Name: optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt Dr Matthew Kay för hjälpsam experimentell vägledning, och Manelle Ramadan och Muhaymin Chowdhury för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), barnens forskningsinstitut, Children ' s National Heart Institute och Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical innovation.

Författarna har inget att avslöja.

Även om kardiovaskulära forskningsmodeller sträcker sig från cellulära till in vivo preparat, det finns en inneboende avvägningar mellan klinisk relevans och experimentell nytta. På detta spektrum är det isolerade Langendorff-parfymiserade hjärtat en nyttig kompromiss för att studera kardiologisk fysiologi48. Hela hjärt modellen representerar en högre nivå av funktionell och strukturell integration än encellig eller vävnads monolayers, men undviker också den störande komplexiteten i samband med in vivo-modeller. En stor fördel vid dubbla optiska kartläggnings experiment är att den epikardiella ytan av det isolerade hjärtat kan observeras, och fluorescensavbildning av transmembranpotential och kalcium hantering kan användas för att övervaka kardiologisk fysiologi34.
Gnagare modeller används oftast för isolerade hjärt preparat i motsats till större djur, delvis på grund av den tillhörande kostnaden för upp-dimensionering alla element som berörs (t. ex. lösningsvolym, perfusion krets, kvantitet av färgämnen och mekaniska uncouplers) tillsammans med större instabilitet och benägenhet för arytmier hos större djur10,36,49. En fördel med att använda gris hjärtan är att de liknar det mänskliga hjärtat i struktur, storlek och hastighet av kontraktion, därför mer exakt modellering hemodynamiska parametrar som koronar blodflöde och hjärt minut effekt. Likaså, människor och grisar har liknande kalcium hantering, elektrokardiogram intervall37, och åtgärd potentiell morfologi inklusive de underliggande kanalerna att den representerar12,50,51, 52. Detta protokoll beskriver i detalj stegen för att skapa en reproducerbar stor djurmodell för att utförligt karakterisera hjärtfunktionen. Samtidig avbildning av transmembranspänning (RH237) och intracellulärt kalcium (Rhod2), som används tillsammans med etablerade elektrofysiologiska protokoll, ger möjlighet att precisera mekanismer som är ansvariga för förändrade hjärt Funktion. Den beskrivna metoden kan användas för prekliniska säkerhetstest, toxikologisk screening och utredning av genetiska eller andra sjukdoms patologier. Dessutom kan den beskrivna metoden modifieras och anpassas för användning med andra hjärt modeller (t. ex. hund, människa) beroende på den specifika forskningsinriktningen53,54,55.
Det finns några viktiga ändringar att tänka på när du övergår från en mindre gnagare modell till en större gris modell för isolerade, hela hjärtat preparat. Under beredning och installation, rekommenderar vi att tillsätta albumin till parfymen för att bibehålla onkotiskt tryck och minska ödem (plus skumgummi, om det behövs)56,57,58,59. Dessutom kan vätska innehållande albumin också stöd i metaboliska studier som också kräver fettsyra-tillskott till media60,61. Till skillnad från gnagare hjärtan, den större gris hjärta behöver inte vara nedsänkt i varma medier på grund av dess mindre yta till volym förhållande och den ökade volymen av värmda medier som flyter genom kranskärlen som bättre upprätthåller temperaturen. Som nämnts tidigare, placerade vi temperaturprober inne i höger kammare och på epikardiell yta av både höger och vänster kammare, Observera endast smärre temperaturvariationer på 1 − 2 ° c på alla tre platser under hela studien. Viktigare, sådana snabbare flöden kan också öka sannolikheten för bubblor och en potentiell embolism. För att kringgå detta problem rekommenderar vi att du använder en bubbelfälla med stora borrslangar som leder rakt ner till aorta kanyl. Likaså fann vi det mest användbart för att ha två personer som arbetar tillsammans för att kanylera aorta på en större (och tyngre) hjärta; en person att hålla aorta öppna med robust Peanger och en annan för att säkra aorta till kanula med navel band. I den beskrivna metoden fann vi att perfusion med cardioplegia och defibrillering var avgörande för hjärt återhämtning, vilket strider mot gnagare hjärt preparat. Enligt vår erfarenhet, endast ett fåtal censurerade hjärtan återupptogs normal sinus-driven aktivitet utan elkonvertering.
För att förbättra optiska Imaging ändpunkter, en hängande hjärta beredning begränsade effekten av bländning som kan uppstå med ett nedsänkt hjärta. Dessutom, den hängande hjärtat undviker också någon kompression eller kompromiss av kranskärlen på den bakre delen av hjärtat som kan uppstå när du lägger hjärtat ner horisontellt för vertikal avbildning. Vi fann också att lastning fluorescerande färgämnen efter bubblan fällan (nära aorta kanyl) kraftigt förbättrad vävnad färgning och optiska signaler. Slutligen, för att förbättra kardiell Elektrofysiologisk effektmått, användning av en större koaxial stimulering elektrod underlättade framgångsrika förmaksflimmer. Även om vi beskriver användningen av elektrokardiogram för att identifiera fånga och förlust av fångst för olika EP parametrar, intrakardiell katetrar eller bipolär inspelnings elektroder kan också användas.
Vår studie var inriktad på att utveckla en metodik för dubbel optisk kartläggning och kardiell Elektrofysiologisk bedömning i en isolerad, intakt hjärt modell av svin. På grund av likheter med det juvenila mänskliga hjärtat är svin hjärtat en populär modell för studier inriktade på pediatrisk kardiologi eller medfödda hjärtfel. Viktigt, den beskrivna metoden kan anpassas för att användas med större medelstora vuxna hjärtan och/eller olika arter av intresse. Faktum är att andra laboratorier kan finna att användningen av hundarnas eller människors hjärtan (antingen givare eller sjuka) är mer tillämpliga för deras specifika forskningsfokus53,54,55. En annan potentiell begränsning till denna studie är användningen av en mekanisk uncoupler att minska rörelse artefakt under avbildning. Blebbistatin har blivit uncoupler av val i hjärt-avbildning applikationer på grund av dess minimala effekter på EKG-parametrar, aktivering och refraktär perioder41,62,63. BDM är ett billigare val, vilket kan vara särskilt viktigt i stora djurstudier som kräver större volymer av parfymen och mekanisk uncoupler, men det är känt att ha en större inverkan på kalium och kalcium strömmar som kan förändra actionpotential morfologi64,65,66,67. Om BDM används, Observera att APD förkortning ökar hjärtan sårbarhet för chock-inducerad arytmier68. Omvänt är den huvudsakliga begränsningen till att använda blebbistatin dess fotosensitivitet och fototoxicitet, även om alternativa formuleringar som har minskat dessa effekter69,70,71. Slutligen använder den beskrivna metoden ett enda kamerasystem för dubbel optisk kartläggning experiment, men det är viktigt att notera att forskningsstudier fokuserade på ventrikelflimmer och/eller spårning av elektriska vågor över epikardiell yta skulle behöva ändra denna metod för att inkludera tredimensionell panoramabild, som beskrivs av andra15,19,72,73,74,75 .

Hjärt-kärlsjukdom är en ledande orsak till sjukdom och död i hela världen. Som sådan är ett primärt forskningsfokus att optimera metoder som kan användas för att studera normal hjärtfysiologi och bakomliggande mekanismer som kan bidra till sjuklighet och dödlighet hos människor. Grundläggande kardiovaskulär forskning har traditionellt förlitat sig på små djurmodeller, inklusive gnagare och kaniner1,2,3, på grund av tillgången på genetiskt modifierade arter4,5, lägre kostnad, mindre experimentellt fotavtryck och högre dataflöde. Användningen av en gris modell har dock potential att ge mer kliniskt relevanta data6. Tidigare studier har dokumenterat likheter i kardiell elektrofysiologi (EP) mellan människor och svin, inklusive liknande Jon strömmar7, actionpotential form8, och svar på farmakologiska tester9. Dessutom har svin hjärtat kontraktila och avslappning kinetik som är mer jämförbara med människor än antingen gnagare eller kaniner10. Jämfört med en Hundarnas modell, den porcin koronar anatomi närmare liknar ett mänskligt hjärta11,12 och är en modell för val för studier fokuserade på hjärt utveckling, pediatrisk kardiologi och/eller medfödda hjärtfel 13. även om det finns skillnader mellan svin och mänskligt hjärta8, dessa likheter gör svin hjärta en värdefull modell för kardiovaskulär forskning14.
Retrograd perfusion av hjärtat har blivit ett standardprotokoll för att studera hjärt Dynamics ex vivo15 sedan första inrättades av Oskar langendorff16. Följaktligen kan Langendorff-perfusion användas för att stödja ett isolerat, intakt hjärta i avsaknad av autonoma influenser. Denna modell är ett användbart verktyg för att direkt Jämföra kardiell elektrofysiologi och kontraktilitet mellan friska och icke-friska hjärtan. Eftersom hjärtats dynamik är både temporally och rumsligt komplex kan en liten förändring i en region dramatiskt påverka hela hjärtats förmåga att arbeta som syncytium17. Därför är hög spatiotemporal avbildning av parameter känsliga färgämnen ett användbart verktyg för att övervaka hjärtfunktionen över ytan av hjärtat18,19. Samtidig dubbel avbildning av spänning och kalcium känsliga lysrör möjliggör bedömning av elektrisk aktivitet, kalcium hantering och excitation-kontraktion på vävnadsnivå20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusion och/eller optiska kartläggnings tekniker har tidigare använts för att dokumentera nedgången i hjärt prestanda på grund av åldrande eller genetiska mutationer, och för att bedöma säkerheten för farmakologiska agens eller miljöexponeringar29 ,30,31,32,33.
I den kliniska inställningen, en invasiv kardiell elektrofysiologi studie används ofta för att undersöka hjärtrytmrubbningar, identifiera patologier, och lokalisera möjliga behandlingsalternativ. Likaså beskriver vi ett EP-protokoll som kan användas för att bedöma sinus Node funktion, mäta atrioventrikulär överledning, och identifiera refraktäritet av myokardvävnad. Den beskrivna EP-studien kan utföras i samband med optisk kartläggning, eller optokardiografi34, för att till fullo karakterisera hjärtats fysiologi i isolerade hjärtan. I det beskrivna protokollet utfördes en hög spatiotemporal upplösning fluorescens Imaging med en kombination av spänning (RH237) och kalcium (Rhod-2AM) färgämnen i en dual emission setup. Dessutom, kardiell elektrofysiologi parametrar övervakades under både sinus rytm och som svar på programmerad elektrisk stimulering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560-5MG</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-100G</td>
			<td>Mechanical Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog signal interface</td>
			<td>emka Technologies</td>
			<td>itf16USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5758-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam Y-30 Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula, 5/16&#8221;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45509-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430641U-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>C77-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, sCMOS</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Zyla 4.2 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coaxial stimulation electrode (atria)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrillator</td>
			<td>Zoll</td>
			<td>M Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T660lpxrxt-UF2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DP-304A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, calcium</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET585/40m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter, voltage</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET710lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP stimulator (Bloom)</td>
			<td>Fisher Medical</td>
			<td>DTU-215B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>CT510/60bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lights</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SOLIS-525C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8147K52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cartridge, polypropylene</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>PD-5-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter housing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9979T21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow transducer</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>ME6PXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemofilter</td>
			<td>Hemocor</td>
			<td>HPH 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>423-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-bore tubing, I.D. 3/8&#8221;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-169-7H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens 50 mm, 0.95 f-stop</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>DO-5095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image Alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm</td>
			<td>AD Instruments Inc.</td>
			<td>MLA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Humbug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>PolyStan</td>
			<td>A/S 1481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir, 2 liter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-34541-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2-AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode (ventricle)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical</td>
			<td>890186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing flow console</td>
			<td>Transonic</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>J0025UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath/circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89400-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage shears</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8448</td>
			<td>Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Dalwha Corp. Ltd.</td>
			<td>BA2ALD001</td>
			<td>Model: 200 Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7476</td>
			<td>St Vincent Tube Occluding Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8960</td>
			<td>Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8985</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501749</td>
			<td>14.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501747</td>
			<td>11.5 cm, Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8980</td>
			<td>Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8828</td>
			<td>Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pediatric cross clamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7660</td>
			<td>Cooley-Derra Clamp 6.25&#34; 5mm Calibrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right angle forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501240</td>
			<td>Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>549-4</td>
			<td>Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8380</td>
			<td>Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Serrated forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500363</td>
			<td>Dressing Forceps 15.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamp</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501700</td>
			<td>Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner retractor</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501314</td>
			<td>Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2x3 Sharp Prongs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 prolene suture</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel loop</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>011001PBX</td>
			<td>Sterion&#174; Vessel Loop, 0.8 x 406mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardioplegia (Plegisol)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00409-7969-05</td>
			<td>Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>300 U/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and Needle</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td>60mL &#38; 18G respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical tape</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>U12T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optocardiography and electrophysiology studies of ex vivo langendorff-perfused hearts

Små djurmodeller används oftast inom kardiovaskulär forskning på grund av tillgången på genetiskt modifierade arter och lägre kostnader jämfört med större djur. Men större däggdjur lämpar sig bättre för translationella forskningsfrågor med anknytning till normal hjärtfysiologi, patofysiologi och preklinisk testning av terapeutiska medel. För att övervinna de tekniska hinder som är förknippade med att anställa en större djurmodell i Hjärtforskning, beskriver vi en metod för att mäta fysiologiska parametrar i ett isolerat, Langendorff-perfused Nasse hjärta. Denna metod kombinerar två kraftfulla experimentella verktyg för att utvärdera tillståndet i hjärtat: elektrofysiologi (EP) studie och samtidig optisk kartläggning av transmembranspänning och intracellulära kalcium med parameter känsliga färgämnen (RH237, Rhod2-AM). De beskrivna metoderna lämpar sig väl för translationella studier som undersöker hjärtats retledningssystem, förändringar i potentiell morfologi, kalcium hantering, excitation-kontraktion och incidensen av hjärt växlar eller Arytmier.

Figur 1a visar ett diagram över det isolerade hjärt per fusions systemet, som omfattar rör krets, pump, filter, oxygenator, reservoarer och värmeelement. Placeringen av EKG (lead II-konfiguration) och pacing-elektroder visas i figur 1b, och bild installationen avbildas i figur 1c. En schematisk av de optiska komponenterna och ljus banorna visas i figur 1d.
Experimentella studier utfördes på intakt, hela hjärtan isolerade från juvenila Yorkshire svin (14 − 42 dagar, n = 18) som varierade i storlek från 2,5 − 10,5 kg kroppsvikt och 18 − 137 g hjärta vikt (figur 2A). Efter att ha överfört det isolerade hjärtat till ett Langendorff-system (37 ° c), stabiliserades hjärtfrekvensen till 70 ± 4,5 BPM (medelvärde ± SEM) inom ~ 10 min av defibrillering och förblev konstant under hela studiens varaktighet (figur 2b). En genomsnittlig flödeshastighet på 184 ± 17 mL/min (medelvärde ± SEM) mättes, vilket avtog till 70 ± 7,5 mL/min efter att ha parfymerat med värmda medier som innehåller en mekanisk uncoupler (figur 2C).
Bly II-EKG registrerades under hela studiens varaktighet under sinusrytm (figur 3a) eller som svar på externt tempo (figur 3B-E) för att kvantifiera elektrofysiologiska parametrar. För EP-utvärdering tillämpades Dynamic pacing (S1 − S1) på höger förmak för att lokalisera WBCL och SNRT (återhämtningstid efter S1 − S1 inleds, figur 3c), VARVID wbcl var betecknade som den kortaste PCL som initierade förmakt till ventrikulär överledning. En S1 − S2 pacing protokoll genomfördes med hjälp av en bipolär stimulans elektrod på vänster kammare för att identifiera den kortaste kopplingsintervall som initierade ventrikulär depolarisering, därmed precisera VERP (figur 3D). Alternativt, ett S1 − S2 förmaksflimmer-protokoll appliceras på Pinpoint AVNERP (S1 − S2), som visas i figur 3E. Representativa exempel på Pig Heart elektrofysiologi parametrar anpassa nära med dem som tidigare publicerats37.
Optiska kartläggning experiment utfördes under sinusrytm, spontan ventrikelflimmer (figur 4), eller under dynamisk pacing (S1 − S1) av vänster kammare (LV) för att generera elektriska och kalcium återbördande kurvor som avbildas i Figur 5. Representativa bilder av en Dye-Loaded Nasse hjärta visas i figur 4 med motsvarande optiska åtgärder potentialer (VM) och kalcium (ca) transienter som samlats in från två regioner av intresse på epikardiell yta (höger kammare [RV] = blå, LV = röd) . Obearbetade signaler visas under sinus rytm och under ventrikelflimmer. Som tidigare nämnts, dynamisk epikardiell pacing (S1 − S1) användes också under optisk kartläggning experiment för att normalisera någon liten skillnad i den inneboende hjärtfrekvensen (figur 5A-E). RAW-signaler visas (RV = blå, LV = röd), som användes för att skildra aktionspotentialen – kalcium övergående kopplingstid (figur 5c), aktiverings-och varaktighetstid (figur 5D), elektrisk och kalcium återlämnande (figur 5e). För tjocka hjärt preparat, spatial filtrering med kernel storlek ~ 3 mm x 3 mm är lämplig för epikardiell åtgärd potential eller kalcium transitorisk analys19,47. Därför är bilder med hög rumslig upplösning (i den beskrivna inställningen 1240 x 1024 totalt, eller 620 x 512 per kanal, 6,5 μm pixelstorlek) ofta rumsligt papperskorgen under eller efter förvärvet (figur 5c). Bildbehandling kan utföras för att generera aktiverings-och repolariseringskartor med anpassade algoritmer23,33,43,45 (figur 3D), med aktiveringstiden för varje pixel på hjärtat definierades som den maximala derivat av åtgärden potentiella eller kalcium övergående upstroke.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Bild 1: experimentell inställning. A) diagram över det isolerade hjärt per fusions systemet. pilar betecknar flödesriktningen. (B) ett kanylerat hjärta visas med elektrodplacering. RA = höger Atria, RV = höger kammare, LV = vänster kammare, EKG = elektrokardiogram för bly II. C) bild plattformen i nära anslutning till hjärt vävnaden. D) utsläpp av varje kompletterande sond (spänning, kalcium) separeras med våglängd med hjälp av en bild delnings anordning med lämpliga emissions filter och Dichroic spegel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figur 2: hjärtvikt, hastighet och flödesmätningar. A) hjärtvikt till kroppsvikt för varje gris som används i studien (n = 18). (B) hjärtfrekvens mätt ~ 10 min efter defibrillering och igen vid studiens (ca 1 h). (C) koronar flödet sjunker precipitously efter perfusion med en mekanisk uncoupler (+ BDM) på grund av minskad syre efterfrågan. Skalstreck representerar medelvärdet ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figur 3: representativa exempel på bly II elektrokardiogram inspelningar som samlats in under sinusrytm eller som svar på extern pacing. (A) normal sinus rytm. (B) exempel på epikardiell pacing vid cykellängden på 400 MS (S1 − S1), som användes för bild experiment. (C) topp: förmaksflimmer för att identifiera WBCL; lyckad fångst observeras vid S1 = 250 MS vari förmaks till ventrikulär överledning observeras. Observera att förmaksflimmer kan användas för att bestämma SNRT (tid till sinus noden urladdning, efter att ha inlett extern pacing). Bottom: eftersom S1 cykellängden minskas till 205 MS, överledning till ventrikeln misslyckas. (D) topp: epikardiell pacing (S1 − S2) för att identifiera verp; lyckad fångst observeras vid S1 = 450 ms, S2 = 300 MS. bottom: som S2 cykellängden minskas till 250 MS, ventrikulär vävnad inte fånga. E) förmaksflimmer (S1 − S2) för att identifiera AVNERP. Överst: lyckad fångst observeras vid S1 = 450 ms, S2 = 200 MS. bottom: som S2 cykellängden minskas till 199 MS, överledning till ventrikeln misslyckas. Blå pilar betecknar pacing spikar, röda pilar betecknar Capture ("C") eller ingen fångst ("NC"). S1 − S1 = dynamiskt tempo, S1 − S2 = extrastimulus pacing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figur 4: optisk data under sinusrytm och ventrikelflimmer. Vänster: representativa bilder av en Dye-Loaded gris hjärta (VM = spänning, RH237; Ca = kalcium, Rhod2), främre vy. Rumsligt filtrerad transmembranspänning och intracellulär kalcium fluorescerande signaler från en gris hjärta under sinus rytm (Center). Och kalcium signaler under ventrikelflimmer (höger). Signal regions storlekar (15 x 15 pixlar = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kernel size) representeras som röda och Blå rutor. Enheter = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figur 5: optiska data från Langendorff-parfymera gris hjärtan. Obearbetade, rumsligt filtrerade (a) transmembranspänning och (B) intracellulära kalcium fluorescens signaler från höger och vänster kammare under elektrisk pacing på spetsen. Ofiltrerade, rumsligt genomsnitt signaler skildrar optiska åtgärder potentialer och kalcium transienter från regioner av intresse (signalenheter är ΔF/F). (C) en överlagring av normaliserade transienter illustrerar actionpotential-kalcium övergående kopplingstid (Low-pass filtreras vid 75 Hz). D) bearbetning av signaler över epikardiell yta för att generera isochronala kartor över temporala parametrar, inklusive aktiveringstid (tact) och 80% repolariseringstid. E) elektriska och kalciumtransienta restitutionskurvor som genereras vid multipla frekvenser (till vänster) med statistisk analys (höger) för att illustrera längre repolariseringstid vid långsammare tempo. Skalstreck = medelvärde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kemiska</td>
			<td>Formel</td>
			<td>Molekylvikt</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumklorid</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58,44</td>
			<td>5,26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumglukonat</td>
			<td>C6H11Nao7
</td>
			<td>218,14</td>
			<td>5,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumacetattrihydrat</td>
			<td>C2H3Nao2• 3H2O</td>
			<td>136,08</td>
			<td>3,68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumklorid</td>
			<td>KCl</td>
			<td>74,55</td>
			<td>0,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumklorid (vattenfri)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95,21</td>
			<td>0,1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4% natriumbikarbonat</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84,01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182,17</td>
			<td>16,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfat</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120,37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7,4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolaritet (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: modifierad del Nido ' s cardioplegia recept.

Watch this Scientific Journal Video about Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts at JoVE.com

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Syftet med denna studie var att etablera en metod för att undersöka hjärtats dynamik med hjälp av en translationell djurmodell. Den beskrivna experimentella metoden innehåller Dual-emission optokardiografi i samband med en Elektrofysiologisk studie för att bedöma elektrisk aktivitet i en isolerad, intakt svin hjärt modell.

Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Kardiovaskulära fel är den vanligaste dödsorsaken i världen. Den isolerade hjärtmodell som vi presenterar här kan fungera som ett experimentellt fönster in i människans hjärtdynamik. Detta tillvägagångssätt kombinerar en klassisk elektrofysiologi studie med samtidig optisk kartläggning av transmembrane spänning och intercellulära kalcium att utvärdera tillståndet i hjärtat.Denna metodik kan tillämpas på sjukdomsmodellering, farmakologi, och toxikologiska studier. Till exempel är ett av våra fokusområden att karaktärisera effekterna av glas sizers på hjärt elektrofysiologi. Även om denna metod är mer tekniskt utmanande än ett protokoll som använder en mindre djurmodell, totalt sett, är protokollet relativt enkelt när alla bitar är på plats.Det är svårt att beskriva alla komponenter i en bildbehandling och perfusion system genom text, så visuell demonstration av denna process kommer att bidra till att reproducera en framgångsrik förberedelse. Efter att ha isolerat hjärtat med den uppstigande aortan intakt, kasta den strukna orgeln i iskall kardioplegi och använd ett par hemostater för att greppa väggen i aorta. Slip kärlet på en räfflad kanyl fäst vid slangar anslutna till en liter iskall cardioplegia medium upphängd cirka 95 centimeter ovanför hjärtat.Låt vätskan fylla aortan tills kärlet svämmar över för att förhindra att eventuella bubblor kommer in i vasculaturen och använd navelband för att säkra aortan till kanylen. Bind hemostaterna för att bära hjärtats vikt när den hänger från kanylen för att ytterligare säkra vävnaden och låt det kalla mediet att bakåtsträna genomsyra hjärtat vid ett konstant tryck på 70 millimeter kvicksilver genom gravitation. Överför hör till 37 grader Celsius Langendorff-systemet utan att införa luft i kanylen.Och låta den normala sinus rytmen att spola vasculature av eventuella kvarvarande blod och cardioplegia. I händelse av shockable arytmier, placera externa paddlar vid spetsen och basen av hjärtat för att defibrillate orgeln, leverera en enda chock på fem joule och öka i fem joule steg tills 50 joule, kardirigering, eller unshockable rytm uppnås. Spola sedan hjärtat med minst en liter modifierat Krebs-Henseleit medium utan recirkulation för att avlägsna eventuellt kvarvarande blod och cardioplegia.När mediet löper klart genom hjärtat, stäng den cirkulerande slingan för att återcirkulera perfusatet. För att registrera en standard leda till EKG under hela studiekursen, bifoga en 29-gauge nål elektrod till ventrikulära epikardie nära apex och bifoga en annan elektrod i höger atrium. Anslut de positiva och negativa ingångarna av en differentiell bioampifier till apex respektive höger atrium och fäst en bipolär stimuluselektrod på höger atrium och en andra bipolär stimuluselektrod till den laterala vänstra ventrikeln för pacing ändamål.Pace hjärtat med hjälp av en elektrofysiologi stimulator, med den ursprungliga strömmen inställd på två gånger diastoliska tröskeln och en en-millisekkunder puls bredd. För att identifiera pacing tröskeln, tillämpa en serie av en till två-milliamp stimulans impulser med en en-millisekkunder puls bredd vid definierade pacing cykellängder för att säkerställa en konsekvent stimulans svar. Utför extra stimulus pacing med hjälp av antingen en S1, S1 eller S1, S2 pacing tåg.Minska S2 pacing cykellängd stegvis med 10 millisekunder tills pacing misslyckas med att fånga. Därefter steg upp till den näst sista pacing cykellängd och minska cykellängderna i en-millisekunder intervaller för att bestämma den mest exakta pacing cykellängd innan förlusten av fånga. För att fastställa den ventrikulära effektiva eldfasta perioden, använd stimulus elektrod på laterala vänstra ventrikeln att identifiera den kortaste S1, S2 intervall med vilken S2 för tidigt slå initierar Ventrikulärt depolarisation.För att definiera Wenckebach cykellängd, använd stimulus elektrod på höger atrium för att hitta den kortaste S1, S1 intervall med vilken en en-till-en atrioventricular ledning sprider sig via den normala överledningsvägen. För att definiera sinus noden återhämtningstid, använd stimulus elektrod på höger atrium att tillämpa en S1, S1 pacing tåg och mäta tidsfördröjningen mellan den sista impulsen i pacing tåget och återvinning av spontana sinoatrial nod medierad aktivitet. För att fastställa atrioventricular noden effektiv eldfasta perioden, använd stimulus elektrod på höger förmak.Hitta den kortaste S1, S2 kopplingsintervall med vilken den förtida förmakstimuleringen följs av en Hisbundle-potential som framkallar ett QRS-komplex, som betecknar ventricular depolarization. För optisk kartläggning av transmembranspänningen och intracellulärt kalcium, tillsätt först långsamt upp till fem milliliter nyförberedt spänningsfärgämne proximalt till aortakanylen följt av den långsamma tillsats av nyberedda kalciumfärgämnet. Placera sedan bildåtergivningsmaskinvaran för att fokusera på ett lämpligt synfält och ansluta kameran till en arbetsstation.Skaffa bilder med hjälp av den valda programvaran med en exponeringstid på 5 till två millisekunder. Och utföra en bild anpassning med hjälp av programvara som kan dela och överlagra de önskade regionerna och visa en gråskala subtraktion eller pseudo-färg utöver eventuella markera feljusteringar. Med den omgivande belysningen minimerad, testa LED-lamporna för att säkerställa en jämn och maximal epissardial belysning, som bestäms av sensorn väl djup.Sedan, bild myokardiet under sinus rytm, ventrikulärt förmaksflimmer, eller dynamisk pacing med hjälp av stimulering elektrod placerad på vänster kammare, som börjar med en pacing cykel längd på 350 millisekunder och minskar med 10 till 50 millisekunder för att generera restitution kurvor. För att bekräfta förvärvet av en optisk signal om kvalitet under hela experimentet, öppna en videofil, välj en region av intresse och rita medelvärdet fluorescens över tiden. I slutet av experimentet, ta bort hjärtat från systemet och dränera perfusatet.Skölj sedan systemet slangar och kammare med renat vatten. För rutinunderhåll, skölj regelbundet systemet med rengöringsmedelslösning efter behov. I dessa representativa studier utfördes förfarandet på intakta modeller, vilket visats, som varierade i storlek från 2,5 till 10,5 kilo kroppsvikt och 18 till 137 gram hjärtvikt.Efter att ha överfört det isolerade hjärtat till ett Langendorff-system stabiliseras hjärtfrekvensen till cirka 70 slag per minut inom cirka 10 minuter efter defibrillering och förblir konstant under hela studietiden. En genomsnittlig flödeshastighet på cirka 184 milliliter per minut mäts normalt. Det saktar till 70 milliliter per minut efter perfusing med värmt medium som innehåller en mekanisk uncoupler.Bly två EKG kan registreras under hela studiens varaktighet under sinusrytm eller som svar på yttre pacing för att kvantifiera de elektrofysiologiska parametrarna. Optiska kartläggning experiment kan också utföras under sinus rytm och spontana Ventrikulärt förmaksflimmer. Representativa bilder av ett färgämnesladdat hjärta kan erhållas med motsvarande optiska aktionspotentialer.Och kalcium transienter kan samlas in från två regioner av intresse på den episkasardiella ytan. Dessutom kan dynamisk epicardial pacing användas under den optiska kartläggning experiment för att normalisera eventuella små skillnader i den inneboende hjärtfrekvens. De råa signalerna kan användas för att avbilda verkan potentiella kalcium övergående kopplingstid, aktivering och varaktighet tid, och den elektriska och kalcium restitution.Det är viktigt att undvika att låta bubblor komma in i aorta, för att minimera tiden för överföring från djuret till systemet, och för att stödja det större hjärtat. Elektrofysiologi och optiska signaldata kan analyseras efter förvärvet. Dessutom kan hjärtat bevaras efter studien för histologi, immunfärgning eller genuttryck analys.Vi använder denna teknik för att karakterisera barnslig hjärtutveckling och för att undersöka effekterna av miljöexponeringar på hjärtfysiologi. De mekaniska uncouplers används för att minimera rörelse och anti-skum kemikalier som används för att ta itu med albumin skumning är båda giftiga, så med hjälp av lämplig personlig skyddsutrustning är absolut nödvändigt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo kultur Patient Tissue &amp; Undersökning av Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex vivo Infektion av levande vävnad med oncolytic Virus

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Förfarande för mänskliga vena Vener<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion och extern Förstärkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Validering av Nanobody och antikroppsbaserade<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumör Xenograft NIRF-imaging Experiment i möss med användning<em&gt; Ex vivo</em&gt; Flödescytometri och mikroskopi

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live avbildning av lungmetastas och deras mikromiljö

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten djurmodell för Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Inverkan av intrakardiellt nervceller på hjärtats elektrofysiologi och Arrhythmogenesis i ett Ex Vivo av System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårläkning korneal orgel kultur modell för studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Skivning och odling Gris hjärtan under fysiologiska förhållanden

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...