Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
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हम प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा, मैक्स-प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन के सदस्यों को उनकी विशेषज्ञ सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।

1. हेला कोशिकाओं की सीडिंग
<ol><li>फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में 5 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन समाधान के 2 mL तैयार करें और इसके बारे में 450 माइक्रोन को 4 अच्छी तरह से चैम्बर कवरस्लिप (#1.5) के प्रत्येक कुएं में जोड़ें। स्?...

यहां, हम पहले एर्टिच एट अल44द्वारा स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। कई अन्य संशोधनों के साथ, हम एमटी गतिशीलता विश्लेषण की इस तकनीक को दोहरी कताई डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ जोड़ते है?...

माइक्रोट्यूबबुल (एमटी) अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में और कुछ बैक्टीरिया1में पाई जाती हैं। ऐक्टिन और इंटरमीडिएट फिलामेंट्स के साथ मिलकर वे साइटोस्केलेटन2,3को मूर्तिकला देते हैं । सेल डिवीजन4, अणु परिवहन5,फ्लैगेलर बीटिंग6,प्राइमरी सिलियम7के माध्यम से आसपास के वातावरण की अनुभूति, श्रवण (किनोसिलियम),8,9, भ्रूणजनजी10,11,12,आक्रमण और मेटाटैसिस13,14,और यहां तक कि स्मृति गठन15,16,17,18, और कई अन्य प्रक्रियाएं मुख्य रूप से एमटी पर भरोसा करती हैं। इन सभी घटनाओं में एमटी की भागीदारी विकास (बहुलककरण) और सिकुड़न (डिपॉलीमराइजेशन) के बीच तेजी से स्विच करने की उनकी उल्लेखनीय क्षमता के बिना असंभव होगी। इस संपत्ति को गतिशील अस्थिरता19बताया गया है । एमटी गतिशीलता कई रोग स्थितियों में बदल जाती है20,21,22. इसलिए, इस संपत्ति की प्रकृति का निर्धारण रोग तंत्र और बाद में उनके उपचार को समझने में मदद कर सकता है।
एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए तरीकों की एक लंबी सूची विकसित की गई है, जिनमें से अधिकांश इमेजिंगतकनीक23पर आधारित हैं। प्रारंभ में, विट्रो24में ट्यूबलिन पॉलिमर के गठन को देखने के लिए व्यापक क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। अंत बाध्यकारी (ईबी) की खोज- प्रोटीन जो एमटी प्लस-सिरों पर एकत्र होते हैं और प्रोटीन को फ्लोरोसेंटी लेबल करने के तरीकों के विकास ने व्यापक क्षेत्र और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप25,26,27के साथ जीवित कोशिकाओं में सीधे एमटी के व्यवहार का पालन करना संभव बनाया। एक ईबी-प्रोटीन एंड-बाइंडिंग प्रोटीन 3 (ईबी3)28है; अतिव्यक्त करने और ट्रैकिंग EB3 एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े द्वारा, मीट्रिक टन प्लस अंत विधानसभा दरों29,30निर्धारित किया जा सकता है ।
कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग अक्सर एमटी गतिशीलता का पालन करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह इमेजिंग तकनीक फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग, लाइव सेल और मंद नमूना इमेजिंग31के लिए दो अवांछनीय प्रक्रियाओं का उच्च जोखिम बन गई है। आदेश में एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, लेजर शक्ति और जोखिम अवधि काफी उच्च होना चाहिए, जबकि नमूनों को नुकसान नहीं है, और यह गति के बदले में संकल्प त्याग की आवश्यकता है । सीएलएसएम का एक उपयुक्त विकल्प डिस्क माइक्रोस्कोपी32कताई है। यह इमेजिंग मोडलिटी एक निको डिस्क33के उपयोग पर आधारित है, जिसमें पिनहोल की एक सरणी वाले एक चलती डिस्क होती है, और एक ही नमूने को एक साथ34इमेजिंग करने वाले कई सीएलएस माइक्रोस्कोप के समान रूप से काम करती है। इसलिए, लेजर से प्रकाश नमूने में कई क्षेत्रों को एक साथ रोशन करेगा लेकिन कॉन्फोकल प्रकृति को बनाए रखेगा। निकोडिस्क, इसलिए, सीएलएसएम के समान छवियों को प्राप्त करने और तेजी से और कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की अनुमति देता है। निकोवा डिस्क को योकोगावा इलेक्ट्रिक द्वारा और बेहतर किया गया था, जिसने उस पर माइक्रोलेंस की एक सरणी के साथ एक दूसरी डिस्क पेश की जो व्यक्तिगत रूप से एक संबंधित पिनहोल में प्रत्यक्ष प्रकाश, फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग35को कम करती है। इस प्रकार, कताई डिस्क लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग के लिए पसंद की एक विधि बन गई, और यह उच्च गति31,36पर उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ छवियों को प्राप्त करना संभव बनाता है, जो तेजी से बढ़ते मीट्रिक सिरों से संकेतों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है।
मीट्रिक टन गतिशीलता अस्थायी रूप से भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक एमटी इंटरफेज वाले37,38की तुलना में अधिक गतिशील होते हैं। इसी प्रकार, विकास दर और सिकुड़न में अंतर एक ही सेल चक्र चरण के भीतर भी देखा गया है, जैसे माइटोसिस39,40। इसलिए, झूठे डेटा संग्रह से बचने के लिए, एमटी गतिशीलता का माप सेल चक्र के दौरान एक संकीर्ण समय-खिड़की तक सीमित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रोमेथेराफेज में एमटी गतिशीलता का माप नप डायमेथिलेंस्ट्रॉन (डीएमई) के साथ कोशिकाओं का इलाज करके प्राप्त किया जा सकता है, एक मोनोस्ट्रोल एनालॉग जो मोटर किनेसिन Eg541 को रोकता है और द्विध्रुवी माइटोटिक स्पिंडल42के गठन को रोकता है। Eg5 अवरोधक डीएमई और अन्य मोनोस्ट्रोल डेरिवेटिव के साथ प्रोमेटाफेज में कोशिकाओं का अवरोध एमटी गतिशीलता43,44,45को प्रभावित नहीं करता है, जो डीएमई को निश्चित और जीवित कोशिकाओंदोनोंमें एमटी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाता है ।
यहां हम ड्यूल कताई डिस्क इमेजिंग के साथ एर्टिच एट अल44 द्वारा वर्णित प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता विश्लेषण की विधि को जोड़ते हैं। यह विधि उच्च इमेजिंग दर के साथ एक ही फोकल प्लेन से एकत्र की गई प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता की माप की अनुमति देती है, फिर भी फोटोब्लीचिंग और न्यूनतम फोटोटॉक्सिकिटी के बिना। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में, हम मिलकर डामर टोमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (टीडीटमाटर) का उपयोग करते हैं जिसने हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की तुलना में चमक और फोटोस्थिरता में सुधार किया है और कम ऊर्जा प्रकाश46से उत्साहित है। इसलिए, टीडीमैटो को उत्तेजना के लिए कम लेजर पावर की आवश्यकता होती है और यह कम फोटोटॉक्सिक है। कुल मिलाकर, हम फोटोटॉक्सिकिटी को कम करके और एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए आवश्यक संकल्प और पोस्टप्रोसेसिंग में सुधार करके विधि में और सुधार करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम अन्य सिंक्रोनाइजेशन तकनीकों के साथ इसे जोड़कर विधि के भविष्य के संशोधनों के लिए एक आधार बनाते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

हम जीवित कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल माइक्रोट्यूब्यूल्स (टीडीटोमेटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए EB3) और हाई-स्पीड, हाई-रेजोल्यूशन, कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग के सकारात्मक सिरों के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्कर की अभिव्यक्ति पर आधारित है। सेल साइकिल सिंक्रोनाइजेशन और माइक्रोट्यूब्यूल के बढ़ते घनत्व को माइटोटिक कोशिकाओं में सेंट्रोसोमल अलगाव को बाधित करके प्राप्त किया जाता है, और ओपन-सोर्स यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विकास का विश्लेषण किया जाता है। कम लेजर पावर के संयोजन में एक उज्ज्वल और लाल-स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग और डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए आवश्यक कम एक्सपोजर समय फोटोटॉक्सिकिटी और प्रकाश-प्रेरित कलाकृतियों की संभावना को कम करता है। यह मानक संस्कृति की स्थिति के तहत एक विकास माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखते हुए एक ही तैयारी में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । क्योंकि विश्लेषण एक पर्यवेक्षित स्वचालित फैशन में किया जाता है, परिणाम सांख्यिकीय मजबूत और प्रजनन योग्य हैं ।

चित्रा 1एमें उल्लिखित दिए गए प्रोटोकॉल के बाद, pEB3-tdTomato प्लाज्मिड क्षणिक रूप से अतुल्यकालिक रूप से बढ़ती वाघेला कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था। डीएमई उपचार(चित्रा 1B)के माध्यम से प्?...

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Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

यहां हम लाइव-सेल स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और मैटलैब-आधारित छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके प्रोमेटफेज में सिंक्रोनाइज्ड कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता विश्लेषण की एक मजबूत और विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।

एकाधिकार ी माइटोटिक स्पिंडल में कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल डायनेमिक्स का मापन

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

हम यहां जो कुछ भी प्रस्तुत करते हैं वह प्रोमेटाफेज में सिंक्रोनाइज्ड कोशिकाओं में लाइव-सेल स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और सरल तरीका है, और छवियों को बाद में मैटलैब-आधारित मंच पर विश्लेषण किया जाता है। कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में लाल स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग फोटोटॉक्सिसिटी को कम करता है। इसलिए, एक ही तैयारी के भीतर बड़ी संख्या में कोशिकाओं को चित्रित किया जा सकता है।माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता बड़ी संख्या में रोग स्थितियों में बदल जाती है। इसलिए, विनियमन और उन प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के व्यवहार को समझने में मदद कर सकते है हमें रोग के तंत्र को समझने, और अंततः, उनके लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए चिकित्सा के विकास । और विधि भी upscaleable है, तो यह संभवतः एक दवा खोज प्रयास में लागू किया जा सकता है ।फ्लोरेसेंस डेसिंक्रोनाइजेशन प्रोटोकॉल को बदलकर और कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों से कोशिकाओं को प्राप्त करके विधि को संशोधित किया जा सकता है। माइक्रोट्यूबल्स के खिलाफ दवाओं की स्क्रीनिंग और विभाजन और गैर-विभाजन कोशिकाओं पर दोष की पहचान करते समय यह उपयोगी हो सकता है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए ट्रांसफैक्शन प्रोटोकॉल और सीडिंग घनत्व को अनुकूलित करना आवश्यक है।एकल बढ़ते माइक्रोट्यूबल का पता लगाने के लिए ईबी 3 का अभिव्यक्ति स्तर कम होना चाहिए। डीपीबीएस में अतुलक्रॉनस रूप से बढ़ती हेला कोशिकाओं को ढंककर शुरू करें, फिर उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ट्रिप्पसिन-ईडीटीए के साथ इनक्यूबेट करें। तीन से एक अनुपात पर 10% गर्मी निष्क्रिय एफसीएस के साथ पूरक RPMI-1640 मध्यम जोड़कर ट्राइप्सिनीकरण बंद करो, जोड़ा ट्राइप्सिन-EDTA।पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करें, और एक तैयार, कक्षीकृत कवरस्लिप के प्रत्येक कुएं में 50, 000 कोशिकाओं को बीज दें। इनक्यूबेटर को कवरस्लिप वापस करें, और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर कोशिकाओं को बढ़ाएं। अगले दिन, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें, और ड्रॉप-वार प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें, और चार घंटे के बाद इनक्यूबेशन कोशिकाओं को ताजा माध्यम के साथ पूरक करें और इसके अतिरिक्त 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिनोल रेड फ्री डीएमईएम में डाइमेथाइलेंस्ट्रॉन या डीएमई का 2.5 माइक्रोमोलर समाधान तैयार करें, जो 10% एफसीएस और दो मिलीमोलर एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक है। कक्षित कवरलिप में विकास माध्यम को डीएमई विकास माध्यम के साथ बदलें, और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें।इनक्यूबेशन के ३.५ घंटे के बाद, इमेजिंग के लिए अंधेरे पैनलों के साथ, एक पर्यावरण कक्ष में कक्ष कवरलिप बढ़ते द्वारा माइक्रोस्कोप के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें । इसके बाद कुल चार घंटे तक इनक्यूबेशन जारी रखें। 100X, 1.49 न्यूमेरिकल अपर्चर, तेल विसर्जन उद्देश्य, एक दोहरी डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम और एक विश्वसनीय ऑटो फोकस सिस्टम के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर समय चूक इमेजिंग करें।पाठ पांडुलिपि में वर्णित इमेजिंग मापदंडों को परिभाषित करें। प्रोफस में एक सेल ढूंढें, और एकाधिकार माइटोटिक धुरी के केंद्र के अनुरूप जेड-प्लेन में ध्यान केंद्रित करें। फिर हर 5 सेकंड में छवियों को प्राप्त करें, कुल एक मिनट में, कोई बिनिंग और एक्सपोजर के बीच कोई रोशनी नहीं।न्यूमेरिकल एनालिसिस सॉफ्टवेयर लोड करके शुरू करें और कमांड विंडो से मूवी सिलेक्टर जीयूआई नामक सॉफ्टवेयर सर्च पाथ में यू-ट्रैक V2.2.0 फ़ोल्डर जोड़कर। फिर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न कच्ची फाइलों को आयात करें। मैन्युअल रूप से उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर और इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले समय अंतराल में प्रवेश करें।एक बार सभी छवियों को लोड कर रहे हैं, फिल्म सूची के रूप में बचाने का चयन करके एक फिल्म के रूप में दर्ज समय चूक श्रृंखला को बचाने के लिए, और संवाद खिड़की के दाईं ओर यू ट्रैक विकल्प । पॉप-अप मेनू से माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड्स का चयन करें, और ठीक क्लिक करें, जो विश्लेषण के तीन चरणों के मापदंडों को निर्धारित करने के लिए एक नई संवाद खिड़की खोलता है। स्टेप वन के लिए सेटिंग्स पर क्लिक करें और ड्रॉप डाउन मेन्यू से धूमकेतु का पता लगाना चुनें।पांडुलिपि में वर्णित गॉसियन फिल्टर और वाटरशेड सेगमेंटेशन के अंतर के लिए मापदंडों को परिभाषित करें। इसके बाद सभी फिल्मों में सेटिंग्स का चयन करें और आवेदन पर क्लिक करें। चरण दो के लिए, माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड गतिशीलता का चयन करें, और पाठ पांडुलिपि के अनुसार, लिंकिंग, गैप क्लोजिंग, विलय और बंटवारे और कालमैन फ़िल्टर कार्यों के लिए मूल्यों को परिभाषित करने के लिए सेटिंग विकल्पों का उपयोग करें।आयामीता के साथ समस्याओं के लिए, ड्रॉप डाउन मेनू से दो चुनें, और अधिकतम अंतर को बंद करने के लिए पांच फ्रेम का उपयोग करें, और पहले चरण से ट्रैक सेगमेंट की न्यूनतम लंबाई के लिए तीन फ्रेम। पहले की तरह, सभी फिल्मों पर सेटिंग्स का चयन करें और आवेदन पर क्लिक करें। चरण तीन के लिए, ट्रैक विश्लेषण विधि के रूप में माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स वर्गीकरण चुनें, और सेटिंग बटन के माध्यम से मापदंडों को परिभाषित करें।फिल्म की शुरुआत और अंत में पटरियों को हटाने के लिए बक्से का चयन करें, और आंकड़े हिस्टोग्राम बनाते हैं। ड्रॉप डाउन सूची से, फॉरवर्ड गैप से पहले दो से तीन फ्रेम का उपयोग करके चयन करें, और फॉरवर्ड गैप स्पीड डिस्ट्रीब्यूशन के 95 वें शतमक, क्रमशः फॉरवर्ड और बैकवर्ड पुनर्वर्गीकरण के लिए । एक बार सभी मापदंडों को परिभाषित कर रहे हैं, सभी फिल्मों के लिए जांच लागू/अनियंत्रित का चयन करें, और नियंत्रण शीशे का पानी यू ट्रैक खिड़की से सभी फिल्मों बक्से चलाने के लिए, तो प्रेस चलाते हैं ।मूवी प्रोसेसिंग पूरी होने के बाद एक मैसेज प्रदर्शित होता है। PEB3-tdTomato प्लाज्मिड क्षणिक रूप से HeLa कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था । डीएमई उपचार के साथ कोशिकाओं को सिंक्रोनाइज किया गया था।माइक्रोट्यूबुले विकास की समय चूक फिल्मों का विश्लेषण किया गया, और परिणामस्वरूप विकास की गति और गतिशीलता की साजिश रची गई। विश्लेषण को प्रभावित करने के लिए वर्णित मापदंडों, जैसे अधिकतम अंतर लंबाई और अधिकतम सिकुड़न कारक, समय चूक फिल्मों के एक ही सेट के लिए संशोधित किया गया । विकास की गति और गतिशीलता के अनुरूप मूल्यों की गणना की गई ।जबकि परिणामी विकास की गति काफी प्रभावित नहीं हुई थी, जब अधिकतम अंतर लंबाई को संशोधित किया गया था तो गतिशीलता अलग थी। इन तीनों मामलों में, माइक्रोट्यूबुल सबट्रैक का पता इसी तरह का था, फिर भी पूर्ण मीट्रिक टन प्रक्षेप पथ का पुनर्निर्माण ज्यादातर प्रभावित हुआ जब अधिकतम अंतर लंबाई 15 तक निर्धारित की गई । यह आकलन करने के लिए कि क्या इमेजिंग स्थितियां माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में हस्तक्षेप करते हैं, समय चूक श्रृंखला के पहले और दूसरे हिस्सों का अलग से विश्लेषण किया गया था, और इसी विकास की गति और गतिशीलता की तुलना की गई थी।जैसा कि उम्मीद थी, कोई महत्वपूर्ण अंतर का पता चला । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है, कि क्योंकि कोशिकाओं को प्रोमेटाफेज में सिंक्रोनाइज्ड किया जाता है, इसलिए माइक्रोट्यूबुल का घनत्व बहुत अधिक होता है। इसलिए, किसी को विश्लेषण के मापदंडों को बहुत सावधानीपूर्वक निर्धारित करना होता है, न कि विभिन्न माइक्रोट्यूबुल को गलत पहचानने के लिए।इस विधि के साथ माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के माप की तुलना अन्य जैविक लक्ष्यों के अध्ययन से सीधे, अप्रत्यक्ष रूप से, माइक्रोट्यूबुल्स को विनियमित करने के साथ की जा सकती है।

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Vivo में माइक्रो परिसंचरण कंकाल की मांसपेशी में अंतरराज्यीय महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी द्वारा मापन

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Illustrating के गतिशील kinetochore प्रोटीन और रहने में क्रोमोजोम प्रस्ताव व्यवहार के द्वारा mitotic चेकप्वाइंट अध्ययन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Syncytial भ्रूण

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

प्राथमिक चूहा नवजात cardiomyocytes लाइव सेल इमेजिंग के adenoviral के बाद और Lentiviral पारगमन Confocal डिस्क माइक्रोस्कोपी स्पिनिंग का प्रयोग

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

में microtubule गतिशीलता उपाय plusTipTracker सॉफ्टवेयर का उपयोग<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; विकास शंकु

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग और जीवित मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता की स्वचालित विश्लेषण

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

गोलाकार पायस बूंदों में बेसिक mitotic स्पिंडल पुनर्गठन

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Mitochondrial कैल्शियम और mitochondrial झिल्ली के साथ माप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में संभावित

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

उच्च संकल्प इमेजिंग और नवोदित खमीर में व्यक्तिगत एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

फ्लोरेसेंस लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा मिट्रोटिक और मीओटिक फिसेशन खमीर न्यूक्लियर डायनामिक्स की परीक्षा

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...