Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Мы благодарим членов Фонда световой микроскопии, Института экспериментальной медицины Макса-Планка, за их экспертные советы и поддержку.

1. Посев клеток HeLa
<ol><li>Приготовьте 2 мл 5 мл/мл фибронектина раствор афериста (PBS) и добавьте 450 л его в каждую скважину 4 хорошо камерного покрытия (#1,5). Инкубировать слайд в течение 15 мин при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.</li>
	<li>Промыть асинхронно растущие клетки HeLa с фосфатным солей Dulbec...

Здесь мы описываем модификацию метода, впервые установленного Ertych et al.44. Наряду с несколькими другими модификациями, мы сочетаем эту технику анализа динамики МТ с двойной вращающейся дискковой конфокальной визуализации. Использование двойного вращающегося диска улучшае?...

Микротрубочки (МТ) являются высокодинамическими структурами, встречаемыми практически во всех эукариотических клетках и в некоторых бактериях1. Вместе с актином и промежуточными нитями они лепят цитоскелет2,3. Ячейка разделение4, молекула транспорт5, flagellar избиение6, ощущение окружающей среды через первичный цилиум7, слух (киноцилиум)8,9, эмбриогенез10,11,12, вторжение и метастазы13,14, и даже формирование памяти15,16,17,18, и многие другие процессы в первую очередь опираются на МТ. Участие МТ во всех этих событиях было бы невозможно без их замечательной способности быстро переключаться между ростом (полимеризация) и усадки (деполимеризация). Это свойство описывается как динамическая нестабильность19. Mt динамика изменяется во многих патологических условиях20,21,22. Таким образом, определение характера этого свойства может помочь понять механизмы болезни, а затем их лечение.
Для анализа динамики МТ был разработан длинный список методов, большинство из которых основаны на методах визуализации23. Первоначально для наблюдения за образованием полимеров тубулина в пробирке24использовались широкоугольные световые микроскопы. Открытие конечных связывания (EB)-белки, которые собирают на МТ плюс-концы и развитие методов флуоресцентно этикетки белков позволило наблюдать за поведением MTs непосредственно в живых клетках с широким полем и конфокальные флуоресценции микроскопов25,26,27. Один EB-белок является конечным связывающим белком 3 (EB3)28; путем переэкспрессинга и отслеживания EB3, слитого в флуоресцентный белок, MT плюс конец сборки ставки могут быть определены29,30.
Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия (CLSM) часто используется для наблюдения за динамикой МТ. Тем не менее, этот метод визуализации представляет высокий риск фототоксичности и фотоотбеления, два нежелательных процессов для живых клеток и тусклый образец изображения31. Для того, чтобы получить лучшее соотношение сигнала к шуму, мощность лазера и продолжительность экспозиции должны быть достаточно высокими, не повреждая образцы, и это требует ущерба разрешением в обмен на скорость. Подходящей альтернативой CLSM является спиннинг дискмикроскопия32. Эта модальность изображения основана на использовании диска Nipkow33, который состоит из движущегося диска, несущего массив пинхолов, и работает эквивалентно многим микроскопам CLS, изображая тот же образец одновременно34. Таким образом, свет от лазера будет освещать несколько областей в образце одновременно, но сохранить конфокальный характер. Таким образом, диск Nipkow позволяет получать изображения, похожие на CLSM, но быстрее и используя меньше лазерной энергии. Диск Nipkow был дополнительно улучшен Yokogawa Electric, который представил второй диск с массивом микролинз на нем, что индивидуально направлять свет в соответствующую пинхол, дальнейшее снижение фототоксичности и photobleaching35. Таким образом, вращающийся диск лазерное сканирование микроскопии стал методом выбора для живой визуализации клеток, и это позволяет получать изображения с высоким соотношением сигнала к шуму на высокой скорости31,36, что имеет решающее значение для решения сигналов, таких как от быстрорастущих концов МТ.
Динамика МТ временно отличается. Например, митотические МТ более динамичны, чем межфазные37,38. Аналогичным образом, различия в темпах роста и усадке наблюдались даже в пределах одной и той же фазы клеточного цикла, например, митоза39,40. Поэтому, чтобы избежать ложного сбора данных, измерение динамики МТ должно ограничиваться узким временем во время клеточного цикла. Например, измерение динамики МТ в прометафазе может быть достигнуто путем лечения клеток с диметиленастроном (DME), монострольным аналогом, который подавляет моторный кинезин Eg541 и предотвращает образование биполярного митоtic шпинделя42. Ингибирование клеток на прометафазе с ингибитором Eg5 DME и другими производными монастрола не влияет на динамику МТ43,44,45, что делает DME полезным инструментом для изучения динамики МТ как в стационарных, так и в живых клетках44.
Здесь мы объединяем метод анализа динамики МТ в прометафазных клетках, описанных Ertych et al.44, с двойной вращающейся визуализацией диска. Этот метод позволяет измерять динамику МТ в прометафазных клетках, собранных из одного фокусного плана с более высокой частотой изображений, но без фотоотбелевания и минимальной фототоксичности. Кроме того, как флуоресцентный репортер, мы используем тандем димер томатный флуоресцентный белок (tdTomato), который улучшил яркость и фотостабильность по сравнению с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) и возбуждается с более низким энергетическим светом46. Таким образом, tdTomato требует меньше лазерной энергии для возбуждения и менее фототоксичным. В целом, мы дополнительно улучшаем метод за счет снижения фототоксичности и улучшения разрешения и постобработки, необходимых для анализа динамики Mt. Кроме того, мы создаем основу для будущих модификаций метода, объединив его с другими методами синхронизации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Мы описываем модификацию установленного метода определения динамики микротрубв в живых клетках. Протокол основан на экспрессии генетически закодированного маркера для положительных концов микротрубок (EB3, маркированных флуоресцентным белком tdTomato) и высокоскоростной, с высоким разрешением, живоклеточной визуализации с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Синхронизация клеточного цикла и увеличение плотности микротрубок достигается путем ингибирования центросомального разделения в митотических клетках, а анализ роста проводится с помощью программного обеспечения U-Track с открытым исходным кодом. Использование яркого и красного сдвига флуоресцентного белка в сочетании с более низкой мощностью лазера и сокращением времени экспозиции, необходимого для вращающейся дисковой микроскопии, снижает фототоксичность и вероятность световых артефактов. Это позволяет для визуализации большего количества клеток в том же препарате при сохранении клеток в среде роста в стандартных условиях культуры. Поскольку анализ выполняется контролируемым автоматическим способом, результаты являются статистически надежными и воспроизводимыми.

Следуя данному протоколу, изложенному на рисунке 1A,плазмида pEB3-tdTomato была транслеэффектно выражена в асинхронно растущих клетках HeLa. Клетки были синхронизированы 48 ч после трансфекции на прометафазе через лечение DME(рисунок 1B). Этот шаг обеспечил, чтобы и...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Здесь мы представляем надежный и подробный метод анализа микротрубной динамики в клетках, синхронизированных в прометафазе с помощью живой клетки вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и обработки изображений на основе MATLAB.

Измерение динамики микротрубок с помощью вращающейся микроскопии диска в монополярных митотическом спинное

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Здесь мы представляем надежный и простой метод анализа динамики микротрубочек с использованием конфокального изображения живого клеточного спиннингового диска в клетках, синхронизированных в прометафазе, и изображения затем анализируются на платформе на основе MATLAB. Использование красного флуоресцентного белка в сочетании с вращающейся микроскопией диска снижает фототоксичность. Таким образом, большее количество ячеек может быть изображено в рамках той же подготовки.Динамика микротрубочек изменяется при большом количестве патологических состояний. Таким образом, понимание регулирования и поведения микротрубочек динамики в этих процессах может помочь нам понять механизм заболевания, и в конечном итоге, разработка методов лечения, чтобы компенсировать их. И метод также высококлассный, поэтому он потенциально может быть применен в усилиях по обнаружению наркотиков.Метод может быть изменен путем изменения протокола флуоресценции десинхронизации и получения клеток из различных фаз клеточного цикла. Это может быть полезно при скрининге препаратов против микротрубочек и выявлении дефектов на делении и неразделения клеток. Необходимо оптимизировать протокол трансфекции и плотность посева для каждого типа клеток.Уровень экспрессии EB3 должен быть низким, чтобы обнаружить одиночные растущие микротрубоконы. Начните с полоскания асинхронно растущих клеток HeLa в DPBS, а затем инкубировать их трипсином-ЭДТА в течение пяти минут, при 37 градусах по Цельсию. Остановить трипсинизацию, добавив RPMI-1640 среды дополняется 10% тепла инактивированных FCS на три к одному соотношению, добавил трипсин-EDTA.Рассчитайте концентрацию клеток в соответствии с рукописными указаниями, и семя 50000 клеток в каждом колодец подготовлены, камерные крышки. Вернуть крышку в инкубатор, и расти клетки в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующий день, удалить клетки из инкубатора, и капли мудрый добавить 100 микролитров трансфекции смеси в каждой хорошо.Вернуть клетки в инкубатор, и после четырех часов инкубации дополнить клетки свежей среде и дополнительно инкубировать в течение 20 часов. Подготовка 2,5 микромоляного раствора диметиленастрона, или DME, в фенол красный свободный DMEM, дополненный 10%FCS и два миллимоляра L-глутамина. Замените среду роста в камерном крышке средой роста DME и верните клетки в инкубатор.После 3,5 часов инкубации, передать клетки микроскопу путем монтажа камерной крышки в экологическую камеру установлен на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, с темными панелями для визуализации. Затем продолжайте инкубацию в общей сложности четыре часа. Выполните визуализацию промежуток времени на перевернутом микроскопе с 100X, 1,49 числовой диафрагмой, целью погружения в нефть, двойной дисковой конфокальцаторной системой и надежной системой автофокусировки.Определите параметры изображения, описанные в текстовой рукописи. Найдите ячейку в профазе и сосредоточьтесь в плоскости, соответствующей центру монополярного митотического шпинделя. Затем приобретайте изображения каждые 5 секунд, в общей сложности одну минуту, без биннинга и без освещения между экспозициями.Начните с загрузки программного обеспечения для численного анализа и добавления папки V2.2.0 u-track в путь поиска программного обеспечения, называемый графическим интерфейсом селектора фильмов, из окна команды. Затем импортируют необработанные файлы, генерируемые программным обеспечением для получения изображений. Вручную введите численную диафрагму цели и интервал времени, используемый для визуализации.После загрузки всех изображений сохраните введенную серию промежуток времени в качестве фильма, выбрав сохранить в качестве списка фильмов, и u-трек вариант на правой стороне окна диалога. Выберите микротрубокон плюс-концы из всплывающего меню и нажмите кнопку ok, которая открывает новое окно диалога для определения параметров трех этапов анализа. Для шага один, нажмите настройки и выберите обнаружение кометы из меню падения вниз.Определите параметры разницы гауссийского фильтра и сегментации водораздела, как описано в рукописи. Затем выберите применить настройки ко всем фильмам и нажмите применить. Для второй шага выберите динамику микротрубочек плюс конец и используйте параметры настройки для определения значений ссылок, закрытия разрыва, слияния и разделения, а также функций фильтра Kalman, согласно рукописи текста.Для проблем с размерностью, выберите два из меню падения вниз, и использовать пять кадров для максимального разрыва, чтобы закрыть, и три кадра для минимальной длины трек сегментов с первого шага. Как и прежде, выберите применить настройки для всех фильмов и нажмите применить. Для третий шаг выберите классификацию динамики микротрубочек в качестве метода анализа трека и определите параметры с помощью кнопки настройки.Выберите ящики для удаления треков в начале и конце фильма и сделайте статистику гистограмм. Из списка падения выберите два-три кадра до разрыва вперед и 95-й процентиль распределения скорости вперед для реклассификации вперед и назад соответственно. После того, как все параметры определены, выберите применить проверку / uncheck для всех фильмов, и запустить все фильмы коробки из окна управления панелей u-трек, а затем нажмите запустить.Сообщение отображается после завершения обработки фильма. Плазмида pEB3-tdTomato была временно выражена в клетках HeLa. Клетки были синхронизированы с лечением DME.Были проанализированы покадровые фильмы роста микротрубочек, а также наметилась полученная скорость и динамичность роста. Параметры, описанные для анализа, такие как максимальная длина разрыва и максимальный коэффициент усадки, были изменены для одного и того же набора фильмов с промежуток времени. Были рассчитаны соответствующие значения скорости роста и динамики.Хотя полученная в результате этого скорость роста не была существенно затронута, динамика была иной, когда была изменена максимальная длина разрыва. Во всех трех случаях обнаружение микротрубочек было аналогичным, однако реконструкция всех траекторий МТ в основном была затронута, когда максимальная длина разрыва была установлена до 15. Для оценки того, мешали ли условия визуализации поведению микротрубочек, была отдельно проанализирована первая и вторая половины временных рядов, и были сопоставлены соответствующая скорость и динамика роста.Как и ожидалось, существенных различий обнаружено не было. Важно иметь в виду, что, поскольку клетки синхронизированы в прометафазе, плотность микротрубочек очень высока. Поэтому необходимо очень тщательно устанавливать параметры анализа, чтобы не ошибиться в различных микротрубочках.Измерение динамики микротрубочек с помощью этого метода можно сравнить с исследованиями других биологических целей прямо, косвенно, регулирующих микротрубоконы.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Синцитиальный эмбрионов

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Живых изображений сотовый первичных Rat неонатальных кардиомиоцитов После Аденовирусный и Лентивирусов Трансдукция Использование конфокальной вращающийся диск микроскопия

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Шишки роста

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Воссоздание Basic митотических веретен в сферических эмульсионных каплях

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...