Name: measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna i den ljusmikroskopi anläggningen, Max-Planck Institute of experimental Medicine, för deras expertråd och stöd.

1. sådd av HeLa celler
<ol><li>Bered 2 ml av 5 μg/ml Fibronektin-lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 450 μl av det i varje brunn i en 4 väl kamrar täckslip (#1.5). Inkubera bilden i 15 min vid 37 ° c och 5% CO2.</li>
	<li>Spola asynkront växande HeLa celler med Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) och inkubera med trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min vid 37 ° c. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom tillsats av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium k...

Här beskriver vi en modifiering av en metod som först upprättades av Ertych et al.44. Tillsammans med flera andra modifieringar kombinerar vi denna teknik av MT Dynamics analys med Dual spinning disk konfokal Imaging. Användningen av Dual spinning disk förbättrar upplösningen av växande MTs samtidigt minska fototoxicitet36. Vi minskar ytterligare photoblekning och laserljus-inducerad skada av cellerna genom att byta till en längre våglängd fluorescerande reporter...

Mikrotubuli (MTs) är mycket dynamiska strukturer som finns i nästan alla eukaryotiska celler och i vissa bakterier1. Tillsammans med aktin och mellanliggande glödtrådar skulpterar de cytoskelettet2,3. Cell Division4, molekyl transport5, flagellar slog6, känslan av den omgivande miljön genom primära cilium7, hörsel (kinocilium)8,9, embryogenes10,11,12, invasion och metastaser13,14, och även minnesbildning15,16,17,18, och många andra processer förlitar sig i första hand på MTs. medverkan av MTs i alla dessa händelser skulle vara omöjligt utan deras anmärkningsvärda förmåga att snabbt växla mellan tillväxt (polymerisation) och krympning (depolymerization). Den här egenskapen beskrivs som dynamisk instabilitet19. MT dynamicity ändras i många sjukdomstillstånd20,21,22. Därför, att fastställa arten av denna fastighet kan bidra till att förstå sjukdomsmekanismer och därefter deras behandling.
En lång lista med metoder har utvecklats för MT Dynamics analys, varav de flesta är baserade på Imaging tekniker23. Inledningsvis, brett fält ljusmikroskop användes för att observera bildandet av tubulin polymerer in vitro-24. Upptäckten av slutbindande (EB)-proteiner som samlar på Mt plus-Ends och utvecklingen av metoder för att Fluorescent etikett proteiner gjorde det möjligt att observera beteendet hos MTS direkt i levande celler med brett fält och konfokala fluorescens Mikroskop25,26,27. En EB-protein är avsluta-bindande protein 3 (EB3)28; genom att överuttrycka och spåra EB3 smält till ett fluorescerande protein, MT plus-end monteringssatser kan bestämmas29,30.
Confocal laserscanning fluorescens mikroskopi (clsm) används ofta för att följa MT dynamik. Denna bildteknik innebär dock en hög risk för fototoxicitet och foto blekning, två oönskade processer för levande cell och dim prov avbildning31. För att få en bättre signal-brus-förhållande, lasereffekt och exponeringstid bör vara tillräckligt hög medan inte skadar proverna, och detta kräver att offra upplösning i utbyte mot hastighet. Ett passande alternativ till clsm är spinning disk mikroskopi32. Denna avbildning modalitet bygger på användningen av en Nipkow disk33, som består av en rörlig disk som bär en array av hål, och fungerar ekvivalenta till många CLS Mikroskop Imaging samma prov samtidigt34. Därför ljus från lasern kommer att belysa flera regioner i provet samtidigt men behåller konfokala natur. Den Nipkow disk, därför, gör det möjligt att få bilder som liknar CLSM men snabbare och med mindre lasereffekt. Den Nipkow disk förbättrades ytterligare av Yokogawa Electric, som introducerade en andra skiva med en rad mikrolinser på den som individuellt direkt ljus i ett respektive hål, ytterligare minska fototoxicitet och photoblekning35. Sålunda, spinning disk laserskanning mikroskopi blev en metod för val för levande cell avbildning, och det gör det möjligt att få bilder med hög signal-brus-förhållande vid en hög hastighet31,36, vilket är avgörande för att lösa signaler som de från den snabbt växande MT ändar.
MT Dynamics skiljer sig tillfälligt. Till exempel är den mitotiska MTS mer dynamisk än Interphase Ones37,38. Likaså har skillnader i tillväxttakt och krympning observerats även inom samma cell cykel fas, såsom Mitos39,40. För att undvika falsk datainsamling bör mätningen av MT-dynamiken därför begränsas till ett smalt tidsintervall under cellcykeln. Till exempel, mätning av Mt dynamik i av kan uppnås genom att behandla cellerna med dimethylenastron (DME), en monastrol analog som hämmar motorn kinesinet Eg541 och förhindrar bildandet av bipolär mitotisk spindel42. Hämning av celler vid av med Eg5 hämmare DME och andra monastrol derivat påverkar inte MT Dynamics43,44,45, vilket gör DME ett användbart verktyg för att studera MT dynamik både i fasta och levande celler44.
Här kombinerar vi metoden för MT Dynamics analys i av celler som beskrivs av ertych et al.44 med Dual spinning diskavbildning. Denna metod möjliggör mätning av Mt-dynamiken i av-celler som samlats in från ett enda fokalplan med en högre bildfrekvens, men utan foto blekning och minimal fototoxicitet. Dessutom, som en fluorescerande reporter, använder vi tandem dimer tomat fluorescerande protein (tdTomato) som har förbättrat ljusstyrka och foto stabilitet i jämförelse med den gröna fluorescerande protein (EGFP) och är upphetsad med lägre energi ljus46. Därför kräver tdTomato mindre lasereffekt för excitation och är mindre fototoxisk. Sammantaget förbättrar vi ytterligare metoden genom att minska fototoxicitet och förbättra den upplösning och postprocessing som krävs för MT Dynamics analys. Dessutom skapar vi en grund för framtida ändringar av metoden genom att kombinera den med andra synkroniseringstekniker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dimethylenastron</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">324622</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin Bovine Plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Sterile powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Stable glutamine substitutive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">jetPRIME</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EB3-TdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>plasmid #50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;-slide</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80426</td>
			<td>4-well slide with #1.5 coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eclipse Ti Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>CFI Apo TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ACAL Laser Excahnger</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disk module</td>
			<td>Andor</td>
			<td>CSU-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Environmental Chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HeLa Cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS Elements v4</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk microscope. Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Computing environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis and display software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles

Vi beskriver en modifiering av en etablerad metod för att bestämma mikrotubuldynamik i levande celler. Protokollet är baserat på uttrycket av en genetiskt kodad markör för de positiva ändarna av mikrotubuli (EB3 märkt med tdTomato fluorescerande protein) och hög hastighet, högupplöst, Live-cell Imaging med spinning disk konfokal mikroskopi. Cell cykel synkronisering och ökad densitet av mikrotubuli uppnås genom att hämma centrosomal separation i mitotiska celler, och analys av tillväxt utförs med hjälp av öppen källkod U-Track programvara. Användningen av en ljus och rödskiftad fluorescerande protein, i kombination med den lägre lasereffekt och minskad exponeringstid som krävs för spinning disk mikroskopi minska fototoxicitet och sannolikheten för ljus-inducerad artefakter. Detta gör det möjligt att avbilda ett större antal celler i samma beredning samtidigt som cellerna bibehålls i ett odlingsmedium under standard odlingsförhållanden. Eftersom analysen utförs i en övervakad automatisk mode, resultaten är statistiskt robust och reproducerbara.

Efter det givna protokollet som beskrivs i figur 1a, uttrycktes PEB3-tdTomato plasmid transitivt i asynkront växande hela celler. Cellerna synkroniserades 48 h efter transfektion vid av genom DME-behandling (figur 1b). Detta steg säkerställde att mätningen av MT-dynamiken alltid gjordes i samma fas av cellcykeln. De Time-lapse filmer behandlades ytterligare och analyseras med U-Track v 2.2.0 som beskrivs i dess kompletterande dokumentation5...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles at JoVE.com

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Här presenterar vi en robust och detaljerad metod för mikrotubuli Dynamics analys i celler synkroniserade i av med Live-cell spinning disk konfokalmikroskopi och MATLAB-baserad bildbehandling.

Mätning av mikrotubuli dynamik genom spinning disk mikroskopi i monopolär mitotiska spindlar

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Vad vi presenterar här är en robust och enkel metod för att analysera mikrotubuli dynamik med hjälp av live-cell spinning disk confocal imaging i celler synkroniseras i prometaphase, och bilder efteråt analyseras på en MATLAB-baserad plattform. Användningen av rödförskjutet fluorescerande protein i kombination med spinndiskmikroskopi minskar fototoxiciteten. Därför kan ett större antal celler avbildas inom samma beredning.Mikrotubuli-dynamiskhet ändras i ett stort antal patologiska förhållanden. Därför kan förstå regleringen och beteendet hos mikrotubuli dynamik i dessa processer hjälpa oss att förstå mekanismen för sjukdom, och så småningom utveckla terapier för att kompensera för dem. Och metoden är också exklusiv, så det skulle kunna tillämpas i en drog upptäckt ansträngning.Metoden kan modifieras genom att fluorescens desynkroniseringsprotokollet ändras och celler erhålls från olika faser i cellcykeln. Detta kan vara användbart när screening droger mot mikrotubuli och identifiera defekt på dela och icke-dela celler. Det är nödvändigt att optimera transfektionsprotokollet och sådddensiteten för varje celltyp.Uttrycksnivån av EB3 bör vara låg, för att upptäcka enstaka växande mikrotubuler. Börja med att skölja asynkront växande HeLa celler i DPBS, sedan inkubera dem med trypsin-EDTA i fem minuter, vid 37 grader Celsius. Stoppa trypsinization genom att lägga RPMI-1640 medium kompletteras med 10%värme inaktiverad FCS vid en tre till ett förhållande, den extra trypsin-EDTA.Beräkna koncentrationen av cellerna enligt manuskriptriktningar, och frö 50, 000 celler i varje brunn av en förberedd, kammade täck. Returnera täckkollapsen till inkubatorn, och odla celler i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. På nästa dag, ta bort cellerna från inkubatorn, och drop-wise lägga 100 mikroliter transfection blandning i varje brunn.Återgå cellerna till inkubatorn, och efter fyra timmars inkubation komplettera cellerna med färskt medium och dessutom inkubera i 20 timmar. Förbered en 2,5 mikromolar lösning av dimetylenastron, eller DME, i fenol röd fri DMEM, kompletterad med 10%FCS och två millimolar L-glutamin. Ersätt tillväxtmediet i det kammade täcket med DME-tillväxtmediet, och återför cellerna till inkubatorn.Efter 3,5 timmars inkubation, överför cellerna till mikroskopet genom att montera den kammade täckplattan i en miljökammare inställd på 37 grader Celsius och 5%koldioxid, med mörka paneler för avbildning. Fortsätt sedan inkubationen i totalt fyra timmar. Utför time lapse imaging på en inverterad mikroskop med en 100X, 1,49 numerisk bländare, olja nedsänkning mål, en dubbel disk confocal system, och en pålitlig auto fokus system.Definiera avbildningsparametrarna enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Hitta en cell i prophase, och fokus i Z-planet som motsvarar centrum av monopolär mitotiska spindel. Sedan förvärva bilder var 5 sekunder, över totalt en minut, utan binning och ingen belysning mellan exponeringar.Börja med att läsa in programvaran för numerisk analys och lägga till mappen U-track V2.2.0 i programvarusökvägen, som kallas filmväljar-GUI, från kommandofönstret. Importera sedan de obehandlade filer som genereras av programvaran för bildanskaffning. Ange målsetommmålsens numeriska bländare manuellt och det tidsintervall som används för avbildning.När alla bilder är laddade, spara in i serien Time Lapse som en film genom att välja spara som filmlista, och alternativet u-track till höger i dialogfönstret. Välj microtubule plus-ends från popup-menyn, och klicka på okej, vilket öppnar en ny dialog fönster för att bestämma parametrarna för de tre stegen i analysen. För steg ett, klicka på inställningar och välj komet upptäckt på rullgardinsmenyn.Definiera parametrarna för skillnaden av Gaussiskt filter och vattendelaresegmenteringen, enligt beskrivningen i manuskriptet. Välj sedan tillämpa inställningar för alla filmer och klicka på Apply. För steg två väljer du mikrotubuli plus-end-dynamiken, och använder inställningsalternativen för att definiera värdena för länkning, gapstängning, sammanslagning och uppdelning samt Kalman-filterfunktioner, enligt textmanuskriptet.För problem med dimensionalitet väljer du två från rullgardinsmenyn och använder fem bildrutor för maximalt mellanrum för att stänga, och tre bildrutor för minsta längd på spårsegment från första steget. Som tidigare väljer du Tillämpa inställningar för alla filmer och klicka på Apply. För steg tre väljer du mikrotubuli dynamik klassificering som en spår analysmetod, och definiera parametrarna genom inställningsknappen.Markera rutorna för ta bort spår i början och slutet av filmen, och gör statistik histogram. Från listrutan väljer du att använda två till tre bildrutor före lucka framåt, och 95:e percentilen för hastighetsfördelning för framåt och bakåt, för omklassificering framåt respektive bakåt. När alla parametrar har definierats, välj tillämpa kontrollera / avmarkera alla filmer, och köra alla filmer lådor från kontrollrutorna u-track fönster, tryck sedan köra.Ett meddelande visas när filmbearbetningen är klar. PEB3-tdTomato plasmid uttrycktes transiently i HeLa celler. Cellerna var synkroniserade med DME behandling.Time lapse filmer av mikrotubuli tillväxt analyserades, och den resulterande tillväxten hastighet och dynamicity ritades. De parametrar som beskrivs för att påverka analysen, till exempel maximal gaplängd och maximal krympningsfaktor, ändrades för samma uppsättning av filmer med tidsförlopp. Motsvarande värden för tillväxthastighet och -dynamik beräknades.Medan den resulterande tillväxthastigheten inte påverkades nämnkraftigt, var dynamiken annorlunda när den maximala gaplängden ändrades. I alla tre fall var detektion av mikrotubuli subtracks liknande, men återuppbyggnaden av hela MT banor påverkades mestadels när maximal gap längd sattes till 15. För att bedöma om bildframställning villkor störde mikrotubuli beteende, första och andra halvorna av time lapse serien analyserades separat, och motsvarande tillväxt hastighet och dynamicity jämfördes.Som väntat upptäcktes inga betydande skillnader. Det är viktigt att tänka på, att eftersom cellerna är synkroniserade i prometafas, är tätheten av mikrotubule mycket hög. Därför måste man ställa in parametrarna för analysen mycket noggrant, inte att felidentifiera olika mikrotubuli.Mätning av mikrotubulidynamik med denna metod kan jämföras med studier av andra biologiska mål direkt, indirekt, som reglerar mikrotubuli.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-cirkulation Mätning i skelettmuskel genom Intra-vitala Mikroskopi

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studera Mitotisk Checkpoint genom att illustrera Dynamic kinetochore Protein beteende och kromosomer Motion i levande<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytiala Embryon

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Levande cell imaging av Primär Rat Neonatal Cardiomyocytes Efter Adenoviral och Lentiviral Transduction Använda Konfokal Spinning Disk mikroskopi

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Använda plusTipTracker Programvara för att mäta mikrotubuli Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tillväxt Kottar

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Beredning av Basic mitotiska spolar i sfäriska emulsionsdropparna

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...