Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af den lette mikroskopi facilitet, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, for deres ekspertrådgivning og støtte.

1. såning af HeLa celler
<ol><li>Der forberedes 2 ml 5 μg/ml fibronektin opløsning i fosfat bufferet saltvand (PBS) og tilsættes 450 μl af det i hver brønd af en 4 brøndkammer dækseddel (#1.5). Inkubaten i 15 min ved 37 °C og 5% CO2.</li>
	<li>Skyl de asynkront voksende HeLa-celler med Dulbecco's fosfat bufferet saltvand (DPBS) og Inkuber med trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min ved 37 °C. Stop den enzymatiske reaktion ved tilsætning af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supple...

Her beskriver vi en ændring af en metode, der først blev fastlagt af Ertych et al.44. Sammen med flere andre modifikationer kombinerer vi denne teknik med MT Dynamics Analysis med Dual spinning disk konfokale Imaging. Brugen af Dual spinning disk forbedrer opløsningen af voksende MTs samtidig reducere fototoksicitet36. Vi reducerer yderligere foto blegning og laser lys-induceret beskadigelse af cellerne ved at skifte til en længere bølgelængde fluorescerende reporter....

Mikrotubuler (MTs) er meget dynamiske strukturer, der findes i næsten alle eukaryotiske celler og i nogle bakterier1. Sammen med actin og mellemliggende filamenter, de Sculpt cytoskelet2,3. Celle division4, molekyle transport5, flagellar slå6, fornemmelsen af det omgivende miljø gennem primær cilium7, hørelse (kinocilium)8,9, embryoGenesis 10,11,12, invasion og metastase13,14, og endda hukommelse dannelse15,16,17,18, og mange andre processer primært stole på MTs. deltagelse af MTs i alle disse begivenheder ville være umuligt uden deres bemærkelsesværdige evne til hurtigt at skifte mellem vækst (polymerisering) og svind (depolymerisering). Denne egenskab beskrives som dynamisk ustabilitet19. MT dynamicity er ændret i mange patologiske tilstande20,21,22. Derfor, bestemme karakteren af denne egenskab kan bidrage til at forstå sygdomsmekanismer og efterfølgende deres behandling.
En lang liste af metoder er blevet udviklet til MT Dynamics analyse, hvoraf de fleste er baseret på billeddiagnostiske teknikker23. I første omgang, bred felt lys mikroskoper blev brugt til at observere dannelsen af Tubulin polymerer in vitro24. Opdagelsen af end-binding (EB)-proteiner, der samler på Mt plus-Ends og udviklingen af metoder til fluorescently label proteiner gjorde det muligt at observere opførsel af MTs direkte i levende celler med bred felt og confokale fluorescens mikroskoper25,26,27. Et EB-protein er bindende protein 3 (EB3)28; ved at over udtrykke og spore EB3 smeltet til et fluorescerende protein kan MT plus-end-samlings hastigheder bestemmes29,30.
Confokal Laserscanning Fluorescens mikroskopi (CLSM) bruges ofte til at følge MT Dynamics. Men denne billeddiagnostiske teknik udgør en høj risiko for fototoksicitet og foto blegning, to uønskede processer for levende celle og Dim prøve billeddannelse31. For at opnå et bedre signal-til-støj-forhold, bør laser effekten og eksponeringsvarigheden være høj nok, mens den ikke beskadiger prøverne, og dette kræver at ofre opløsningen i bytte for hastighed. Et egnet alternativ til CLSM er spinning disk mikroskopi32. Denne billedbehandlings modalitet er baseret på brugen af en Nipkow disk33, som består af en bevægende disk med en række pinholes, og fungerer ækvivalent til mange CLS mikroskoper, der afbilder den samme prøve samtidig34. Derfor lyser lyset fra laseren flere regioner i prøven samtidig, men bevarer den konfokale natur. Nipkow disk giver derfor mulighed for at få billeder, der ligner CLSM, men hurtigere og bruge mindre laser kraft. Nipkow disken blev yderligere forbedret af Yokogawa Electric, som introducerede en anden disk med en række mikrolinser på den, der individuelt direkte lys ind i et respektive hul, yderligere reducere fototoksicitet og foto blegning35. Således, spinning disk Laserscanning mikroskopi blev en metode til valg for levende celle Imaging, og det gør det muligt at opnå billeder med høj signal-til-støj-forhold ved en høj hastighed31,36, som er afgørende for at løse signaler som dem fra den hurtigtvoksende MT ender.
MT Dynamics varierer midlertidigt. For eksempel, den mitotiske MTs er mere dynamisk end Interphase dem37,38. Tilsvarende er forskelle i vækstraten og svind blevet observeret selv inden for den samme celle cyklus fase, såsom mitose39,40. For at undgå falsk dataindsamling bør målingen af MT Dynamics derfor begrænses til et snævert tidsvindue under cellecyklussen. For eksempel kan måling af MT dynamik i prometaphase opnås ved at behandle cellerne med dimethylenastron (DME), en monastrol analog, der hæmmer motorens kinesin Eg541 og forhindrer dannelsen af den bipolære mitotiske spindel42. Hæmning af cellerne i prometaphase med Eg5-hæmmer DME og andre monastrol-derivater påvirker ikke MT Dynamics43,44,45, hvilket gør DME til et nyttigt værktøj til at studere MT Dynamics både i faste og levende celler44.
Her kombinerer vi metoden til MT Dynamics Analysis i prometaphase celler beskrevet af Ertych et al.44 med Dual spinning disk imaging. Denne metode gør det muligt at måle MT dynamikken i prometaphase celler indsamlet fra et enkelt brændplan med en højere billedhastighed, men uden foto blegning og minimal fototoksicitet. Desuden bruger vi som fluorescerende reporter tandem dimer tomat fluorescerende protein (tdTomato), som har forbedret lysstyrke og foto stabilitet i forhold til det grønne fluorescerende protein (EGFP) og er spændt med lavere energi lys46. Derfor tdTomato kræver mindre laser effekt for excitation og er mindre fototoksisk. I alt forbedrer vi yderligere metoden ved at reducere foto toksiciteten og forbedre den opløsning og efter behandling, der kræves til MT Dynamics-analysen. Derudover skaber vi et grundlag for fremtidige ændringer af metoden ved at kombinere den med andre synkroniserings teknikker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Vi beskriver en ændring af en etableret metode til at bestemme mikrotubulus dynamik i levende celler. Protokollen er baseret på et udtryk for en genetisk kodet markør for de positive ender af microtubuler (EB3 mærket med tdTomato fluorescerende protein) og høj hastighed, høj opløsning, levende celle Imaging ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi. Celle cyklus synkronisering og øget tæthed af microtubuler opnås ved at hæmme centrosomal separation i mitotiske celler, og analyse af vækst udføres ved hjælp af open-source U-track software. Brugen af en lys og rød-skiftede fluorescerende protein, i kombination med den lavere laser effekt og reduceret eksponeringstid kræves for spinning disk mikroskopi reducere fototoksicitet og sandsynligheden for lys-induceret artefakter. Dette giver mulighed for at afbilde et større antal celler i det samme præparat og samtidig opretholde cellerne i et vækstmedium under standard dyrkningsbetingelser. Da analysen udføres på en overvåget automatisk måde, er resultaterne statistisk robuste og reproducerbare.

Efter den givne protokol, som er skitseret i figur 1a, blev PEB3-tdTomato plasmid transitivt udtrykt i asynkront voksende Hela-celler. Cellerne blev synkroniseret 48 h efter transfektering ved prometaphase gennem DME-behandling (figur 1b). Dette trin sikrede, at målingen af MT Dynamics altid blev udført i samme fase af cellecyklussen. Time-lapse-filmene blev yderligere behandlet og analyseret med U-track v 2.2.0 som beskrevet i den supplerende dokumentation<su...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Her præsenterer vi en robust og detaljeret metode til mikrotubule Dynamics analyse i celler synkroniseret i prometaphase ved hjælp af Live-Cell spinning disk confokal mikroskopi og MATLAB-baserede billedbehandling.

Måling af dynamik i Mikrotubulen ved spinding af Diskmikroskopi i monopolære mitotiske spindler

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Hvad vi præsenterer her er en robust og enkel metode til at analysere microtubule dynamik ved hjælp af live-celle spinning disk konfokale billeddannelse i celler synkroniseret i prometaphase, og billeder analyseres efterfølgende på en MATLAB-baseret platform. Brugen af rød-forskinnede fluorescerende protein i kombination med spinning disk mikroskopi reducerer fototoksicitet. Derfor kan et større antal celler afbildes inden for samme præparat.Mikrotubule dynamik ændres i en lang række patologiske forhold. Derfor kan forståelse af regulering og adfærd mikrotubule dynamik i disse processer hjælpe os med at forstå sygdomsmekanismen, og i sidste ende, udvikle behandlinger for at kompensere for dem. Og metoden er også opskaleres, så det potentielt kunne anvendes i et lægemiddel opdagelse indsats.Metoden kan ændres ved at ændre fluorescensdesynkroniseringsprotokollen og få celler fra forskellige faser af cellecyklussen. Dette kan være nyttigt, når screening narkotika mod mikrotubuli og identificere defekt på dividere og ikke-dividere celler. Det er nødvendigt at optimere transfektionsprotokollen og såningstætheden for hver celletype.EKSPRESSIONSniveauet for EB3 bør være lavt for at detektere enkelte voksende mikrotubuli. Start med at skylle asynkront voksende HeLa-celler i DPBS, derefter inkubere dem med trypsin-EDTA i fem minutter, ved 37 grader Celsius. Stop trypsinisering ved at tilføje RPMI-1640 medium suppleret med 10% varme inaktiveret FCS på en tre til en ratio, den ekstra trypsin-EDTA.Beregn koncentrationen af cellerne i henhold til manuskript retninger, og frø 50, 000 celler i hver brønd af en forberedt, chambered coverslip. Returner dækslålen til inkubatoren, og dyrk celler i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. På den næste dag, fjerne cellerne fra inkubatoren, og drop-wise tilføje 100 mikroliter af transfektion blandingen i hver brønd.Returner cellerne til inkubatoren, og efter fire timers inkubation supplere cellerne med frisk medium og desuden inkubere i 20 timer. Forbered en 2,5 mikromolar opløsning af dimethylenastron, eller DME, i phenol rødfri DMEM, suppleret med 10% FCS og to millimolar L-glutamin. Udskift vækstmediet i den kammererede dækslæb med DME-vækstmediet, og vend cellerne tilbage til kuvøsen.Efter 3,5 timers inkubation overføres cellerne til mikroskopet ved at montere den chambered coverslip i et miljøkammer, der er indstillet til 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, med mørke paneler til billeddannelse. Fortsæt derefter inkubationen i i alt fire timer. Udfør time lapse imaging på et omvendt mikroskop med en 100X, 1,49 numerisk blænde, olie nedsænkning mål, en dobbelt disk konfokale system, og en pålidelig auto fokus system.Definer billedparametrene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Find en celle i prophase, og fokus i Z-flyet svarende til midten af monopolar mitotisk spindel. Derefter erhverve billeder hvert 5 sekund, over i alt et minut, uden binning og ingen belysning mellem eksponeringer.Start med at indlæse den numeriske analysesoftware og tilføje mappen U-track V2.2.0 i softwaresøgestien, kaldet filmvælgeren GUI, fra kommandovinduet. Importer derefter de rå filer, der genereres af billedopkøbssoftwaren. Indtast objektivåbningen manuelt for målsætningen og det tidsinterval, der bruges til billeddannelse.Når alle billederne er indlæst, skal du gemme den indtastede time lapse-serie som en film ved at vælge Gem som filmliste og u-track-indstillingen i højre side af dialogvinduet. Vælg microtubule plus-ends i pop op-menuen, og klik på okay, som åbner et nyt dialogvindue for at bestemme parametrene for de tre trin i analysen. For trin et skal du klikke på indstillinger og vælge kometregistrering i rullemenuen.Definer parametrene for forskellen mellem gaussisk filter og skelsættende segmentering, som beskrevet i manuskriptet. Vælg derefter anvend indstillinger for alle film, og klik på Anvend. For trin to skal du vælge mikrotubule plus-end-dynamikken og bruge indstillingsindstillingerne til at definere værdierne for sammenkædning, gap closing, sammenlægning og opdeling og Kalman-filterfunktioner i henhold til tekstmanuskriptet.I forbindelse med problemer med dimensionalitet skal du vælge to i rullemenuen og bruge fem billeder til maksimal afstand, der skal lukkes, og tre rammer for mindste længde af sporsegmenter fra første trin. Som før skal du vælge Anvend indstillinger på alle film og klikke på Anvend. I tredje trin skal du vælge klassificering af microtubule dynamics som en sporanalysemetode og definere parametrene via indstillingsknappen.Markér felterne for at fjerne spor i starten og slutningen af filmen, og lav statistik histogrammer. På rullelisten skal du vælge ved hjælp af to til tre billeder før fremadgående mellemrum og 95. Når alle parametre er defineret, skal du markere marker/fjerne markeringen i alle film og køre alle filmbokse fra kontrolruden u-track-vinduet og derefter trykke på kør.Der vises en meddelelse, når filmbehandlingen er fuldført. PEB3-tdTomato plasmid blev forbigående udtrykt i HeLa-celler. Cellerne blev synkroniseret med DME-behandling.Time lapse film af microtubule vækst blev analyseret, og den deraf følgende væksthastighed og dynamik blev plottet. De parametre, der er beskrevet for at påvirke analysen, såsom maksimal hullængde og maksimal krympningsfaktor, blev ændret for det samme sæt tidsforfaldsfilm. De tilsvarende værdier for væksthastighed og dynamik blev beregnet.Mens den deraf følgende væksthastighed ikke blev væsentligt påvirket, var dynamikken anderledes, da den maksimale hullængde blev ændret. I alle tre tilfælde var påvisningen af mikrotubule underspor ens, men genopbygningen af de fulde MT-baner blev for det meste påvirket, da den maksimale længde på gabet blev sat til 15. For at vurdere, om billeddannelsesforholdene forstyrrede mikrotubuleadfærden, blev første og anden halvdel af tidsforfaldsserien analyseret separat, og den tilsvarende væksthastighed og dynamik blev sammenlignet.Som forventet blev der ikke konstateret væsentlige forskelle. Det er vigtigt at huske på, at fordi cellerne er synkroniseret i prometaphase, tætheden af microtubule er meget høj. Derfor er man nødt til at indstille parametrene for analysen meget omhyggeligt, ikke at fejlidentificere forskellige mikrotubule.Måling af mikrotubuledynamik med denne metode kan sammenlignes med undersøgelser af andre biologiske mål direkte, indirekte, regulering af mikrotubuli.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studere Mitotisk Checkpoint ved at illustrere Dynamic Kinetochore Protein Adfærd og kromosom Motion i levende<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryoner

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live-Cell Imaging Primary Rat Neonatal cardiomyocytes Efter Adenoviral og Lentiviral Transduktion Brug Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Brug plusTipTracker Software til måling mikrotubulære Dynamics i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vækstkegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Rekonstituering af Basic mitosespindler i Sfæriske emulsionsdråberne

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøgelse af mitotisk og meiotisk fission gær nuklear dynamik ved fluorescens levende celle mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...