Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
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Nous remercions les membres de l'installation de microscopie légère, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, pour leurs conseils et leur soutien.

1. Ensemencement des cellules HeLa
<ol><li>Préparer 2 ml de solution de fibronectin de 5 g/mL dans la saline tamponnée au phosphate (PBS) et en ajouter 450 l dans chaque puits d'un bordereau de couverture de 4 puits bien chambré (#1,5). Incuber la glissière pendant 15 min à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	<li>Rincer asynchronement les cellules HeLa en croissance asynchrone avec la saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco et incuber avec la trypsine-EDTA (0,05 % : 0,02 %; w:v) pendant 5 min à 37 oC....

Ici, nous décrivons une modification d'une méthode établie pour la première fois par Ertych et al.,44. Avec plusieurs autres modifications, nous combinons cette technique d'analyse de dynamique de MT avec l'imagerie confocale de disque de rotation double. L'utilisation du disque à double filature améliore la résolution des MT en croissance tout en réduisant la phototoxicité36. Nous réduisons davantage les dommages causés par le photoblanchiment et la lumière las...

Les microtubules (MT) sont des structures très dynamiques que l'on trouve dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes et dans certaines bactéries1. Avec l'actine et les filaments intermédiaires, ils sculptent le cytosquelette2,3. Division cellulaire4, transport de molécules5, flagellateur battant6, la sensation de l'environnement environnant à travers le cilium primaire7, audition (kinocilium)8,9, embryogenèse10,11,12, invasion et métastes13,14, et même la formation de la mémoire15,16,17,18, et beaucoup d'autres processus reposent principalement sur les MT. La participation des MT à tous ces événements serait impossible sans leur remarquable capacité à passer rapidement de la croissance (polymérisation) au rétrécissement (dépolymérisation). Cette propriété est décrite comme l'instabilité dynamique19. La dynamique MT est altérée dans de nombreuses conditions pathologiques20,21,22. Par conséquent, la détermination de la nature de cette propriété peut aider à comprendre les mécanismes de la maladie et, par la suite, leur traitement.
Une longue liste de méthodes a été développée pour l'analyse de la dynamique MT, dont la plupart sont basées sur des techniques d'imagerie23. Initialement, des microscopes à lumière à large champ ont été utilisés pour observer la formation de polymères de tubuline in vitro24. La découverte de protéines liantes finales (EB) qui s'accumulent à MT plus-ends et le développement de méthodes pour étiqueter les protéines fluorescentes ont permis d'observer le comportement des MT directement dans les cellules vivantes avec large champ et microscopes à fluorescence confocale25,26,27. Une protéine EB est la protéine liant fin 3 (EB3)28; en surexprimant et en suivant EB3 fusionné à une protéine fluorescente, les taux d'assemblage MT plus-extrémité peuvent être déterminés29,30.
La microscopie par fluorescence par laser confocal (CLSM) est fréquemment utilisée pour suivre la dynamique du MT. Cependant, cette technique d'imagerie pose un risque élevé de phototoxicité et de photoblanchiment, deux processus indésirables pour les cellules vivantes et l'imagerie de l'échantillon faible31. Afin d'obtenir un meilleur rapport signal-bruit, la puissance laser et la durée d'exposition doivent être suffisamment élevées tout en n'endommageant pas les échantillons, ce qui nécessite de sacrifier la résolution en échange de la vitesse. Une alternative appropriée au CLSM est la microscopie de disque tournante32. Cette modalité d'imagerie est basée sur l'utilisation d'un disque Nipkow33, qui se compose d'un disque en mouvement portant un tableau de trous d'épingle, et fonctionne de façon équivalente à de nombreux microscopes CLS imagerie du même échantillon simultanément34. Par conséquent, la lumière du laser illuminera plusieurs régions de l'échantillon simultanément, mais conservera la nature confocale. Le disque Nipkow permet donc d'obtenir des images similaires à CLSM, mais plus rapidement et en utilisant moins de puissance laser. Le disque Nipkow a été encore amélioré par Yokogawa Electric, qui a introduit un deuxième disque avec un tableau de microlentilles sur elle que la lumière individuellement diriger dans un trou d'épingle respectif, réduisant encore la phototoxicité et photoblanchiment35. Ainsi, la microscopie de balayage laser de disque de rotation est devenue une méthode de choix pour l'imagerie cellulaire vivante, et il permet d'obtenir des images avec le rapport signal-bruit élevé à une vitesse élevée31,36, qui est crucial pour résoudre des signaux tels que ceux des extrémités de MT à croissance rapide.
La dynamique MT diffère temporairement. Par exemple, les MT mitotiques sont plus dynamiques que les MTinterphases 37,38. De même, des différences dans le taux de croissance et le rétrécissement ont été observées même au sein de la même phase du cycle cellulaire, comme la mitose39,40. Par conséquent, pour éviter la collecte de fausses données, la mesure de la dynamique MT devrait être limitée à une fenêtre temporelle étroite pendant le cycle cellulaire. Par exemple, la mesure de la dynamique de MT dans prometaphase peut être réalisée en traitant les cellules avec le diméthylenastron (DME), un analogue monastrol qui inhibe la kinésine de moteur Eg541 et empêche la formation du fuseau mitotique bipolaire42. L'inhibition des cellules à proméaphase avec Eg5 inhibiteur DME et autres dérivés monastrol n'affecte pas la dynamique MT43,44,45, ce qui rend DME un outil utile pour étudier la dynamique MT à la fois dans les cellules fixes et vivantes44.
Ici nous combinons la méthode de l'analyse de dynamique de MT dans les cellules de proméaphase décrites par Ertych et autres44 avec la formation image de disque de double rotation. Cette méthode permet de mesurer la dynamique mT dans les cellules proméaphase recueillies à partir d'un seul plan focal avec un taux d'imagerie plus élevé, mais sans photoblanchiment et phototoxicité minimale. En outre, en tant que journaliste fluorescent, nous utilisons tandem dimer protéine fluorescente tomate (tdTomato) qui a amélioré la luminosité et la photostabilité par rapport à la protéine fluorescente verte (EGFP) et est excité avec une lumière d'énergie plus faible46. Par conséquent, tdTomato nécessite moins de puissance laser pour l'excitation et est moins phototoxique. Au total, nous améliorons encore la méthode en réduisant la phototoxicité et en améliorant la résolution et le post-traitement requis pour l'analyse de la dynamique MT. En outre, nous créons une base pour les modifications futures de la méthode en la combinant avec d'autres techniques de synchronisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Nous décrivons une modification d'une méthode établie pour déterminer la dynamique de microtubule dans les cellules vivantes. Le protocole est basé sur l'expression d'un marqueur génétiquement codé pour les extrémités positives des microtubules (EB3 étiquetés avec la protéine fluorescente tdTomato) et à haute vitesse, haute résolution, imagerie à cellules vivantes à l'aide de la microscopie confocale du disque filature. La synchronisation du cycle cellulaire et l'augmentation de la densité des microtubules sont obtenues en inhibant la séparation centrosomale dans les cellules mitotiques, et l'analyse de la croissance est effectuée à l'aide du logiciel Open-Track. L'utilisation d'une protéine fluorescente brillante et rouge décalée, en combinaison avec la puissance laser inférieure et le temps d'exposition réduit requis pour la microscopie de disque de rotation réduisent la phototoxicité et la probabilité des artefacts induits par la lumière. Cela permet d'imagerie d'un plus grand nombre de cellules dans la même préparation tout en maintenant les cellules dans un milieu de croissance dans des conditions de culture standard. Étant donné que l'analyse est effectuée de façon automatique supervisée, les résultats sont statistiquement robustes et reproductibles.

Suivant le protocole donné décrit dans la figure 1A,le plasmide pEB3-tdTomato a été exprimé transitoirement dans les cellules De HeLa en croissance asynchrone. Les cellules ont été synchronisées 48 h après la transfection à proméaphase par le traitement DME (Figure 1B). Cette étape a permis de s'assurer que la mesure de la dynamique mT était toujours effectuée à la même phase du cycle cellulaire. Les films en time-lapse ont été traités et anal...

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Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d'analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d'image MATLAB-basé.

Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Ce que nous présentons ici est une méthode robuste et simple pour analyser la dynamique des microtubules à l’aide de l’imagerie confocale du disque de filature à cellules vivantes dans des cellules synchronisées dans la prométaphe, et les images sont ensuite analysées sur une plate-forme basée sur MATLAB. L’utilisation de protéines fluorescentes à décale rouge en combinaison avec la microscopie à disque filature réduit la phototoxicité. Par conséquent, un plus grand nombre de cellules peuvent être photographiées dans la même préparation.La dynamique des microtubules est altérée dans un grand nombre de conditions pathologiques. Par conséquent, la compréhension de la régulation et le comportement de la dynamique des microtubules dans ces processus peut nous aider à comprendre le mécanisme de la maladie, et éventuellement, le développement de thérapies pour compenser pour eux. Et la méthode est également haut de gamme, de sorte qu’il pourrait potentiellement être appliqué dans un effort de découverte de médicaments.La méthode peut être modifiée en modifiant le protocole de désynchronisation de la fluorescence et en obtenant des cellules de différentes phases du cycle cellulaire. Ceci peut être utile lors du criblage des médicaments contre les microtubules et de l’identification des défauts sur les cellules de division et de non-division. Il est nécessaire d’optimiser le protocole de transfection et la densité d’ensemencement pour chaque type de cellule.Le niveau d’expression de l’EB3 devrait être faible, afin de détecter les microtubules à croissance unique. Commencez par rincer les cellules HeLa à croissance asynchrone dans DPBS, puis incubez-les avec de la trypsine-EDTA pendant cinq minutes, à 37 degrés Celsius. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant RPMI-1640 moyen complété par 10% de chaleur inactivée FCS à un rapport de trois contre un, la trypsine ajoutée-EDTA.Calculez la concentration des cellules selon les instructions manuscrites, et ensemencez 50 000 cellules dans chaque puits d’un coverslip préparé et chambé. Retournez le coverslip à l’incubateur, et cultivez des cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez les cellules de l’incubateur et ajoutez 100 microlitres de mélange de transfection dans chaque puits.Retourner les cellules à l’incubateur, et après quatre heures d’incubation compléter les cellules avec un milieu frais et en plus incuber pendant 20 heures. Préparer une solution micromolaire de 2,5 micromolairestron, ou DME, en phénol rouge libre DMEM, complétée par 10%FCS et deux millimolaire L-glutamine. Remplacez le milieu de croissance dans le coverslip chambé par le milieu de croissance DME, et retournez les cellules à l’incubateur.Après 3,5 heures d’incubation, transférez les cellules au microscope en montant le couvercle chambé dans une chambre environnementale réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, avec des panneaux foncés pour l’imagerie. Ensuite, continuez l’incubation pendant un total de quatre heures. Effectuez l’imagerie en accéléré sur un microscope inversé avec une ouverture numérique 100X, 1,49, un objectif d’immersion d’huile, un système confocal à double disque et un système de mise au point automatique fiable.Définissez les paramètres d’imagerie tels que décrits dans le manuscrit du texte. Trouvez une cellule en prophase et concentrez-vous dans le plan Z correspondant au centre du fuseau mitotique monopolisaire. Puis acquérir des images toutes les 5 secondes, sur un total d’une minute, sans binning et sans éclairage entre les expositions.Commencez par charger le logiciel d’analyse numérique et en ajoutant le dossier V2.2.0 u-track dans le chemin de recherche logiciel, appelé gui sélecteur de film, à partir de la fenêtre de commande. Ensuite, importez les fichiers bruts générés par le logiciel d’acquisition d’images. Entrez manuellement l’ouverture numérique de l’objectif et l’intervalle de temps utilisé pour l’imagerie.Une fois que toutes les images sont chargées, enregistrez la série time lapse saisie en tant que film en sélectionnant enregistrer comme liste de films, et l’option u-track sur le côté droit de la fenêtre de dialogue. Sélectionnez microtubule plus-extrémités du menu pop-up, et cliquez bien, ce qui ouvre une nouvelle fenêtre de dialogue pour déterminer les paramètres des trois étapes de l’analyse. Pour la première étape, cliquez sur paramètres et sélectionnez la détection des comètes à partir du menu drop down.Définissez les paramètres de la différence du filtre gaussien et de la segmentation du bassin versant, tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, sélectionnez appliquer les paramètres à tous les films et cliquez sur appliquer. Pour la deuxième étape, sélectionnez la dynamique microtubule plus-end, et utilisez les options de réglage pour définir les valeurs pour relier, combler les écarts, fusionner et fractionner, et kalman fonctions de filtre, selon le manuscrit du texte.Pour les problèmes de dimensionnalité, choisissez-en deux dans le menu drop down et utilisez cinq images pour combler l’écart maximal, et trois images pour une longueur minimale de segments de piste dès la première étape. Comme auparavant, sélectionnez appliquer les paramètres à tous les films et cliquez sur appliquer. Pour la troisième étape, choisissez la classification de la dynamique des microtubules comme méthode d’analyse de la voie et définissez les paramètres à l’aide du bouton de réglage.Sélectionnez les cases pour supprimer les pistes au début et à la fin du film, et faites des histogrammes statistiques. De la liste de drop down, sélectionnez en utilisant deux à trois images avant l’écart vers l’avant, et 95e percentile de la répartition de la vitesse d’écart vers l’avant, pour le reclassement vers l’avant et vers l’arrière, respectivement. Une fois que tous les paramètres sont définis, sélectionnez appliquer check/uncheck à tous les films, et exécuter toutes les boîtes de films à partir de la fenêtre de contrôle panes u-track, puis appuyez sur exécuter.Un message est affiché une fois le traitement de film terminé. Le plasmide pEB3-tdTomato a été transitoirement exprimé dans les cellules hela. Les cellules ont été synchronisées avec le traitement de DME.Des films de time lapse de croissance de microtubule ont été analysés, et la vitesse de croissance et la dynamique résultantes ont été tracées. Les paramètres décrits pour affecter l’analyse, tels que la longueur maximale de l’écart et le facteur de rétrécissement maximal, ont été modifiés pour le même ensemble de films de laps de temps. Les valeurs correspondantes de vitesse de croissance et de dynamique ont été calculées.Bien que la vitesse de croissance qui en résulte n’ait pas été affectée de façon significative, la dynamique était différente lorsque la longueur maximale de l’écart a été modifiée. Dans les trois cas, la détection des sous-voies de microtubule était semblable, pourtant la reconstruction des trajectoires pleines de MT a été la plupart du temps affectée quand la longueur maximale d’écart a été réglée à 15. Afin d’évaluer si les conditions de formation image ont interféré avec le comportement de microtubule, les première et deuxième moitiés de la série de laps de temps ont été analysées séparément, et la vitesse de croissance correspondante et la dynamique ont été comparées.Comme prévu, aucune différence significative n’a été détectée. Il est important de garder à l’esprit, que parce que les cellules sont synchronisées dans la prométaphe, la densité du microtubule est très élevée. Par conséquent, il faut définir les paramètres de l’analyse très soigneusement, de ne pas mal identifier différents microtubules.La mesure de la dynamique des microtubules avec cette méthode peut être comparée à des études d’autres cibles biologiques régulant directement, indirectement, les microtubules.

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