Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

私たちは、彼らの専門家のアドバイスとサポートのために、光顕微鏡施設、マックスプランク実験医学研究所のメンバーに感謝します。

1. HeLa細胞の播種
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5μg/mLフィブロネクチン溶液の2mLを調製し、4ウェルチャンバーカバースリップ(#1.5)の各ウェルに450 μLを加えます。スライドを37°Cで15分間インキュベートし、5%CO2.</li>
	<li>リンスは、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩酸(DPBS)でHeLa細胞を非同期的に増殖させ、トリプシンEDTA(0.05%:0.02%;w:v)を37°Cで5分間インキュベートします。ロズウェ?...

ここでは、Ertychら44によって最初に確立された方法の改変について説明する。他のいくつかの変更と共に、MTダイナミクス解析のこの技術とデュアルスピニングディスク共焦点イメージングを組み合わせます。デュアルスピニングディスクの使用は、光毒性36を低減しながら、成長するMTの解像度を向上させます。さらに、より長波長の蛍光レポーターに切?...

微小管(MT)は、事実上すべての真核細胞およびいくつかの細菌1に見られる非常に動的な構造である。アクチンおよび中間フィラメントと共に、それらは細胞骨格2、3を彫刻する。細胞分裂4、分子輸送5、フラッラー打ち負かす6、原発性シリウム7を介した周囲環境の感覚、聴覚(キノチリウム)8、9、胚発生10、11、12、浸潤および転移13、14、さらには記憶形成15、16、17、そして、他の多くのプロセスは、主にMTに依存しています。このプロパティは、動的不安定性 19 として記述されます。MTの動的性は、多くの病理学的条件20、21、22で変化する。したがって、この特性の性質を決定することは、疾患のメカニズムとその後の治療を理解するのに役立ちます。
MTダイナミクス解析のための方法の長いリストが開発されており、そのほとんどはイメージング技術23に基づいています。当初、広視野光顕微鏡は、インビトロ24におけるチューブリンポリマーの形成を観察するために使用された。MTプラスエンドで集まるエンド結合(EB)タンパク質の発見と、タンパク質を蛍光標識する方法の開発により、広視野および共焦点蛍光顕微鏡25、26、27を有する生細胞におけるMTの挙動を直接観察することが可能となった。1つのEBタンパク質は、エンド結合タンパク質3(EB3)28である。蛍光タンパク質に融合したEB3を過剰発現および追跡することにより、MTプラスエンド組み立て率は29、30を決定することができる。
共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡(CLSM)は、MTダイナミクスに従うために頻繁に使用されます。しかしながら、この撮像技術は、光毒性および光脱色のリスクが高く、生細胞および薄暗い試料イメージング31に対する2つの望ましくないプロセスを有する。より良い信号対雑音比を得るためには、レーザーパワーと露光時間はサンプルにダメージを与えない状態で十分に高くする必要があり、速度と引き換えに解像度を犠牲にする必要があります。CLSMに代わる適切な代替手段は、回転ディスク顕微鏡32である。このイメージングモダリティは、ピンホールの配列を有する移動ディスクからなるニプコウディスク33の使用に基づいており、同じサンプルを同時に34個撮像する多くのCLS顕微鏡と同等に動作する。したがって、レーザーからの光は、同時にサンプル内のいくつかの領域を照らすが、共焦点性を保持します。したがって、Nipkowディスクは、CLSMに似た画像を取得できますが、より高速で、より少ないレーザーパワーを使用することができます。ニプコウディスクは、個別に光をそれぞれのピンホールに導くマイクロレンズの配列を持つ第2のディスクを導入した横川電機によってさらに改良され、光毒性と光脱色35をさらに低減しました。このように、紡糸ディスクレーザー走査顕微鏡は生細胞イメージングの選択肢となり、高速31、36で高い信号対雑音比の画像を得ることが可能となり、急速に成長するMT末端からの信号等の解決に不可欠である。
MT ダイナミクスは一時的に異なります。たとえば、有糸分裂性の M は、相間のM7、38よりも動的です。同様に、有糸分裂39、40などの同じ細胞周期期内においても増殖速度および収縮の違いが観察されている。したがって、誤ったデータ収集を避けるために、MTダイナミクスの測定は、細胞周期中の狭い時間枠に制限する必要があります。例えば、プロメタフェイズにおけるMTダイナミクスの測定は、モータキネシンEg541を阻害し、バイポーラ有糸状スピンドル42の形成を防止するモナストロル類似体であるジメチルエナストロン(DME)で細胞を処理することによって達成することができる。Eg5阻害剤DMEおよび他のモナストロル誘導体を有するプロメタフェイズにおける細胞の阻害は、MTダイナミクス43、44、45に影響を及ぼさない、これはDMEを固定細胞および生細胞44の両方でMTダイナミクスを研究するための有用なツールとなる。
ここでは、Ertych et al.44で説明したプロメタフェイズ細胞におけるMTダイナミクス解析の方法とデュアルスピニングディスクイメージングを組み合わせる。この方法は、光漂白および最小限の光毒性なしで、より高いイメージング速度を有する単一の焦点面から収集されたプロメタフェイズ細胞におけるMTダイナミクスの測定を可能にする。さらに、蛍光レポーターとして、緑色蛍光タンパク質(EGFP)に比べて明るさや光安定性が向上し、エネルギー光46を低くして励起されるタンデムダイマートマト蛍光タンパク質(tdTomato)を用いた。したがって、tdTomatoは励起のためのより少ないレーザーパワーを必要とし、より少ない光毒性です。全体として、光毒性を低減し、MTダイナミクス解析に必要な分解能と後処理を改善することで、この方法をさらに改善します。さらに、メソッドを他の同期手法と組み合わせることで、メソッドを将来変更するための基礎を作成します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

生細胞における微小管ダイナミクスを決定するための確立された方法の改変について説明する。このプロトコルは、微小管(TdTomato蛍光タンパク質で標識されたEB3)の陽性端に対する遺伝的にコードされたマーカーの発現と、紡糸ディスク共焦点顕微鏡を用いた高速、高解像度、生細胞イメージングに基づいている。細胞周期同期と微小管の密度の増加は、有糸分裂細胞における遠心分離を阻害することによって達成され、そして成長の分析はオープンソースのU-Trackソフトウェアを用いて行われる。明るく赤ずれた蛍光タンパク質を使用すると、レーザーパワーが低く、スピンディスク顕微鏡検査に必要な露光時間が短縮され、光毒性や光誘起アーティファクトの確率が低下します。これにより、標準的な培養条件下で増殖培地中の細胞を維持しながら、同じ調製物でより多くの細胞をイメージングすることができます。解析は教師付き自動で実行されるため、結果は統計的に堅牢で再現可能です。

図1Aに概説された所定のプロトコルに続いて、pEB3-tdTomatoプラスミドは、非同期増殖HeLa細胞で一過性に発現した。細胞をDME処理を介してプロメタフェイズでトランスフェクションした後48時間同期させた(図1B)。このステップにより、MTダイナミクスの測定は常に細胞周期の同じ段階で行われました。タイムラプスムービーは、補足文書5...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。

単極有糸状スピンドルにおけるスピンディスク顕微鏡による微小管ダイナミクスの測定

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

ここで紹介するのは、前転移で同期した細胞における生細胞紡糸ディスク共焦点イメージングを用いて微小管ダイナミクスを解析する堅牢で簡単な方法であり、その後MATLABベースのプラットフォームで画像を解析します。赤色シフト蛍光タンパク質を紡糸ディスク顕微鏡と組み合わせて使用することで、光毒性を低減します。したがって、同じ調製物内で、より多くの細胞を画像化することができます。微小管の動性は、多数の病理学的状態において変化する。したがって、これらのプロセスにおける微小管ダイナミクスの調節と挙動を理解することは、病気のメカニズムを理解し、最終的にはそれらを補うための治療法を開発するのに役立ちます。また、この方法は大規模でもあり、創薬の取り組みに適用される可能性があります。この方法は、蛍光脱同期プロトコルを変更し、細胞周期の異なる段階から細胞を得ることによって変更することができる。これは、微小管に対して薬物をスクリーニングし、分裂細胞および非分裂細胞の欠陥を特定する場合に有用である。細胞種ごとにトランスフェクションプロトコルと播種密度を最適化する必要があります。単一の成長する微小管を検出するために、EB3の発現レベルは低いはずです。DPBSでHeLa細胞を非同期的に増殖させてから始め、37°Cで5分間トリプシン-EDTAでインキュベートします。3対1の比率で10%の熱不活化FCSを添加したRPMI-1640培地を添加することによってトリプシンを停止し、トリプシン-EDTAを添加する。原稿の方向に従って細胞の濃度を計算し、調製されたチャンバーカバースリップの各ウェルに50,000個の細胞を播種する。カバースリップをインキュベーターに戻し、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間細胞を成長させます。翌日、培養器から細胞を取り出し、100マイクロリットルのトランスフェクション混合物を各ウェルに滴下する。培養器に細胞を戻し、4時間培養した後、新鮮な培地で細胞を補い、さらに20時間インキュベートする。ジメチレンジナストロン(DME)の2.5マイクロモル溶液をフェノールレッドフリーDMEMで調製し、10%FCSおよび2ミリモルL-グルタミンを補う。チャンバーカバースリップ中の成長培地をDME成長培地に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。3.5時間のインキュベーションの後、チャンバーカバースリップを37°Cと5%の二酸化炭素に設定した環境チャンバーに取り付け、画像化用の暗いパネルで顕微鏡にセルを移します。その後、合計4時間インキュベーションを続けます。100X、1.49個の開口、油浸し目的、デュアルディスク共焦点システム、および信頼性の高いオートフォーカスシステムを備えた反転顕微鏡でタイムラプスイメージングを実行します。テキスト原稿に記述されているように、イメージングパラメータを定義します。プロフェーズで細胞を見つけ、単極有糸夫の中心に対応するZ平面に焦点を当てます。その後、5秒ごとに、合計1分間、ビニングなし、露光間の照明なしで画像を取得します。まず、数値解析ソフトウェアをロードし、u-track V2.2.0 フォルダをコマンド ウィンドウからムービー セレクタ GUI と呼ばれるソフトウェア検索パスに追加します。次に、画像取得ソフトウェアによって生成された生のファイルをインポートします。手動で、目的の開口数とイメージングに使用する時間間隔を入力します。すべての画像がロードされたら、ムービーリストとして保存を選択し、ダイアログウィンドウの右側にあるuトラックオプションを選択して、入力されたタイムラプスシリーズをムービーとして保存します。ポップアップメニューから「微小管プラスエンド」を選択し、「大丈夫」をクリックすると、新しいダイアログ・ウィンドウが開き、解析の3つのステップのパラメータを決定します。手順 1 では、[設定] をクリックし、ドロップダウン メニューから [彗星検出] を選択します。原稿に記述されているように、ガウスフィルタと流域セグメンテーションの違いのパラメータを定義します。次に、[すべてのムービーに設定を適用する] を選択し、[適用] をクリックします。ステップ 2 では、マイクロチューブプラスエンドダイナミクスを選択し、テキスト原稿に従って、リンク、ギャップのクローズ、マージ、分割、およびカルマンフィルタ関数の値を定義する設定オプションを使用します。次元の問題については、ドロップダウンメニューから2つを選択し、最大ギャップを閉じるための5つのフレームを使用し、最初のステップからトラックセグメントの最小長に3フレームを使用します。以前と同様に、[すべてのムービーに設定を適用する] を選択して[適用] をクリックします。ステップ 3 では、トラック解析方法として微小管力学分類を選択し、設定ボタンを使用してパラメーターを定義します。ムービーの先頭と末尾のトラックを削除するボックスを選択し、統計情報ヒストグラムを作成します。ドロップダウン リストから、前方ギャップの前に 2 ~ 3 フレーム、前方ギャップ速度分布の 95 パーセンタイルをそれぞれ選択して、順方向と後方の再分類を行います。すべてのパラメータを定義したら、[すべてのムービーにチェック/オフを適用する]を選択し、コントロールペインのUトラックウィンドウからすべてのムービーボックスを実行し、実行を押します。ムービー処理が完了すると、メッセージが表示されます。pEB3-tdTomatoプラスミドをHeLa細胞で一過性発現させた。細胞をDME処理と同期させた。微小チューブ成長のタイムラプスムービーを解析し、その結果の成長速度と動的性をプロットした。最大ギャップ長や最大収縮率など、解析に影響を与えるパラメータを同じタイムラプスムービーに対して変更しました。成長速度と動的性の対応する値を計算しました。結果として生じる成長速度は大きな影響を受けなかったが、最大ギャップ長を変更した場合、動的性は異なっていた。3つのケースすべてにおいて、微小管サブトラックの検出は同様であったが、最大ギャップ長を15に設定した場合、完全なMT軌道の再構築はほとんど影響を受けた。イメージング条件が微小管挙動を妨げているかどうかを評価するために、タイムラプス系列の第1および第2の半分を別々に分析し、対応する成長速度と動的性を比較した。予想通り、有意差は検出されなかった。細胞は前転移で同期するため、微小管の密度が非常に高いことを覚えておいてください。したがって、解析のパラメータを非常に慎重に設定する必要があり、異なる微小管を誤って識別する必要はありません。この方法による微小管ダイナミクスの測定は、直接、間接的に、微小管を調節する他の生物学的標的の研究と比較することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...