Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

我们感谢马克斯-普朗克实验医学研究所光显微镜设施的成员，感谢他们的专家建议和支持。

1. 赫拉细胞的种子
<ol><li>在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 2 mL 的 5 μg/mL 纤维化溶液，并将其加入 4 口井盖玻片 （#1.5） 的每个井中。在37°C和5%CO2下孵育幻灯片15分钟。</li>
	<li>用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）冲洗异步生长的HeLa细胞，并在37°C下孵育胰蛋白酶-EDTA（0.05%：0.02%;w：v）。5分钟。停止酶反应添加罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640介质辅以10%热灭活胎儿小牛血清（FCS）在3：...

在这里，我们描述了Ertych等人首先建立的方法的修改。除了其他几种修改之外，我们还将这一MT动力学分析技术与双旋转磁盘共聚焦成像相结合。使用双纺盘提高了增长的MT的分辨率，同时降低了光毒性36。通过切换到长波长荧光报告器，我们进一步减少了光漂白和激光引起的细胞损伤。与EGFP46相比，tdTomato荧光蛋白具有更高的光稳定性和亮度?...

微管（MTs）是几乎所有真核细胞和某些细菌1中发现的高度动态结构。与蛋白和中间丝一起，他们雕刻细胞骨架2，3。细胞分裂4，分子传输5，鞭拉击6，感觉周围环境通过原发性硅7，听力（基诺西）8，9，胚胎发生10，11，12，入侵和转移13，14，甚至记忆形成15，16，17，18，和许多其他过程主要依赖于MT。如果没有在生长（聚合）和收缩（去聚合）之间快速切换的非凡能力，那么，在所有这些事件中，如果MT的参与是不可能的。此属性被描述为动态不稳定19。MT动态性在许多病理条件下改变20，21，22。因此，确定此属性的性质可以帮助了解疾病机制及其后的治疗。
已经为MT动力学分析开发了一长串的方法，其中大多数都基于成像技术23。最初，宽场光学显微镜用于观察在体外24体中形成图布林聚合物。最终结合（EB）蛋白的发现，在MT加端聚集，并开发荧光标记蛋白质的方法，使得在宽场和共聚焦荧光显微镜25、26、27的活细胞中直接观察MT的行为成为可能。一个EB蛋白是最终结合蛋白3（EB3）28;通过过度表达和跟踪EB3融合到荧光蛋白，MT加端组装速率可以确定29，30。
共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）经常用于跟踪MT动力学。然而，这种成像技术带来了光毒性和光漂白的高风险，两个不良的过程活细胞和暗淡样品成像31。为了获得更好的信噪比，激光功率和曝光持续时间应足够高，同时不损坏样品，这需要牺牲分辨率以换取速度。CLSM的一个合适的替代方案是旋转磁盘显微镜32。这种成像模式基于使用Nipkow磁盘33，它包括一个带有一系列针孔的移动磁盘，并且与许多CLS显微镜同时成像同一样品34的工作相同。因此，来自激光的光将同时照亮样品中的多个区域，但会保持共聚焦性质。因此，Nipkow 磁盘允许获取类似于 CLSM 的图像，但速度更快，使用更少的激光功率。横川电机进一步改进了Nipkow圆盘，该盘引入了第二个圆盘，上面装有一系列微透镜，可单独将光线定向到各自的针孔中，进一步降低了光毒性和光漂白35。因此，旋转盘激光扫描显微镜成为活细胞成像的首选方法，并且它使得以高速31、36获得高信噪比的图像成为可能，这对解析来自快速增长的MT端信号至关重要。
MT 动态暂时不同。例如，线粒体MT比相间的37，38更动态。同样，即使在相同的细胞周期阶段，如米细胞炎39，40，也观察到生长速率和收缩的差异。因此，为了避免错误数据收集，MT 动力学的测量应限制在单元周期中的狭窄时间窗口。例如，通过用二甲基苯丙酮（DME）处理细胞，可以测量预元相中的MT动力学，这是一种抑制运动动蛋白Eg541并防止双极线轴42形成的单体模拟物。用Eg5抑制剂DME和其他单星衍生物抑制细胞在预元相不影响MT动力学43，44，45，这使得DME成为研究固定细胞和活细胞44MT动力学的有用工具。
在这里，我们将Ertych等人44描述的prometa相细胞中的MT动力学分析方法与双旋转磁盘成像相结合。该方法允许测量从单个焦平面收集的Prometa相细胞中的MT动力学，成像速率较高，但无光漂白和最小光毒性。此外，作为荧光报告员，我们使用串联二聚体番茄荧光蛋白（tdTomato），与绿色荧光蛋白（EGFP）相比，具有更高的亮度和光稳定性，并且以低能量光46激发。因此，tdTomato 需要较少的激光功率来激发，并且光毒性更少。总之，通过降低光毒性，提高MT动力学分析所需的分辨率和后处理，进一步完善了该方法。此外，我们通过将方法与其他同步技术相结合，为将来修改该方法奠定基础。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

我们描述了对确定活细胞中微管动力学的既定方法的修改。该协议基于微管正端（EB3标有tdTomato荧光蛋白）的遗传编码标记的表达，以及使用旋转盘共聚焦显微镜的高速、高分辨率活细胞成像。通过抑制线细胞中的中位体分离，实现细胞周期同步和微管密度的增加，并使用开源U-Track软件进行生长分析。使用明亮和红色转移荧光蛋白，结合较低的激光功率和减少曝光时间所需的旋转盘显微镜减少光毒性和光诱导伪影的可能性。这允许在相同的制备中成像更多细胞，同时在标准培养条件下将细胞保持在生长培养基中。由于分析以受监督的自动方式执行，因此结果在统计上是可靠的，可重现。

按照图1A中概述的给定协议，pEB3-tdTomato质粒在异步生长的HeLa细胞中瞬时表达。通过DME治疗在临元相转染后48小时与细胞同步（图1B）。此步骤可确保 MT 动力学的测量始终在细胞周期的同一阶段进行。延时电影被进一步处理和分析与U-Track v2.2.0，如其补充文件50，51，52所述。虽然加端?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

在这里，我们提出了一个强大而详细的微管动力学分析方法，在预元相中同步的细胞使用活细胞旋转磁盘共聚焦显微镜和基于MATLAB的图像处理。

通过旋转磁盘显微镜在单极式斜接主轴中测量微管动力学

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

我们在这里介绍的是一种可靠而简单的方法，用于在在相相同步的细胞中使用活细胞旋转磁盘共体成像来分析微管动力学，然后通过基于 MATLAB 的平台对图像进行分析。将红移荧光蛋白与旋转盘显微镜结合使用可降低光毒性。因此，可以在相同的准备中对更多的单元格进行成像。微管动态在大量的病理条件下被改变。因此，了解微管动力学在这些过程中的监管和行为可以帮助我们了解疾病的机制，并最终开发疗法来补偿它们。该方法也是可升级的，因此有可能在药物发现工作中应用。该方法可以通过改变荧光非同步协议和从细胞周期的不同阶段获取细胞来修改。当对微管筛选药物和识别分裂和非分裂细胞的缺陷时，这非常有用。有必要优化每个细胞类型的转染协议和播种密度。EB3的表达水平应该很低，以便检测单个生长的微管。首先在DPBS中异步生长的 HeLa 细胞，然后在 37 摄氏度下用三辛-EDTA孵育它们 5 分钟。通过添加 RPMI-1640 介质，并辅以 10% 热灭活 FCS 以 3 比 1 的比例停止尝试性，添加的 trypsin-EDTA。根据手稿方向计算细胞的浓度，将5万个细胞播种到准备好的、室的盖玻片的每个井中。将盖玻片返回孵化器，在37摄氏度和5%的二氧化碳下24小时生长细胞。第二天，从培养箱中取出细胞，滴入每个井中加入100微升的转染混合物。将细胞返回到培养箱，经过四个小时的孵育后，用新鲜培养剂补充细胞，并额外孵育20小时。在苯酚红色无 DMEM 中准备 2.5 微摩尔二甲苯胺溶液，辅以 10%FCS 和 2 毫摩尔 L-谷氨酰胺。用 DME 生长介质替换室盖唇中的生长介质，然后将细胞返回到培养箱。经过3.5小时的孵育，将细胞转移到显微镜上，将室盖玻片安装到37摄氏度和5%的二氧化碳环境室中，并配有用于成像的深色面板。然后继续孵育共四个小时。使用 100X、1.49 数值孔径、油浸目标、双磁盘共聚焦系统和可靠的自动对焦系统在倒置显微镜上执行时间推移成像。定义文本手稿中描述的成像参数。在前向中查找单元格，并在与单极线粒体主轴中心对应的 Z 平面中对焦。然后每 5 秒获取一次图像，总共一分钟，在曝光之间没有装箱和照明。首先加载数值分析软件，然后从命令窗口将 u-track V2.2.0 文件夹添加到软件搜索路径（称为影片选择器 GUI）。然后导入图像采集软件生成的原始文件。手动输入目标的数字孔径和用于成像的时间间隔。加载所有图像后，通过选择"保存为影片列表"和对话窗口右侧的 u-track 选项，将输入的时间推移系列保存为影片。从弹出式菜单中选择微图加端，然后单击"好"，这将打开一个新的对话窗口，以确定分析的三个步骤的参数。对于步骤 1，单击"设置"，然后从下拉菜单中选择彗星检测。定义高斯滤波器和流域分割差异的参数，如手稿中所述。然后选择"应用设置"到所有影片，然后单击"应用"。对于步骤 2，选择微图加端动力学，并使用设置选项根据文本手稿定义链接、间隙缩小、合并和拆分以及 Kalman 滤镜函数的值。对于尺寸问题，请从下拉菜单中选择两个，并使用五帧来缩小最大间隙，使用三帧来缩小第一步的轨道段的最小长度。与之前一样，选择"应用于所有影片的设置"，然后单击"应用"。对于步骤三，选择微图动力学分类作为跟踪分析方法，并通过设置按钮定义参数。选择用于移除影片开头和末尾的曲目的框，并制作统计直方图。从下拉列表中，选择使用前进间隙前的两到三帧，以及前进间隙速度分布的第 95 百分位，分别进行向前和向后重新分类。定义所有参数后，选择"将选中/取消选中"应用于所有影片，然后从控制窗格 u-track 窗口运行所有影片框，然后按"运行"。影片处理完成后将显示一条消息。pEB3-tdTomato质粒在希拉细胞中短暂表达。细胞与DME治疗同步。分析了微管生长的时差电影，绘制了由此产生的生长速度和动态性。为同一组时间推移影片修改了用于影响分析的参数，如最大间隙长度和最大收缩系数。计算了生长速度和动态性的相应值。虽然由此产生的增长速度没有受到显著影响，但修改最大间隙长度时，动态性不同。在所有三种情况下，微管子轨道的检测情况都相似，但当最大间隙长度设置为15时，整个MT轨迹的重建主要受到影响。为了评估成像条件是否干扰微管行为，分别对时间推移序列的第一、二部分进行了分析，并比较了相应的生长速度和动态性。如预期的那样，未检测到显著差异。重要的是要记住，因为细胞在前位同步，微管的密度非常高。因此，必须非常小心地设置分析参数，不要误认不同的微管。用这种方法对微管动力学的测量可以与其他生物靶点直接、间接地进行调节微管的研究进行比较。

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

在体内微循环在骨骼肌内重要的显微镜测量

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

科研

生物学

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

龙虎斗动粒蛋白的动态行为与染色体运动，在生活学习有丝分裂关卡<em&gt;果蝇</em&gt;合胞胚胎

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞成像继腺病毒和慢病毒转导利用共聚焦旋转盘显微镜

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

在造血干细胞和祖细胞的成年小鼠颅骨骨髓体内四维跟踪

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

使用plusTipTracker软件测量微管动力学<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;生长锥

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

高分辨率成像定时，并在活体人脐静脉内皮细胞微管动力学自动分析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

基本的有丝分裂纺锤体的重组在球形乳液液滴

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

线粒体钙和线粒体膜的同时测量通过荧光显微镜活细胞的潜在

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

高分辨率成像和芽殖酵母个人星体微管动力学分析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

荧光活细胞显微镜对微孔裂变酵母核动力学的检测

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...