>U12T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts

Мелкие модели животных чаще всего используются в сердечно-сосудистых исследованиях из-за наличия генетически модифицированных видов и более низкой стоимости по сравнению с более крупными животными. Тем не менее, крупные млекопитающие лучше подходят для трансляционных исследований вопросы, связанные с нормальной сердечной физиологии, патофизиологии, и доклинические испытания терапевтических агентов. Чтобы преодолеть технические барьеры, связанные с использованием более крупной модели животных в кардиологических исследованиях, мы описываем подход к измерению физиологических параметров в изолированном, Лангендорф-перфированном сердце поросенка. Этот подход сочетает в себе два мощных экспериментальных инструмента для оценки состояния сердца: исследование электрофизиологии (EP) и одновременное оптическое картирование трансмембранного напряжения и внутриклеточного кальция с использованием параметра чувствительных красителей (RH237, Rhod2-AM). Описанные методологии хорошо подходят для трансляционных исследований, исследующих систему сердечной проводимости, изменения в потенциальной морфологии действия, обработка кальция, соединение эксцитации-сокращение и частота сердечных переменных или Аритмии.

На рисунке 1A показана схема изолированной системы перфузии сердца, которая включает в себя трубную цепь, насос, фильтр, оксигенатор, резервуары и нагревательные элементы. Размещение ЭКГ (конфигурация свинца II) и темпэлектродов показано на рисунке 1B,а настройка изображения изображена на рисунке 1С. Схема оптических компонентов и световых путей показана на рисунке 1D.
Экспериментальные исследования были проведены на нетронутых, целые сердца изолированы от несовершеннолетних йоркширских свиней (14-42 дней, n No 18), которые варьировались в размерах от 2,5 до 10,5 кг массы тела и 18-137 г веса сердца(рисунок 2A). После переноса изолированного сердца в систему Langendorff (37 градусов по Цельсию), частота сердечных приступов стабилизировалась до 70 и 4,5 б/с (средний и SEM) в течение 10 мин дефибрилляции и оставалась неизменной на протяжении всего исследования(рисунок 2B). Измерялась средняя скорость потока 184 и 17 мл/мин (средняя - SEM), которая замедлилась до 70 и 7,5 мл/мин после того, как он проникся подогретым носителями, содержащими механический отъем(рисунок 2C).
Свинец II ЭКГ были зарегистрированы на протяжении всего исследования во время синусового ритма(рисунок 3A) или в ответ на внешние темпы(Рисунок 3B-E) для количественной оценки электрофизиологических параметров. Для оценки EP, динамическое темпирование (S1'S1) было применено к правому предсердию, чтобы определить WBCL и SNRT (время восстановления после начала S1-S1, Рисунок 3C), в котором WBCL был обозначается как кратчайший PCL, который инициировал предсердий к желудочковой проводимости. Протокол шага S1'S2 был реализован с использованием биполярного электрода стимула на левом желудочке для того, чтобы определить кратчайший интервал соединения, который инициировал деполяризацию желудочков, тем самым выявляя VERP (Рисунок 3D). Кроме того, для определения AVNERP (S1-S2), как показано на рисунке 3E,применяется протокол шага предсердий S1'S2. Репрезентативные примеры параметров электрофизиологии сердца свиньи выравниваются в тесном контакте с ранее опубликованными37.
Эксперименты оптического картирования проводились во время синусового ритма, спонтанной фибрилляции желудочков(рисунок 4),или во время динамического темпа (S1-S1) левого желудочка (LV) для генерации электрических и кальциевых кривых реституции, изображенных в Рисунок 5. Репрезентативные изображения сердца поросенка, нагруженного красителями, показаны на рисунке 4 с соответствующими оптическими потенциалами действия (Vm) и переходными кальцием (Ca), собранными из двух областей, представляющих интерес на эпикардиальной поверхности (правый желудочек (RV) - синий, LV и красный) . Необработанные сигналы отображаются во время синусового ритма и во время фибрилляции желудочков. Как упоминалось ранее, динамические эпикардиальные темпы (S1'S1) также был использован во время оптических картографических экспериментов, чтобы нормализовать любую небольшую разницу в внутренней частоте сердечных выражений(рисунок 5A-E). Отображаются сырые сигналы (RV , синий, LV и красный), которые были использованы для изображения потенциала действия - время переходного соединения кальция(рисунок 5C),активация и время продолжительности(Рисунок 5D),электрическая и рекуперация кальция(рисунок 5E). Для густых препаратов миокарда пространственная фильтрация размером 3 мм х 3 мм подходит для потенциала эпикардиального действия или переходного анализа кальция19,47. Соответственно, изображения с высоким пространственным разрешением (в описанной установке 1240 x 1024 всего, или 620 х 512 на канал, размер пикселей 6,5 мкм) часто пространственно binned во время или после приобретения (Рисунок 5C). Обработка изображений может быть выполнена для генерации карт активации и переполяризации с помощью пользовательских алгоритмов23,33,43,45 (рисунок 3D),с временем активации каждый пиксель на сердце был определен как максимальная производная от потенциального действия или кальция переходного upstroke.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Диаграмма изолированной системы перфузии сердца; стрелки обозначают направление потока. (B) Каннулированное сердце показано с размещением электрода. РА - правая предрия, Р.В. и правый желудочек, л.с. левый желудочек, ЭКГ и электрокардиограмма свинца II. (C) Платформа визуализации в непосредственной близости от ткани сердца. (D) Выбросы каждого дополнительного зонда (напряжение, кальций) разделены длиной волны с помощью устройства расщепления изображений с соответствующими фильтрами выбросов и дихроическим зеркалом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Рисунок 2: Измерения веса сердца, скорости и потока. (A) Соотношение веса сердца к массе тела для каждого поросенка, используемого в исследовании (n No 18). (B) Частота сердечных приступов измеряется 10 мин после дефибрилляции и снова в конце исследования (примерно 1 ч). (C) Коронарный поток падает стремительно после перфузии с механическим uncoupler (BDM) из-за снижения спроса на кислород. Шкала баров представляют среднее количество SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные примеры записей свинца II электрокардиограммы, собранных во время синусового ритма или в ответ на внешние темпы. (A) Нормальный синусовой ритм. (B) Пример эпикардиального темпа при длине цикла 400 мс (S1'S1), который был использован для экспериментов изображений. (C) Топ: Предсердие ходить, чтобы определить WBCL; успешный захват наблюдается на S1 и 250 мс в котором предсердие к желудочковой проводимости наблюдается. Обратите внимание, что ход предсердий может быть использован для определения SNRT (время разгрузки синусового узла, после того, как начался внешний темп). Внизу: По мере уменьшения длины цикла S1 до 205 мс, проведение желудочка завершается неудачей. (D) Топ: Эпикардиальный темп (S1'S2) для идентификации VERP; успешный захват наблюдается на S1 и 450 мс, S2 и 300 мс. Нижняя: Как S2 длина цикла уменьшается до 250 мс, желудочковой ткани не удается захватить. (E) Предсердие ходить (S1'S2) для идентификации AVNERP. Вверху: Успешный захват наблюдается на S1 450 мс, S2 и 200 мс. Нижняя: Как S2 длина цикла уменьшается до 199 мс, проведение желудочка не удается. Синие стрелки обозначают темп шипы, красные стрелки обозначают захват ('C') или нет захвата ('NC'). S1'S1 - динамический темп, S1'S2 - экстрастимул. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Рисунок 4: Оптические данные во время синусового ритма и фибрилляции желудочков. Слева: Репрезентативные изображения свиного сердца, нагруженного краской (Vm и напряжение, RH237; Ca кальций, Rhod2), передний вид. Пространственно фильтруется трансмембранное напряжение и внутриклеточные флуоресцентные сигналы кальция от свиного сердца во время синусового ритма (Центр). Сигналы напряжения и кальция во время фибрилляции желудочков (справа). Размеры области сигнала (15 х 15 пикселей и 2,4 х 2,4 мм2,30 х 30 х 4,8 х 4,8 мм2 размера ядра) представлены в виде красных и синих квадратов. Единицы и F /F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Рисунок 5: Оптические данные из Langendorff-перфированных свиных сердец. Необработанные, пространственно фильтруемые(A)трансмембранное напряжение и (B)внутриклеточные сигналы флуоресценции кальция из правого и левого желудочков во время электрического темпа на вершине. Нефильтрованные, пространственно усредненные сигналы изображают оптические потенциалы действия и переходные кальция из регионов, представляющих интерес (сигнальные единицы являются Фз/Ф). (C) Наложение нормализованных переходных иллюстрирует действие потенциального кальция переходного времени соединения (низкий проход фильтруется на 75 Гц). (D) Обработка сигналов по всей эпикардиальной поверхности для генерации изохроновых карт временных параметров, включая время активации (tact)и время реполяризации 80%. (E) Электрические и кальций переходных кривых реституции, генерируемых на нескольких частотах (слева) со статистическим анализом (справа), чтобы проиллюстрировать больше времени реполяризации при более медленном темпе длины цикла. Шкала баров - означает SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Химических</td>
			<td>Формула</td>
			<td>Молекулярный вес</td>
			<td>г/л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Хлорид натрия</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глюконат натрия</td>
			<td>C6Н11НаО7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Тригидрат ацетата натрия</td>
			<td>C2H3NaO2No3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Хлорид калия</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Хлорид магния (ангидра)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.4% Бикарбонат натрия</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Маннитол</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сульфат магния</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Осмоляритность (моосмол/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Модифицированный рецепт кардиоплегии дель Нидо.

Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Целью данного исследования было создание метода исследования сердечной динамики с помощью трансляционной модели животных. Описанный экспериментальный подход включает в себя оптокардиографию с двойным излучением в сочетании с электрофизиологическим исследованием для оценки электрической активности в изолированной, нетронутой модели сердца.

Оптокардиография и электрофизиология Исследования Ex Vivo Langendorff-перфизиозных сердец

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Сердечно-сосудистая неисправность является основной причиной смерти во всем мире. Изолированная модель сердца, которую мы представляем здесь, может служить экспериментальным окном в сердечную динамику человека. Этот подход сочетает в себе классическое электрофизиологическое исследование с одновременным оптическим картированием трансмембранного напряжения и межклеточного кальция для оценки состояния сердца.Эта методология может быть применена к моделированию заболеваний, фармакологии и токсикологии исследований. Например, одной из наших областей внимания является характеристика влияния размеров стекла на сердечную электрофизиологию. Хотя эта методология является более технически сложной, чем протокол, который использует меньшую модель животных, в целом, протокол является относительно простым, как только все части на месте.Трудно описать все компоненты системы визуализации и перфузии по тексту, поэтому визуальная демонстрация этого процесса поможет в воспроизведении успешной подготовки. Изолировав сердце восходящей аортой, окунив вырезанный орган в ледяную кардиоплегию и используйте пару гемостатов, чтобы схватить стену аорты. Проскользните сосуд на ребристую канюлю, прикрепленную к трубе, подключенную к одному литру ледяной кардиоплегии среды, подвешенной примерно на 95 сантиметров над сердцем.Разрешить жидкости для заполнения аорты, пока сосуд переполнения, чтобы предотвратить любые пузырьки от входа в сосуды и использовать пуповинной лентой для обеспечения аорты к канюле. Свяжите гемостаты, чтобы нести вес сердца, как он висит от канюлы для дальнейшей защиты ткани и позволяют холодной среде ретроградной perfuse сердце при постоянном давлении 70 миллиметров ртути под действием силы тяжести. Перенесите слышть на 37 градусов по Цельсию Langendorff системы без введения воздуха в канюлю.И позволить нормальному синусовому ритму промыть сосуды любой оставшейся крови и кардиоплегии. В случае шоковой аритмии, поместите внешние весла на вершину и основание сердца, чтобы дефибрилляции органа, обеспечивая один шок на пять джоулей и увеличение в пять джоулей шагом до 50 джоулей, кардиоверсия, или unshockable ритм достигается. Затем, промыть сердце, по крайней мере один литр модифицированных Кребс-Хенселейт среды без рециркуляции, чтобы удалить остатки крови и кардиоплегии.Когда среда проходит ясно через сердце, закройте циркулирующую петлю, чтобы рециркуляции перфусировать. Чтобы записать стандартный результат ЭКГ на протяжении всего исследования, прикрепите электрод иглы 29-го калибра к желудочковому эпикардию вблизи вершины и прикрепите еще один электрод в правом атриуме. Подключите положительные и отрицательные входы дифференциального биоамплификатора к вершине и правому атриуму, соответственно, и прикрепите один биполярный электрод стимула на правом атриуме и второй биполярный электрод стимула к боковому левому желудоку для целей ходить.Пейс сердце с помощью электрофизиологического стимулятора, с первоначальным током установлен в два раза диастолический порог и одна миллисекундная ширина пульса. Чтобы определить порог темпа, примените ряд импульсов стимулов от одного до двух миллиампер с шириной импульса в одну миллисекунду при определенных длинах цикла темпа, чтобы обеспечить последовательную реакцию стимула. Выполните дополнительный стимул ходить с помощью либо S1, S1 или S1, S2 ходить поезд.Уменьшите цикл темпа S2 пошаговую длину на 10 миллисекунд до тех пор, пока темп не сможет захватить. Затем подойти к предпоследней длине цикла темпа и уменьшить длину цикла в один миллисекундный интервал, чтобы определить наиболее точную длину цикла темпа до потери захвата. Чтобы установить желудочковый эффективный огнеупорный период, используйте стимул электрода на боковой левый желудочек, чтобы определить кратчайший S1, S2 интервал, с которым S2 преждевременного бить инициирует желудочковой деполяризации.Чтобы определить длину цикла Wenckebach, используйте стимул электрод на правом атриуме, чтобы найти кратчайший интервал S1, S1, с которым один-к-одному атриовентрикулярной проводимости распространяется через нормальный путь проводимости. Чтобы определить время восстановления синусового узла, используйте стимул электрода на правом предсердии, чтобы применить S1, S1 ходить поезд и измерить задержку времени между последним импульсом в ходить поезд и восстановление спонтанного синоатриального узла опосредовано деятельности. Для установления атриовентрикулярного узла эффективный огнеупорный период, используйте стимул электрод на правом атриуме.Найдите кратчайший интервал соединения S1, S2, с помощью которого за преждевременной стимуляцией предсердий следует hisbundle потенциал, который вызывает комплекс SRS, означающий деполяризацию желудочков. Для оптического картирования трансмембранного напряжения и внутриклеточного кальция, сначала медленно добавить до пяти миллилитров свежеприготовленного красителя напряжения проксимальной аортальной канюли с последующим медленным добавлением свежеприготовленного красителя кальция. Далее распоите оборудование для визуализации, чтобы сосредоточиться на соответствующем поле зрения и подключить камеру к рабочей станции.Приобретайте изображения с помощью выбранного программного обеспечения со временем экспозиции от 5 до 2 миллисекунд. И выполнить выравнивание изображения с помощью программного обеспечения, которое может разделить и наложить желаемые регионы и отображать вычитание серой шкалы или псевдоцветное дополнение к любым несогласованно. С окружающим освещением сведено к минимуму, проверить светодиодные фонари, чтобы обеспечить равномерное и максимальное эпикардиального освещения, как это определено датчиком хорошо глубины.Затем, изображение миокарда во время синусового ритма, фибрилляции желудочков, или динамический темп с помощью стимула электрода, расположенный на левом желудочковом, начиная с ходить цикл длиной 350 миллисекунд и уменьшается на 10 до 50 миллисекунд для создания кривых реституции. Чтобы подтвердить получение оптического сигнала качества на протяжении всего эксперимента, откройте видеофейль, выберите область интереса и навеяете среднее флуоресценцию с течением времени. В конце эксперимента удалите сердце из системы и слейте перфусат.Затем промойте системные трубы и камеры очищенной водой. Для регулярного технического обслуживания периодически прополощите систему раствором моющего средства по мере необходимости. В этих репрезентативных исследованиях, процедура была выполнена на нетронутых моделях, как было попродемонстрировано, которые варьировались в размерах от 2,5 до 10,5 кг массы тела и от 18 до 137 граммов массы сердца.После переноса изолированного сердца в систему Лангендорфа, пульс стабилизируется примерно до 70 ударов в минуту в течение примерно 10 минут дефибрилляции и остается постоянным на протяжении всего исследования. Средняя скорость потока около 184 миллилитров в минуту, как правило, измеряется. Он замедляется до 70 миллилитров в минуту после перфузирования с разогретой средой, содержащей механический uncoupler.Свинец два ЭКГ могут быть записаны в течение всего исследования во время синусового ритма или в ответ на внешние темпы количественно электрофизиологических параметров. Эксперименты по оптическому картированию также могут проводиться во время синусового ритма и спонтанной фибрилляции желудочков. Репрезентативные изображения нагруженного красителем сердца могут быть получены с соответствующими оптическими потенциалами действия.И кальций переходных могут быть собраны из двух областей, представляющих интерес на эпикардиальной поверхности. Кроме того, динамический эпикардиальный темп может быть использован во время оптических картографических экспериментов для нормализации любых незначительных различий в внутренней сердечной ставки. Необработанные сигналы могут быть использованы для изображения потенциального действия кальция переходного времени соединения, активации и продолжительности времени, а также электрической и кальция реституции.Важно не позволять пузырькам проникать в аорту, минимизировать время перехода от животного к системе, а также поддерживать более крупное сердце. Электрофизиология и данные оптического сигнала могут быть проанализированы после приобретения. Кроме того, сердце может быть сохранено после исследования гистологии, иммуностимулятора или анализа экспрессии генов.Мы используем этот метод для характеристики развития сердца несовершеннолетних и изучения влияния воздействия на окружающую среду сердечной физиологии. Механические разъединения, используемые для минимизации движения и анти-пены химических веществ, используемых для решения альбумин вспенивание являются токсичными, поэтому с помощью соответствующего средства индивидуальной защиты является абсолютно необходимым.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Экс Vivo Заражение живой ткани с онколитических Вирусы

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Порядок человека подкожных вен<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Перфузии и внешнего подкрепления

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Проверка нано- и антител Based<em&gt; В Vivo</em&gt; Опухоль ксенотрансплантата NIRF-изображений эксперименты в мышей с использованием<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Проточной цитометрии и микроскопии

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Экс Vivo Живая съемка Метастазы в легких и их микроокружения

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Влияние внутрисердечной нейронов на сердечной электрофизиологии и Arrhythmogenesis в системе Langendorff Ex Vivo

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Нарезка и культивирование свиных сердец в физиологических условиях

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...