Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
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Agradecemos aos membros da Light Microscopy Facility, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, por seus conselhos e apoio especializados.

1. Semeadura de células HeLa
<ol><li>Prepare 2 mL de 5 μg/mL solução de fibronectina em soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e adicione 450 μL dele em cada poço de um coverslip de 4 poços com câmara (#1,5). Incubar o slide por 15 min a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Enxágüe células HeLa de crescimento assíncrono com a soro-sinodiada de Dulbecco (DPBS) e incubada com trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) por 5 min a 37 °C. Pare a reação enzimática pela adição do Roswell Park Memorial Institut...

Aqui, descrevemos uma modificação de um método estabelecido pela primeira vez por Ertych et al.44. Junto com várias outras modificações, combinamos esta técnica de análise de dinâmica MT com imagens confocais de disco de fiação dupla. O uso do disco de fiação dupla melhora a resolução de MTs em crescimento, reduzindo a fototoxicidade36. Reduzimos ainda mais o photobleaching e os danos induzidos pela luz laser das células, mudando para um repórter fluorescen...

Microtubules (MTs) são estruturas altamente dinâmicas encontradas em praticamente todas as células eucarióticas e em algumas bactérias1. Juntamente com a actina e filamentos intermediários, eles esculpem o citoesqueleto2,3. Divisão celular4,transporte demoléculas 5,flagelar batendo6,a sensação do ambiente circundante através do clácia primário7, audição (kinocilium)8,9,embrionênese10,11,12, invasão e metástase13,14,e até mesmo formação de memória15,16,17,18, e muitos outros processos dependem principalmente de MTs. A participação de MTs em todos esses eventos seria impossível sem sua notável capacidade de alternar rapidamente entre crescimento (polimerização) e encolhimento (despolimerização). Esta propriedade é descrita como instabilidade dinâmica19. A dinâmica do MT é alterada em muitas condições patológicas20,21,22. Assim, determinar a natureza desta propriedade pode ajudar a compreender mecanismos da doença e subseqüentemente seu tratamento.
Uma longa lista de métodos foi desenvolvida para a análise da dinâmica MT, a maioria dos quais são baseados em técnicas de imagem23. Inicialmente, microscópios de luz de campo largo foram utilizados para observar a formação de polímeros de tubulina in vitro24. A descoberta de proteínas end-binding (EB) que se coletam em MT plus-ends e o desenvolvimento de métodos para rotular fluorescentemente proteínas possibilitou observar o comportamento das MTs diretamente em células vivas com amplo campo e microscópios de fluorescência confocal25,26,27. Uma proteína EB é a proteína de ligação final 3 (EB3)28; expressando e rastreando eB3 com uma proteína fluorescente, as taxas de montagem mt plus-end podem ser determinadas29,30.
A microscopia de fluorescência da exploração a laser confocal (CLSM) é frequentemente usada para acompanhar a dinâmica do MT. No entanto, esta técnica de imagem representa um alto risco de fototoxicidade e fotobranqueamento, dois processos indesejáveis para células vivas e imagens de amostra dim31. A fim de obter uma melhor relação sinal-ruído, a potência do laser e a duração da exposição devem ser altas o suficiente, sem danificar as amostras, e isso requer sacrificar a resolução em troca de velocidade. Uma alternativa adequada ao CLSM é a microscopia de disco giratório32. Esta modalidade de imagem é baseada no uso de um disco Nipkow33, que consiste em um disco em movimento com uma matriz de furos, e funciona de forma equivalente a muitos microscópios CLS imagens da mesma amostra simultaneamente34. Portanto, a luz do laser iluminará várias regiões da amostra simultaneamente, mas manterá a natureza confocal. O disco nipkow, portanto, permite a obtenção de imagens semelhantes ao CLSM, mas mais rápido e usando menos energia a laser. O disco Nipkow foi ainda melhor pelo Yokogawa Electric, que introduziu um segundo disco com uma variedade de microlentes sobre ele que individualmente direcionar a luz em um pinhole respectivos, reduzindo ainda mais fototoxicidade e fotobranqueamento35. Assim, a microscopia de digitalização a laser de disco giratório tornou-se um método de escolha para imagens de células vivas, e torna possível obter imagens com alta relação sinal-ruído em alta velocidade31,36, o que é crucial para resolver sinais como os das extremidades de rápido crescimento do MT.
A dinâmica do MT difere temporariamente. Por exemplo, as MTs mitocôticas são mais dinâmicas do que asinterfases 37,38. Da mesma forma, diferenças na taxa de crescimento e encolhimento têm sido observadas mesmo dentro da mesma fase do ciclo celular, como a mitose39,40. Portanto, para evitar a coleta de dados falsos, a medição da dinâmica do MT deve ser limitada a uma janela de tempo estreita durante o ciclo celular. Por exemplo, a medição da dinâmica mt na prometaphase pode ser alcançada através do tratamento das células com dimenastron (DME), um análogo monastrol que inibe o motor kinesin Eg541 e impede a formação do fuso mitomático42. Inibição de células em prometaphase com DME inibidor eg5 e outros derivados monastrois não afeta a dinâmica MT43,44,45, o que torna DME uma ferramenta útil para estudar a dinâmica mt tanto em células fixas e vivas44.
Aqui combinamos o método de análise de dinâmica MT em células prometaphase descritas por Ertych et al.44 com imagens de disco de fiação dupla. Este método permite a medição da dinâmica mt em células prometaphase coletadas a partir de um único plano focal com uma maior taxa de imagem, mas sem fotobranqueamento e fototoxicidade mínima. Além disso, como repórter fluorescente, usamos proteína fluorescente de tomate tandem dimer (tdTomato), que melhorou o brilho e a fotostabilidade em comparação com a proteína fluorescente verde (EGFP) e está animada com luz de energia mais baixa46. Portanto, tdTomato requer menos energia laser para excitação e é menos fototóxico. Ao todo, melhoramos ainda mais o método, reduzindo a fototoxicidade e melhorando a resolução e pós-processamento necessários para a análise da dinâmica do MT. Além disso, criamos uma base para futuras modificações do método, combinando-o com outras técnicas de sincronização.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Descrevemos uma modificação de um método estabelecido para determinar a dinâmica dos microtúbulos nas células vivas. O protocolo é baseado na expressão de um marcador geneticamente codificado para as extremidades positivas dos microtúbulos (EB3 rotulado com proteína fluorescente tdTomato) e imagens de células vivas de alta velocidade, alta resolução, usando microscopia confocal de disco giratório. A sincronização do ciclo celular e o aumento da densidade de microtúbulos são alcançados inibindo a separação centrosomal em células mitocômicas, e a análise do crescimento é realizada usando software u-track de código aberto. O uso de uma proteína fluorescente brilhante e em vermelho, em combinação com o menor poder laser e o tempo de exposição reduzido necessário para a microscopia de disco giratório, reduzem a fototoxicidade e a probabilidade de artefatos induzidos pela luz. Isso permite a imagem de um número maior de células na mesma preparação, mantendo as células em um meio de crescimento condições de cultura padrão. Como a análise é realizada de forma automática supervisionada, os resultados são estatisticamente robustos e reprodutíveis.

Seguindo o protocolo dado esboçado na figura 1A,o plasmid do pEB3-tdTomato foi expressado transitonte em pilhas assynchronously crescentes de HeLa. As células foram sincronizadas 48 h após a transfecção na prometaphase através do tratamento de DME (Figura 1B). Esta etapa garantiu que a medição da dinâmica do MT fosse feita sempre na mesma fase do ciclo da pilha. Os filmes de lapso de tempo foram processados e analisados com U-Track v2.2.0 como descrito ...

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Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Aqui apresentamos um método robusto e detalhado de análise da dinâmica dos microtúbulos em células sincronizadas em prometaphase usando microscopia confocal de disco giratório de células vivas e processamento de imagem baseado em MATLAB.

Medição da dinâmica do microtúbulo girando microscopia do disco em fusos mitocticos monopolares

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

O que apresentamos aqui é um método robusto e simples para analisar a dinâmica dos microtúbulos usando imagens confocal de disco giratório em células sincronizadas em prometaphase, e as imagens são posteriormente analisadas em uma plataforma baseada em MATLAB. O uso de proteína fluorescente deslocada para vermelho em combinação com microscopia de disco giratório reduz a fototoxicidade. Portanto, um número maior de células pode ser imagens dentro da mesma preparação.A dinâmica dos microtúbulos é alterada em um grande número de condições patológicas. Portanto, compreender a regulação e o comportamento da dinâmica dos microtúbulos nesses processos pode nos ajudar a entender o mecanismo da doença e, eventualmente, desenvolver terapias para compensá-las. E o método também é dimensionável, por isso poderia potencialmente ser aplicado em um esforço de descoberta de drogas.O método pode ser modificado alterando o protocolo de desincronização da fluorescência e obtendo células de diferentes fases do ciclo celular. Isso pode ser útil ao triagem de drogas contra microtúbulos e identificação de defeitos na divisão e células não-divisórias. É necessário otimizar o protocolo de transfecção e a densidade de semeadura para cada tipo de célula.O nível de expressão do EB3 deve ser baixo, a fim de detectar microtúbulos de crescimento único. Comece enxaguando assincronicamente o crescimento de células HeLa em DPBS, depois incuba-as com trypsin-EDTA por cinco minutos, a 37 graus Celsius. Pare a trippsinização adicionando RPMI-1640 médio suplementado com FCS inativado de 10% de calor em uma proporção de três para um, o trypsin-EDTA adicionado.Calcule a concentração das células de acordo com as instruções do manuscrito, e sementes 50.000 células em cada poço de um talão de cobertura preparada e câmara. Devolva a tampa para a incubadora, e cresça células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova as células da incubadora e adicione 100 microliters de mistura de transfecção em cada poço.Devolva as células à incubadora e, após quatro horas de incubação, suplemente as células com meio fresco e, adicionalmente, incubam por 20 horas. Prepare uma solução de 2,5 micromolar de dimetilenastron, ou DME, em DMEM livre de fenol vermelho, complementada com 10% FCS e dois milimônios L-glutamina. Substitua o meio de crescimento no deslizamento de coberturas câmaradas pelo meio de crescimento DME e devolva as células à incubadora.Após 3,5 horas de incubação, transfira as células para o microscópio montando o deslizamento de coberturas câmara em uma câmara ambiental fixada em 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com painéis escuros para imagem. Em seguida, continue a incubação por um total de quatro horas. Execute a imagem de lapso de tempo em um microscópio invertido com uma abertura numérica de 100X, 1,49, objetivo de imersão de óleo, um sistema confocal de disco duplo e um sistema de foco automático confiável.Defina os parâmetros de imagem descritos no manuscrito do texto. Encontre uma célula em prophase, e concentre-se no plano Z correspondente ao centro do fuso mitotístico monopolar. Em seguida, adquira imagens a cada 5 segundos, ao longo de um total de um minuto, sem binning e sem iluminação entre as exposições.Comece carregando o software de análise numérica e adicionando a pasta U-track V2.2.0 no caminho de pesquisa de software, chamado gui seletor de filme, da janela de comando. Em seguida, importe os arquivos brutos gerados pelo software de aquisição de imagens. Digite manualmente a abertura numérica do objetivo e o intervalo de tempo utilizado para a imagem.Uma vez que todas as imagens são carregadas, salve a série de lapso de tempo inserida como um filme selecionando salvar como lista de filme e a opção u-track no lado direito da janela de diálogo. Selecione os plus-ends do microtúbulo do menu pop-up e clique em ok, que abre uma nova janela de diálogo para determinar os parâmetros das três etapas da análise. Para a primeira etapa, clique em configurações e selecione a detecção de cometas no menu suspenso.Defina os parâmetros para a diferença do filtro gaussiano e a segmentação da bacia hidrográfica, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, selecione aplicar configurações a todos os filmes e clique em aplicar. Para a segunda etapa, selecione a dinâmica plus-end do microtúbulo e use as opções de configuração para definir os valores para vinculação, fechamento de lacunas, fusão e divisão e funções de filtro Kalman, de acordo com o manuscrito do texto.Para problemas com dimensionalidade, escolha dois do menu suspenso e use cinco quadros para fechar a lacuna máxima e três quadros para o comprimento mínimo dos segmentos de faixa a partir da primeira etapa. Como antes, selecione aplicar configurações a todos os filmes e clique em aplicar. Para a terceira etapa, escolha a classificação de dinâmica de microtúbulos como método de análise de faixa e defina os parâmetros através do botão de configuração.Selecione as caixas para remover faixas no início e no final do filme e faça histogramas estatísticos. Da lista de queda, selecione usando dois a três quadros antes da lacuna dianteira e 95º percentil de distribuição de velocidade de lacuna para a frente, para reclassificação para frente e para trás, respectivamente. Uma vez definidos todos os parâmetros, selecione aplicar verificação/desmarcação para todos os filmes e execute todas as caixas de filmes a partir da janela de faixa de controle e, em seguida, pressione a execução.Uma mensagem é exibida assim que o processamento do filme estiver concluído. O plasmídeo pEB3-tdTomato foi transitavelmente expresso em células HeLa. As células foram sincronizadas com o tratamento DME.Foram analisados filmes de lapso de tempo de crescimento de microtúbulos, e a velocidade de crescimento e a dinâmica resultantes foram traçadas. Os parâmetros descritos para afetar a análise, como o comprimento máximo de gap e o fator máximo de encolhimento, foram modificados para o mesmo conjunto de filmes de lapso de tempo. Foram calculados os valores correspondentes de velocidade e dinâmica de crescimento.Embora a velocidade de crescimento resultante não tenha sido significativamente afetada, a dinâmica foi diferente quando o comprimento máximo da lacuna foi modificado. Nos três casos, a detecção de microclúbulos foi semelhante, mas a reconstrução das trajetórias completas de MT foi afetada principalmente quando o comprimento máximo do gap foi definido para 15. Para avaliar se as condições de imagem interferiram no comportamento dos microtúbulos, a primeira e a segunda metades da série de lapsos de tempo foram analisadas separadamente, e a velocidade e dinâmica de crescimento correspondentes foram comparadas.Como esperado, não foram detectadas diferenças significativas. É importante ter em mente que, como as células são sincronizadas em prometaphase, a densidade do microtúbulo é muito alta. Portanto, é preciso definir os parâmetros da análise com muito cuidado, para não identificar mal os diferentes microtúbulos.A medição da dinâmica dos microtúbulos com este método pode ser comparada com estudos de outros alvos biológicos direta, indiretamente, regulando microtúbulos.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

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Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...