Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
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Agradecemos a los miembros del Light Microscopy Facility, Instituto Max-Planck de Medicina Experimental, por su asesoramiento y apoyo experto.

1. Sembrado de células helancos
<ol><li>Preparar 2 ml de solución de fibronectina de 5 g/ml en solución salina tamponada de fosfato (PBS) y añadir 450 ml de ella en cada pocal de un cubreobjetos de 4 cámaras bien (#1.5). Incubar el tobogán durante 15 min a 37oC y 5%CO2.</li>
	<li>Enjuague las células de HeLa de crecimiento asíncrono con solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) e incubar con trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) durante 5 min a 37 oC. Detener la reacción enzimática medi...

Aquí, describimos una modificación de un método establecido por primera vez por Ertych et al.44. Junto con varias otras modificaciones, combinamos esta técnica de análisis de dinámica MT con imágenes confocales de disco giratorio dual. El uso del disco giratorio dual mejora la resolución de los TM en crecimiento al tiempo que reduce la fototoxicidad36. Reducimos aún más el fotoblanqueo y el daño inducido por la luz láser de las células cambiando a un reportero ...

Los microtúbulos (MT) son estructuras altamente dinámicas que se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas y en algunas bacterias1. Junto con la actina y los filamentos intermedios, esculpen el citoesqueleto2,3. División celular4, transporte de moléculas5, flagelante golpeando6, la sensación del entorno circundante a través del cilium primario7, audición (kinocilium)8,9, embriogénesis10,11,12, invasión y metástasis13,14, e incluso la formación de la memoria15,16,17,18, y muchos otros procesos se basan principalmente en los TM. La participación de los MT en todos estos eventos sería imposible sin su notable capacidad de cambiar rápidamente entre el crecimiento (polimerización) y la contracción (despolimerización). Esta propiedad se describe como inestabilidad dinámica19. La dinámica MT se altera en muchas condiciones patológicas20,21,22. Por lo tanto, determinar la naturaleza de esta propiedad puede ayudar a entender los mecanismos de la enfermedad y posteriormente su tratamiento.
Se ha desarrollado una larga lista de métodos para el análisis de dinámica MT, la mayoría de los cuales se basan en técnicas de imagen23. Inicialmente, se utilizaron microscopios de luz de campo amplio para observar la formación de polímeros de tubulina in vitro24. El descubrimiento de proteínas de unión final (EB) que se acumulan en MT plus-ends y el desarrollo de métodos para etiquetar fluorescentes proteínas hicieron posible observar el comportamiento de los MT directamente en células vivas con microscopios de fluorescencia confocal esdecir de campo ancho y confocal25,26,27. Una proteína EB es proteína de unión final 3 (EB3)28; mediante la sobreexpresión y el seguimiento de EB3 fusionado con una proteína fluorescente, MT plus-end tasas de montaje se pueden determinar29,30.
La microscopía de fluorescencia de escaneo láser confocal (CLSM) se utiliza con frecuencia para seguir la dinámica de MT. Sin embargo, esta técnica de diagnóstico por imágenes supone un alto riesgo de fototoxicidad y fotoblanqueo, dos procesos indeseables para las imágenes de células vivas y muestras tenues31. Con el fin de obtener una mejor relación señal-ruido, la potencia del láser y la duración de la exposición deben ser lo suficientemente altas mientras que no dañan las muestras, y esto requiere sacrificar la resolución a cambio de la velocidad. Una alternativa adecuada a CLSM es la microscopía de disco giratorio32. Esta modalidad de imagen se basa en el uso de un disco Nipkow33,que consiste en un disco en movimiento que lleva una serie de agujeros, y funciona de forma equivalente a muchos microscopios CLS que toma imágenes de la misma muestra simultáneamente34. Por lo tanto, la luz del láser iluminará varias regiones de la muestra simultáneamente, pero conservará la naturaleza confocal. El disco Nipkow, por lo tanto, permite obtener imágenes similares a CLSM pero más rápido y utilizando menos potencia láser. El disco nipkow fue mejorado aún más por Yokogawa Electric, que introdujo un segundo disco con una serie de microlentes que dirigen individualmente la luz en un agujero respectivo, reduciendo aún más la fototoxicidad y el fotoblanqueo35. Por lo tanto, la microscopía de escaneo láser de disco giratorio se convirtió en un método de elección para la creación de imágenes de células en vivo, y permite obtener imágenes con alta relación señal-ruido a una alta velocidad31,36, que es crucial para resolver señales como las de los extremos MT de rápido crecimiento.
La dinámica de MT difiere temporalmente. Por ejemplo, los MT mitoticos son más dinámicos que los interfásicos37,38. Del mismo modo, se han observado diferencias en la tasa de crecimiento y la contracción incluso dentro de la misma fase del ciclo celular, como la mitosis39,40. Por lo tanto, para evitar la recopilación de datos falsos, la medición de la dinámica de MT debe limitarse a una ventana de tiempo estrecha durante el ciclo de celda. Por ejemplo, la medición de la dinámica MT en prometafase se puede lograr mediante el tratamiento de las células con dimetilenasnía (DME), un análogo monastrol que inhibe la quinesina motora Eg541 y evita la formación del husillo mitotico bipolar42. La inhibición de células en prometafase con inhibidor de Eg5 DME y otros derivados monastrolno no afecta a la dinámica MT43,44,45, lo que hace de DME una herramienta útil para el estudio de la dinámica MT tanto en células fijas como vivas44.
Aquí combinamos el método de análisis de dinámica MT en células prometifásicas descrito por Ertych et al.44 con imágenes de disco giratorios duales. Este método permite medir la dinámica de MT en células de prometafase recogidas de un solo plano focal con una mayor tasa de diagnóstico por imágenes, pero sin fotoblanqueo y fototoxicidad mínima. Además, como reportero fluorescente, utilizamos dimer tándem Proteína fluorescente de tomate (tdTomato) que ha mejorado el brillo y la fotoestabilidad en comparación con la proteína fluorescente verde (EGFP) y se excita con menor luz de energía46. Por lo tanto, tdTomato requiere menos potencia láser para la excitación y es menos fototóxico. En conjunto, mejoramos aún más el método reduciendo la fototoxicidad y mejorando la resolución y el postprocesamiento necesarios para el análisis de dinámica MT. Además, creamos una base para futuras modificaciones del método combinándolo con otras técnicas de sincronización.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Describimos una modificación de un método establecido para determinar la dinámica de microtúbulos en células vivas. El protocolo se basa en la expresión de un marcador codificado genéticamente para los extremos positivos de los microtúbulos (EB3 etiquetado con proteína fluorescente tdTomato) y la imagen de células vivas de alta velocidad y alta resolución mediante microscopía confocal de disco giratorio. La sincronización del ciclo celular y el aumento de la densidad de los microtúbulos se logran mediante la inhibición de la separación centrosómica en células mitoticas, y el análisis del crecimiento se realiza utilizando el software U-Track de código abierto. El uso de una proteína fluorescente brillante y de cambio de rojo, en combinación con la menor potencia láser y el tiempo de exposición reducido necesario para la microscopía de disco giratorio reducen la fototoxicidad y la probabilidad de artefactos inducidos por la luz. Esto permite tomar imágenes de un mayor número de células en la misma preparación mientras se mantienen las células en un medio de crecimiento bajo condiciones de cultivo estándar. Debido a que el análisis se realiza de forma automática supervisada, los resultados son estadísticamente robustos y reproducibles.

Siguiendo el protocolo dado descrito en la Figura 1A, el plásmido pEB3-tdTomato se expresó transitoriamente en células HeLa de crecimiento asíncrono. Las células se sincronizaron 48 horas después de la transfección en prometafase a través del tratamiento DME(Figura 1B). Este paso aseguró que la medición de la dinámica MT siempre se realizaba en la misma fase del ciclo celular. Las películas de lapso de tiempo se procesaron y analizaron con U-Track v2...

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Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.

Medición de microtúbulos dinámicos mediante microscopía de disco giratorio en husillos mitoticos Monopolar

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Lo que presentamos aquí es un método robusto y simple para analizar la dinámica de los microtúbulos utilizando imágenes confocales de disco giratorio de células vivas en células sincronizadas en prometafala, y las imágenes se analizan posteriormente en una plataforma basada en MATLAB. El uso de proteína fluorescente de cambio rojo en combinación con la microscopía de disco giratorio reduce la fototoxicidad. Por lo tanto, un mayor número de celdas se puede utilizar una imagen dentro de la misma preparación.La dinámica de los microtúbulos se altera en un gran número de condiciones patológicas. Por lo tanto, entender la regulación y el comportamiento de la dinámica de los microtúbulos en esos procesos puede ayudarnos a entender el mecanismo de la enfermedad, y eventualmente, desarrollar terapias para compensarlas. Y el método también es upscaleable, por lo que potencialmente podría aplicarse en un esfuerzo de descubrimiento de drogas.El método se puede modificar cambiando el protocolo de desincronización de fluorescencia y obteniendo células de diferentes fases del ciclo celular. Esto puede ser útil al detectar fármacos contra microtúbulos e identificar defectos en las células divisorias y no divisorias. Es necesario optimizar el protocolo de transfección y la densidad de siembra para cada tipo de célula.El nivel de expresión de EB3 debe ser bajo, con el fin de detectar microtúbulos de crecimiento único. Comience enjuagando las células de HeLa en crecimiento asincrónico en DPBS, luego incubarlas con trippsina-EDTA durante cinco minutos, a 37 grados centígrados. Detenga la tripsinación añadiendo el medio RPMI-1640 complementado con un FCS 10% inactivado por calor en una proporción de tres a uno, el trypsin-EDTA añadido.Calcular la concentración de las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y sembrar 50.000 células en cada pozo de un cubreobjetos preparado y con cámara. Devuelva el cubreobjetos a la incubadora y las células de cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire las células de la incubadora y agregue 100 microlitros de mezcla de transfección en cada poción.Devolver las células a la incubadora, y después de cuatro horas de incubación complementar las células con medio fresco y además incubar durante 20 horas. Preparar una solución de 2,5 micromolares de dimetilenastrón, o DME, en DMEM libre de rojo fenol, complementada con 10%FCS y dos milivolares L-glutamina. Sustituya el medio de crecimiento en el cubreobjetos con cámara por el medio de crecimiento DME y devuelva las células a la incubadora.Después de 3,5 horas de incubación, transfiera las células al microscopio montando el cubreobjetos con cámara en una cámara ambiental de 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono, con paneles oscuros para la toma de imágenes. A continuación, continúe la incubación durante un total de cuatro horas. Realice la imagen de lapso de tiempo en un microscopio invertido con una apertura numérica de 100X, 1,49, un objetivo de inmersión de aceite, un sistema confocal de doble disco y un sistema de enfoque automático fiable.Defina los parámetros de imagen como se describe en el manuscrito de texto. Encontrar una célula en la profasa, y centrarse en el plano Z correspondiente al centro del husillo mitótico monopolar. A continuación, adquiera imágenes cada 5 segundos, durante un total de un minuto, sin binning y sin iluminación entre exposiciones.Comience cargando el software de análisis numérico y agregando la carpeta u-track V2.2.0 en la ruta de búsqueda de software, llamada GUI selector de película, desde la ventana de comandos. A continuación, importe los archivos sin procesar generados por el software de adquisición de imágenes. Introduzca manualmente la apertura numérica del objetivo y el intervalo de tiempo utilizado para la toma de imágenes.Una vez cargadas todas las imágenes, guarde la serie de lapso de tiempo introducida como una película seleccionando Guardar como lista de películas y la opción de pista en u en el lado derecho de la ventana de diálogo. Seleccione microtúbulos más extremos en el menú emergente y haga clic en Aceptar, que abre una nueva ventana de diálogo para determinar los parámetros de los tres pasos del análisis. Para el primer paso, haga clic en la configuración y seleccione la detección de cometas en el menú desplegable.Defina los parámetros para la diferencia del filtro gaussiano y la segmentación de cuencas hidrográficas, como se describe en el manuscrito. A continuación, seleccione Aplicar configuración a todas las películas y haga clic en Aplicar. Para el paso dos, seleccione la dinámica de extremo más del microtúbulo y utilice las opciones de configuración para definir los valores para vincular, cerrar brechas, fusionar y dividir, y las funciones de filtro Kalman, según el manuscrito de texto.Para problemas con la dimensionalidad, elija dos en el menú desplegable y cinco fotogramas para que el espacio máximo se cierre y tres fotogramas para la longitud mínima de los segmentos de pista desde el primer paso. Como antes, seleccione Aplicar configuración a todas las películas y haga clic en Aplicar. Para el paso tres, elija la clasificación de dinámica de microtúbulos como método de análisis de pista y defina los parámetros a través del botón de configuración.Seleccione las casillas para eliminar pistas al principio y al final de la película, y haga histogramas de estadísticas. En la lista desplegable, seleccione utilizando dos o tres fotogramas antes del espacio hacia delante y el percentil 95 de la distribución de la velocidad de la brecha hacia delante, para la reclasificación hacia delante y hacia atrás, respectivamente. Una vez definidos todos los parámetros, seleccione Aplicar marcación/desmarcación a todas las películas y ejecute todas las casillas de películas desde la ventana de seguimiento en U de los paneles de control y, a continuación, presione Ejecutar.Se muestra un mensaje una vez completado el procesamiento de la película. El plásmido pEB3-tdTomato se expresó transitoriamente en las células de HeLa. Las células se sincronizaron con el tratamiento DME.Se analizaron las películas de lapso de tiempo de crecimiento de los microtúbulos, y se trazaron la velocidad de crecimiento y la dinámica resultantes. Los parámetros descritos para afectar al análisis, como la longitud máxima de separación y el factor de contracción máxima, se modificaron para el mismo conjunto de películas de lapso de tiempo. Se calcularon los valores correspondientes de velocidad de crecimiento y dinámica.Si bien la velocidad de crecimiento resultante no se vio significativamente afectada, la dinámica era diferente cuando se modificó la longitud máxima de la brecha. En los tres casos, la detección de subpistas de microtúbulos fue similar, sin embargo, la reconstrucción de las trayectorias MT completas se vio afectada principalmente cuando la longitud máxima de la brecha se estableció en 15. Para evaluar si las condiciones de diagnóstico por imágenes interferían con el comportamiento de los microtúbulos, la primera y la segunda mitad de la serie de lapso de tiempo se analizaron por separado, y se compararon la velocidad de crecimiento y la dinámica correspondientes.Como era de esperar, no se detectaron diferencias significativas. Es importante tener en cuenta, que debido a que las células están sincronizadas en prometaphase, la densidad de microtúbulo es muy alta. Por lo tanto, uno tiene que establecer los parámetros del análisis con mucho cuidado, no para identificar erróneamente diferentes microtúbulos.La medición de la dinámica de los microtúbulos con este método se puede comparar con estudios de otros objetivos biológicos directamente, indirectamente, regulando los microtúbulos.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

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-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

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Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

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Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...