Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Vi takker medlemmene av Light mikroskopi Facility, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, for deres faglige råd og støtte.

1. seeding av HeLa Cells
<ol><li>Klargjør 2 mL 5 μg/mL fibronektin oppløsning i fosfat bufret Saline (PBS) og tilsett 450 μL av den i hver brønn av en 4 brønn kamret dekkglass (#1.5). Ruge lysbildet i 15 minutter ved 37 ° c og 5% CO2.</li>
	<li>Skyll asynkront voksende HeLa celler med Dulbecco ' s fosfat bufret Saline (DPBS) og ruge med Trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min ved 37 ° c. Stopp enzymatisk reaksjon ved tilsetning av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% v...

Her beskriver vi en modifikasjon av en metode som først ble etablert av Ertych et al.44. Sammen med flere andre modifikasjoner, kombinerer vi denne teknikken av MT dynamikk analyse med dual spinning disk konfokalmikroskopi Imaging. Bruken av dual spinning disken forbedrer oppløsningen av voksende MTs samtidig redusere Phototoksisitet36. Vi redusere photobleaching og laser lys-indusert skade av cellene ved å bytte til en lengre bølgelengde fluorescerende reporter. TdToma...

Mikrotubuli (MTs) er svært dynamiske strukturer som finnes i nesten alle eukaryote celler og i noen bakterier1. Sammen med utgangen og middels filamenter, forme de cytoskeleton2,3. Cell Division4, molekyl transport5, flagellar slo6, følelsen av omgivelsene gjennom primær Flimmerhår7, hørsel (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, invasjon og metastasering13,14, og til og med minne formasjon15,16,17,18, og mange andre prosesser bruker først og fremst MTs. deltakelse av MTs i alle disse hendelsene ville være umulig uten deres bemerkelsesverdige evne til å raskt bytte mellom vekst (polymerisering) og krymping (depolymerisering). Denne egenskapen er beskrevet som dynamisk ustabilitet19. MT dynamicity er endret i mange patologiske tilstander20,21,22. Derfor kan fastsettelse av arten av denne eiendommen bidra til å forstå sykdoms mekanismer og senere deres behandling.
En lang liste av metoder er utviklet for MT dynamikk analyse, hvorav de fleste er basert på Imaging teknikker23. I utgangspunktet ble bredt felt lys mikroskop brukt for å observere dannelsen av tubulin polymerer i vitro24. Oppdagelsen av end-binding (EB)-proteiner som samler på Mt Plus-ender og utvikling av metoder for å fluorescensmerkete etikett proteiner gjorde det mulig å observere atferden til MTS direkte i levende celler med bredt felt og konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop25,26,27. En EB-protein er ende-bindende protein 3 (EB3)28; ved overexpressing og sporing EB3 smeltet til et fluorescerende protein, MT Plus-end montering priser kan fastsettes29,30.
Konfokalmikroskopi laserskanning fluorescens mikroskopi (CLSM) brukes ofte til å følge MT dynamikk. Imidlertid, denne tenkelig teknikk oppstiller en høy risk av Phototoksisitet og photobleaching, to uønsket prosesser for bo cellen og svak eksemplar tenkelig31. For å oppnå et bedre signal-til-støy-forhold, bør laseren makt og eksponerings varighet være høy nok, mens ikke skade prøvene, og dette krever ofre oppløsning i bytte for hastighet. Et egnet alternativ til CLSM er spinning disk mikroskopi32. Dette Imaging modalitet er basert på bruk av en Nipkow disk33, som består av en bevegelig disk bærer en rekke pinholes, og arbeider ekvivalent til mange CLS mikroskop Imaging samme prøve samtidig34. Derfor vil lyset fra laseren belyse flere regioner i prøven samtidig, men beholde den konfokalmikroskopi naturen. Den Nipkow disken, derfor tillater innhenting av bilder som ligner på CLSM men raskere og bruker mindre laser kraft. Den Nipkow disken ble ytterligere forbedret ved Yokogawa Electric, som introduserte en andre disk med en rekke mikrolinser på det som individuelt direkte lys inn i en respektive pinhole, ytterligere redusere Phototoksisitet og photobleaching35. Således, spinning disk laserskanning mikroskopi ble en metode for valg for Live celle Imaging, og det gjør det mulig å få bilder med høy signal-til-støy-forhold ved en høy hastighet31,36, som er avgjørende for å løse signaler som de fra den raskt voksende Mt ender.
MT dynamikk avvike midlertidig. Mitotisk MTS er for eksempel mer dynamiske enn Interphase de37,38. På samme måte har det blitt observert forskjeller i vekstraten og krymping selv innenfor den samme celle syklus fasen, for eksempel mitose39,40. Derfor, for å unngå falske datainnsamling, bør målingen av MT dynamikk begrenses til et smalt tidsvindu under cellesyklusen. For eksempel kan måling av MT Dynamics i prometaphase oppnås ved å behandle cellene med dimethylenastron (DME), en monastrol analog som hemmer motoren kinesin Eg541 og hindrer dannelsen av bipolar mitotisk spindel42. Hemming av celler ved prometaphase med Eg5 inhibitor DME og andre monastrol derivater påvirker ikke Mt Dynamics43,44,45, som gjør DME et nyttig verktøy for å studere Mt Dynamics både i faste og levende celler44.
Her kombinerer vi metoden for MT dynamikk analyse i prometaphase celler beskrevet av Ertych et al.44 med dual spinning disk Imaging. Denne metoden tillater måling av MT dynamikk i prometaphase celler samlet inn fra en enkelt fokal plan med høyere bildefrekvens, men uten photobleaching og minimal Phototoksisitet. Videre, som en fluorescerende reporter, bruker vi tandem dimer tomat fluorescerende protein (tdTomato) som har forbedret lysstyrke og photostability i forhold til det grønne fluorescerende proteinet (EGFP) og er spent med lavere energi lys46. Derfor krever tdTomato mindre laser kraft for eksitasjon og er mindre fototoksisk. Alt i alt forbedrer vi metoden ytterligere ved å redusere Phototoksisitet og forbedre oppløsningen og post prosessering som kreves for MT dynamikk analyse. I tillegg oppretter vi et grunnlag for fremtidige endringer av metoden ved å kombinere den med andre synkroniserings teknikker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Vi beskriver en modifikasjon av en etablert metode for å fastslå mikrotubulinettverket dynamikk i levende celler. Protokollen er basert på uttrykk for en genetisk kodet markør for de positive endene av mikrotubuli (EB3 merket med tdTomato fluorescerende protein) og høy hastighet, høy oppløsning, Live-celle Imaging bruker spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi. Celle syklus synkronisering og økt tetthet av mikrotubuli oppnås ved å hemme centrosomal separasjon i mitotisk celler, og analyse av veksten utføres ved hjelp av åpen kildekode-U-Track programvare. Bruken av en lys og rød-forskjøvet fluorescerende protein, i kombinasjon med lavere laser kraft og redusert eksponeringstid som kreves for spinning disk mikroskopi redusere Phototoksisitet og sannsynligheten for lys-indusert gjenstander. Dette gjør det mulig for Imaging et større antall celler i samme forberedelse og samtidig opprettholde cellene i et vekstmedium under standard kultur forhold. Fordi analysen er utført i en veiledet automatisk måte, er resultatene statistisk robust og reproduserbar.

Etter den gitte protokollen skissert i figur 1a, den PEB3-tdTomato plasmider ble midlertidig uttrykt i asynkront voksende HeLa celler. Cellene ble synkronisert 48 h etter transfeksjoner ved prometaphase gjennom DME behandling (figur 1B). Dette trinnet sørget for at målingen av MT dynamikk ble alltid gjort i samme fase av celle syklus. Tidsforløp filmene ble videre behandlet og analysert med U-Track v 2.2.0 som beskrevet i tilleggs dokumentasjonen<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Her presenterer vi en robust og detaljert metode for mikrotubulinettverket dynamikk analyse i celler synkronisert i prometaphase ved hjelp av Live-celle spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi og MATLAB-basert bildebehandling.

Måling av Mikrotubulinettverket Dynamics ved spinning disk mikroskopi i Monopolar mitotisk aksling

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Det vi presenterer her er en robust og enkel metode for å analysere mikrotubulidynamikk ved hjelp av live-celle spinning disk confocal imaging i celler synkronisert i prometaphase, og bilder analyseres etterpå på en MATLAB-basert plattform. Bruken av rødskiftet fluorescerende protein i kombinasjon med spinnende skivemikroskopi reduserer fototoksisitet. Derfor kan et større antall celler avbildes i samme forberedelse.Mikrotubulidynamikk endres under et stort antall patologiske forhold. Derfor kan det å forstå reguleringen og oppførselen til mikrotubulidynamikk i disse prosessene hjelpe oss med å forstå sykdomsmekanismen, og til slutt utvikle terapier for å kompensere for dem. Og metoden er også oppskalerbar, så det kan potensielt brukes i en narkotika oppdagelse innsats.Metoden kan endres ved å endre fluorescens desynkronisering protokollen og få celler fra ulike faser av cellesyklusen. Dette kan være nyttig når du screener legemidler mot mikrotubuli og identifiserer defekt på deling og ikke-skilleceller. Det er nødvendig å optimalisere transfection protokollen og seeding tetthet for hver celletype.Uttrykksnivået til EB3 bør være lavt, for å oppdage enkeltvoksende mikrotubuli. Start med å skylle asynkront voksende HeLa-celler i DPBS, og inkuber dem deretter med trypsin-EDTA i fem minutter, ved 37 grader Celsius. Stopp trypsiniseringen ved å legge til RPMI-1640 medium supplert med 10% varme inaktivert FCS på et tre til ett forhold, den ekstra trypsin-EDTA.Beregn konsentrasjonen av cellene i henhold til manuskriptretninger, og frø 50.000 celler i hver brønn av en forberedt, kamret dekkslip. Returner dekkslippen til inkubatoren, og øk celler i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. På neste dag fjerner du cellene fra inkubatoren, og drop-wise legger til 100 mikroliter transfeksjonsblanding i hver brønn.Returner cellene til inkubatoren, og etter fire timers inkubasjon supplerer cellene med friskt medium og inkuberer i tillegg i 20 timer. Forbered en 2,5 mikromolar løsning av dimetylenastron, eller DME, i fenol rød fri DMEM, supplert med 10% FCS og to millimolar L-glutamin. Erstatt vekstmediet i den kamret dekkslippen med DME-vekstmediet, og returner cellene til inkubatoren.Etter 3,5 timers inkubasjon, overfør cellene til mikroskopet ved å montere det kamret dekkslipset inn i et miljøkammer satt til 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, med mørke paneler for avbildning. Fortsett deretter inkubasjonen i totalt fire timer. Utfør tidsforløp på et omvendt mikroskop med et 100X, 1,49 numerisk blenderåpning, oljenedsenkingsmål, et konfokalt system med dobbel disk og et pålitelig autofokussystem.Definer bildeparametrene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Finn en celle i prophase, og fokuser i Z-flyet som tilsvarer midten av monopolmitotisk spindel. Deretter får du bilder hvert femte sekund, over totalt ett minutt, uten binning og ingen belysning mellom eksponeringer.Start med å laste inn den numeriske analyseprogramvaren og legge til u-track V2.2.0-mappen i programvaresøkebanen, kalt filmvelger GUI, fra kommandovinduet. Deretter importerer du raw-filene som genereres av bildeanskaffelsesprogramvaren. Angi numerisk blenderåpning for målet manuelt og tidsintervallet som brukes til bildebehandling.Når alle bildene er lastet inn, lagrer du den angitte tidsforløpsserien som en film ved å velge lagre som filmliste, og u-spor-alternativet på høyre side av dialogvinduet. Velg mikrotubuli pluss-ender fra hurtigmenyen, og klikk ok, som åpner et nytt dialogvindu for å bestemme parametrene for de tre trinnene i analysen. For trinn én klikker du innstillinger og velger kometdeteksjon fra rullegardinmenyen.Definer parameterne for forskjellen mellom gaussisk filter og vannskillet segmentering, som beskrevet i manuskriptet. Velg deretter bruk innstillinger på alle filmer og klikk på bruk. For trinn to velger du pluss-end-dynamikken for mikrotubule, og bruker innstillingsalternativene til å definere verdiene for kobling, mellomromslukking, sammenslåing og splitting, og Kalman-filterfunksjoner, i henhold til tekstmanuskriptet.Hvis du vil ha problemer med dimensjonalitet, velger du to fra rullegardinmenyen og bruker fem rammer for maksimal mellomrom for å lukke, og tre rammer for minimum lengde på sporsegmenter fra første trinn. Som før velger du Bruk innstillinger for alle filmer og klikker på Bruk. For trinn tre velger du klassifisering av mikrotubuledynamikk som en sporanalysemetode, og definerer parameterne gjennom innstillingsknappen.Velg boksene for å fjerne spor i begynnelsen og slutten av filmen, og gjør statistikk histogrammer. Fra rullegardinlisten velger du ved hjelp av to til tre rammer før forover gap, og 95th persentil av fremover gap hastighetsfordeling, for henholdsvis fremover og bakover reklassifisering. Når alle parameterne er definert, velger du bruk sjekk / fjern merket på alle filmer, og kjører alle filmer bokser fra kontrollrutene u-spor vinduet, og trykk deretter kjør.En melding vises når filmbehandlingen er fullført. PEB3-tdTomato plasmid ble forbigående uttrykt i HeLa-celler. Cellene ble synkronisert med DME-behandling.Tidsforløp filmer av mikrotubuli vekst ble analysert, og den resulterende veksthastighet og dynamikk ble plottet. Parameterne som beskrives for å påvirke analysen, for eksempel maksimal gaplengde og maksimal krympingsfaktor, ble endret for samme sett med tidsforløpsfilmer. Tilsvarende verdier for veksthastighet og dynamiskhet ble beregnet.Selv om den resulterende veksthastigheten ikke ble betydelig påvirket, var dynamikken annerledes når maksimal gaplengde ble endret. I alle tre tilfellene var påvisning av mikrotubuliunderspor lik, men gjenoppbyggingen av de fulle MT-banene ble for det meste påvirket når maksimal gaplengde ble satt til 15. For å vurdere om bildeforholdene forstyrret mikrotubuliatferd, ble første og andre halvdel av tidsforløpsserien analysert separat, og tilsvarende veksthastighet og dynamikk ble sammenlignet.Som forventet ble det ikke påvist noen signifikante forskjeller. Det er viktig å huske på, at fordi cellene er synkronisert i prometaphase, er tettheten av mikrotubuli svært høy. Derfor må man angi parametrene for analysen veldig nøye, for ikke å feilidentifisere forskjellige mikrotubuli.Målingen av mikrotubulidynamikk med denne metoden kan sammenlignes med studier av andre biologiske mål direkte, indirekte, som regulerer mikrotubuli.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studerer Mitotisk Checkpoint ved å illustrere Dynamic kinetochore Protein Oppførsel og Kromosom Motion i Levende<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryoer

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live-Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Etter adenovirus og Lentiviral Transduksjon Bruke Confocal Spinning Disk Mikros

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Bruke plusTipTracker Programvare to Measure mikrotubulidynamikk i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vekst kjegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Tilberedning av Basic mitosetråder i Kule emulsjonsdråpene

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...