Name: design of a biocompatible drug-eluting tracheal stent in mice with laryngotracheal stenosis
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00
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Istituto nazionale di sordità e altri disturbi della comunicazione dei National Institutes of Health con il numero 1K23DC014082 e 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Questo studio è stato anche sostenuto finanziariamente dalla Triological Society e dall'American College of Surgeons (Alexander Hillel), dall'American Medical Association, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) e da una sovvenzione di formazione T32 NIDCD (Kevin Motz).

NOTA: tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (MO12M354).
1. Preparazione della rapamicia in PLLA-PCL
<ol><li>Preparare due fiale di vetro (con tappi) di 70:30 soluzioni polimeriche PLLA-PCL (viscosità intrinseca 1.3.1.8 DL/G; Tabella dei materiali) soluzioni, con una fiala contenente 1.0% rapamicino e l'altro senza rapamicino.<ol>
<li>Fare una raamicicina 1.0% contenente soluzione polimerica con l'...

<ol>
	<li>Minnigerode, B., Richter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+subglottic+tracheal+stenosis+in+childhood.">Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood.</a> Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+disease+and+the+T(H)1/T(H)2+paradigm.">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).</li><li>Kaplan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Toxicity+Following+Administration+of+Sirolimus+(formerly+Rapamycin)+for+Psoriasis.">Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis.</a> Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).</li><li>Kalra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New-Generation+Coronary+Stents:+Current+Data+and+Future+Directions.">New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions.</a> Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).</li><li>Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+cisplatin-eluting+tracheal+stent+for+malignant+airway+obstruction:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies.</a> Chest. 144 (1), 193-199 (2013).</li><li>Duvvuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+immunomodulatory+drug-eluting+stent+to+treat+laryngotracheal+stenosis.">Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis.</a> Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).</li><li>Mugru, S. D., Colt, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+of+silicone+stent+insertion+in+patients+with+expiratory+central+airway+collapse.">Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse.</a> Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).</li><li>Hillel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+situ,+in+vivo+murine+model+for+the+study+of+laryngotracheal+stenosis.">An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis.</a> JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).</li><li>Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+PLLA/PCL+blends+and+paclitaxel+release+profiles.">Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles.</a> AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+Drug-eluting+Tracheal+Stent+Could+Reduce+Granulation+Tissue+Formation+in+a+Canine+Model.">Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).</li><li>Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+implantation+into+the+tracheo-bronchial+system+in+rabbits:+histopathologic+sequelae+in+bare+metal+vs.+drug-eluting+stents.">Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents.</a> Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).</li><li>Robey, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+internal+bioabsorbable+PLGA+"finger-type"+stents+in+a+rabbit+tracheal+reconstruction+model.">Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model.</a> Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).</li></ol>

I passaggi più critici per costruire e utilizzare con successo uno stent in vivo che elui scandiet a un farmaco sono 1) che determinano il rapporto PLLA-PCL ottimale per il tasso di eguagliazione del farmaco desiderabile, 2) determinando l'adeguata concentrazione del farmaco da eluire, 3) modellare gli stent intorno all'angiocatere per l'uso in vivo, e 4) consegnando transoralmente lo stent nei topi dopo l'induzione della LTS senza causare ostruzione fatale delle vie aeree.
Mentre ci sono div...

La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della trachea più spesso a causa di lesioni post-intubazione iatrogene. La combinazione di colonizzazione batterica, risposta del corpo estraneo a una tracheostomia o tubo endotrachiale, e fattori specifici del paziente portano ad una risposta infiammatoria aberrante. Questa risposta immunitaria disadattata porta alla deposizione di collagene nella trachea, con conseguente restringimento luminale della trachea e successiva stenosi1,2. Poiché l'attuale trattamento per questa malattia è principalmente chirurgico, è stato studiato lo sviluppo di un paradigma di trattamento alternativo basato sulla medicamente che mira alle vie infiammatorie e profibrotiche aberranti che portano a una deposizione eccessiva di collagene. La rapamicia, che inibisce il complesso di segnalazione mTOR, ha dimostrato di avere effetti immunosoppressivi e un robusto effetto antifibroblasto. Tuttavia, quando la rapamicia è somministrata sistemicamente, gli effetti collaterali comuni (ad esempio, iperlipidemia, anemia, trombocitopenia) possono essere pronunciati3. Lo scopo della nostra metodologia è quello di sviluppare un veicolo per la somministrazione di farmaci locali praticabile per l'uso nelle vie aeree che diminuirebbe questi effetti sistemici. Le nostre valutazioni si concentrano sullo studio della risposta immunitaria locale al costrutto di somministrazione di farmaci, nonché sulla sua capacità di inibire la funzione del fibroblasto e alterare il microambiente immunitario locale. Gli esiti specifici della malattia includono test in vivo che valutano i marcatori della fibrosi.
Stent biodegradabili che eludino farmaci sono stati utilizzati in modelli animali di malattia in sistemi di organi multipli, tra cui le vie respiratorie4. Per la gestione della stenosi delle vie aeree o del collasso, indagini precedenti hanno utilizzato stent a base di silicone e nichel rivestiti di farmaci5. Un costrutto PLLA-PCL è stato scelto per questo particolare metodo a causa del suo profilo di eluzione di farmaci e della forza meccanica in condizioni fisiologiche per un periodo di 3 settimane, che è stato dimostrato in precedenti studi pubblicati6. PLLA-PCL è anche un materiale biocompatibile e biodegradabile già approvato dalla FDA4. Gli stent biocompatibili che elucano cisplatina e MMC sono stati studiati in grandi modelli animali come conigli e cani. Tuttavia, in questi modelli animali, gli stent non sono stati collocati in un modello animale di malattia e sono stati impiantati transcervicalmente. Questo studio fornisce un metodo unico per valutare uno stent biocompatibile che epelle farmaci collocato in modo transorale in un modello murino di lesioni delle vie aeree e stenosi largotrale. Uno stent biocompatibile che eluisce un farmaco immunomodulatore localmente e può essere miniaturizzato per lo studio in un modello murino è prezioso per la ricerca preclinica traslazionale. I precedenti tentativi di utilizzo dello stent con altri costrutti materiali hanno generato solide risposte del corpo estraneo che peggiorano l'infiammazione sottostante che distingue LTS7. Questa metodologia, a nostra conoscenza, è la prima nel suo genere a studiare gli effetti immunomodulati e antifibrotici di un sistema di somministrazione di farmaci a base di stent in un modello murino di LTS. Il modello murino stesso offre diversi vantaggi per studiare gli effetti di un farmaco immunomodulatore sulla trachea. Possono essere studiati topi geneticamente modificati e coorti sperimentali di topi sani e malati, che possono portare alla riproducibilità sperimentale e migliorare l'efficacia in termini di costi. Inoltre, la consegna dello stent transoralmente nella trachea del topo imita la consegna clinica di tale stent negli esseri umani, che evidenzia ulteriormente il vantaggio traslazionale di questo metodo. Infine, la relativa facilità con cui lo stent PLLA-PCL con il farmaco può essere prodotta consente modifiche per fornire terapie farmacologiche alternative volte a ridurre la formazione di cicatrici nella trachea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. For stent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge angiocatheter</td>
			<td>Jelco</td>
			<td>4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270997-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDLGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>739955-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLLA-PCL (70 : 30)</td>
			<td>Evonik Industries AG</td>
			<td>65053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>R-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Animal surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire brush</td>
			<td>Mill-Rose Company</td>
			<td>320101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. For immunohistochemistry staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrival buffer</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93678</td>
			<td>Available from other vendors as well; acidic pH needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-488 antibody</td>
			<td>Lif technology</td>
			<td>a11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-633 antibody</td>
			<td>Lif technology</td>
			<td>a21094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic plus slide</td>
			<td>BSB7028</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>100-10023</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat antiF4/80 antibody</td>
			<td>Biolengend</td>
			<td>123101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. For quantative PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5mm glass beads</td>
			<td>OMNI International</td>
			<td>19-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill Homoginizer</td>
			<td>OMNI International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Specific Forward/Reverse Primers</td>
			<td>Genomic Resources Core Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Mastermix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design of a biocompatible drug-eluting tracheal stent in mice with laryngotracheal stenosis

La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della subglottide e della trachea che porta all'ostruzione extratoracica e alla significativa mancanza di respiro. LTS deriva da lesioni mucose da un corpo estraneo nella trachea, che porta a danni ai tessuti e una risposta infiammatoria locale che va storto, portando alla deposizione del tessuto cicatriziale patologico. Il trattamento per LTS è chirurgico a causa della mancanza di terapie mediche efficaci. Lo scopo di questo metodo è quello di costruire uno stent biocompatibile che può essere miniaturizzato per inserire nei topi con LTS. Abbiamo dimostrato che un costrutto PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) aveva una forza biomeccanica ottimale, era biocompatibile, praticabile per uno stent di posizionamento in vivo e in grado di eluire il farmaco. Questo metodo fornisce un sistema di somministrazione di farmaci per testare vari agenti immunomodulatori per inibire localmente l'infiammazione e ridurre la fibrosi delle vie aeree. La produzione degli stent richiede 28-30 ore e può essere riprodotta facilmente, consentendo esperimenti con grandi coorti. Qui abbiamo incorporato il farmaco rapamicina all'interno dello stent per testare la sua efficacia nel ridurre la fibrosi e la deposizione di collagene. I risultati hanno rivelato che le tende PLLA-PCL mostravano un rilascio affidabile di rapamici, erano meccanicamente stabili in condizioni fisiologiche e erano biocompatibili, inducendo poca risposta infiammatoria nella trachea. Inoltre, gli stent PLLA-PCL che hanno ridotto la formazione di cicatrici nella trachea in vivo.

Il costrutto biodegradabile dello stent PLLA-PCL caricato con la rapamicicina utilizzato in questo studio era in grado di eluire la rapamicicina in modo coerente e prevedibile in condizioni fisiologiche (Figura 1). Figura 2 Mostra lo stent PLLA-PCL fuso intorno a un 22 Ggiocatheter per l'uso in un modello murino di LTS. Per determinare se gli effetti dell'eluzione della rapamicina nella trachea sono efficaci nella fibrosi attenuante, i cambiamenti misurati nell'...

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Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

La stenosi larifica deriva da una deposizione di cicatrici patologiche che restringe criticamente le vie aeree tracheali e manca di terapie mediche efficaci. Utilizzando uno stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) come sistema locale di somministrazione di farmaci, possono essere studiate potenziali terapie volte a ridurre la proliferazione della cicatrice nella trachea.

Progettazione di uno stent tracheale biocompatibile che epelle la droga nei topi con stenosi lariosa

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

Questo protocollo ci consente di studiare gli stent che eluiscono i farmaci in un piccolo modello animale di stenosi laringotracheale che ci consente di sfruttare gli animali geneticamente modificati in modo conveniente. Il posizionamento transorale dello stent delle vie aeree che eluisce il farmaco risparmia gli animali da un'incisione aperta nella trachea che rappresenta un modello più clinicamente rilevante di stenosi laringotracheale. Questa tecnica facilita l'indagine preclinica delle strategie locali di somministrazione dei farmaci per il trattamento della stenosi laringolaretracheale.Questa tecnica fornisce una piattaforma fattibile ed efficace per l'indagine traslizionale di stent delle vie aeree che eluiranno farmaci in un piccolo modello animale che possono essere applicati per future indagini su modelli animali più grandi e applicazioni cliniche. intubazione transorale, induzione di lesioni da trachea e fase di posizionamento dello stent delle vie aeree. La dimostrazione visiva di questo intervento chirurgico tecnicamente impegnativo è fondamentale in quanto molti dei dettagli non possono essere descritti completamente a parole.Per creare una soluzione polimerica contenente 1%rapamicina, aggiungere sei milligrammi di rapamicina a 600 milligrammi di 70-30 PLLA-PCL in una fiala di vetro. Sotto una cappa aspirante aggiungere sei millilitri di diclorometano alla rapamicina integrata e controllare la fiala e aggiungere 120 microlitri di glicerolo ad ogni flaconcino. Quindi limitare le fiale e consentire alla soluzione PLLA-PCL di omogeneizzare per sei-12 ore a temperatura ambiente.Per creare uno stent di vie aeree murine, utilizzando materiali e tecniche sterili, applicare un millilitro di rapamicina integrata soluzione PLLA-PCL sulla cannula venosa di un angiocatetere a base di propilene fluorurato calibro 22 mentre rallenta la rotazione del catetere. Una volta applicata tutta la soluzione, puntellare l'angiocatetere modellato con la punta dell'angiocatetere rivolta verso il basso e l'elsa del catetere sul bordo di una piastra di Petri di vetro in un cappuccio sottovuoto. Dopo 24 ore sotto vuoto a temperatura ambiente, torcere delicatamente e far scorrere il catetere dal costrutto dello stent essiccato e controllare circonferenzialmente lo stent per eventuali difetti che potrebbero aver provocato durante il processo di colata.Per aiutare nella visualizzazione, è utile disegnare una sottile linea nera lungo la lunghezza dello stent. Tagliare ogni estremità degli stent fusi con forbici dritte fini in modo che i bordi siano assiali e utilizzare le forbici per tagliare ogni stent in tre segmenti assiali millimetri. Quindi caricare ogni tre millimetri stent su un nuovo catetere venoso calibro 22.Per l'induzione della stenosi laringotracheale, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare il primo mouse su una piattaforma chirurgica in posizione supina e far scorrere un piccolo pezzo di filo apposto sulla parte superiore della piattaforma attorno agli incisivi centrali. Fissare gli arti al tavolo con nastro adesivo e fare un'incisione verticale della linea mediana di 1,5 centimetri nel collo del mouse. Dividere il timo sovrascritta e lateralizzare i due lobi risultanti per visualizzare la trachea.Dividere i muscoli sternoioide e sternotiroidi sovrastanti all'attacco superiore bilateralmente e passare un angiocatetere calibro 22 trasorally attraverso la laringe nella trachea. Utilizzando piccole forcep, applicare pressione sulla laringe anteriore del mouse per aiutare nel corretto posizionamento del catetere. Un angiocatetere correttamente posizionato può essere visualizzato dal suo colore bianco attraverso la trachea.Per indurre la lesione, passare una spazzola metallica rivestita di bleomicina attraverso l'angiocatetere inserito e ritirare lentamente il catetere in modo che rimanga solo la spazzola metallica all'interno della trachea. Utilizzando forcep fini, applicare la contropressione sulla trachea per interrompere meccanicamente il lume tracheale con il pennello prima di reinserire il catetere nella trachea sopra la spazzola. Rimuovere il pennello a filo e riapplicare la Bleomicina prima di inserire e rimuovere il pennello altre quattro volte come appena dimostrato.Dopo l'ultima applicazione di bleomicina, rimuovere il catetere dalla trachea. Per il posizionamento transorale di un PLLA-PCL, assicurarsi che una sottile linea verticale nera sia stata incorporata in ogni stent e intubare transorally il mouse con l'angiocatetere precaricato. Lo stent deve essere visualizzato all'interno della trachea attraverso l'incisione transcervicale.Quando lo stent è in posizione, utilizzare le forcep fini per afferrare saldamente ma delicatamente la trachea attraverso l'incisione per tenere lo stent in posizione e rimuovere il catetere. È fondamentale posizionare lo stent nel modo più attento possibile. Troppa pressione sulla trachea comporterà il collasso dello stent causando ostruzione delle vie aeree e morte all'animale.Chiudere l'incisione con colla tissutale o suture cromatiche 4-0 assorbibili utilizzate qui e consentire al topo di riprendersi con il monitoraggio prima di riportare l'animale nella sua gabbia domestica. All'endpoint sperimentale appropriato, posizionare il mouse di interesse nella posizione supina sulla piattaforma chirurgica e utilizzare forbici dell'iride curve fini per riaprire l'incisione. Esporre la trachea come dimostrato e utilizzare le forbici per dividere la trachea distale al di sotto del livello dello stent.Successivamente, dividere la trachea prossimale sotto la laringe e sopra lo stent e separare la trachea divisa dall'esofago posteriormente. Quindi rimuovere lo stent dalla trachea e fissare la trachea in formalina al 10% per 24 ore. Il costrutto di stent PLLA-PCL caricato con rapamicina biodegradabile utilizzato in questo studio è in grado di eluire la rapamicina in modo coerente e prevedibile in condizioni fisiologiche.In questa immagine, lo stent biocompatibile miniaturizzato può essere osservato in situ all'interno della trachea come indicato dal marcatore nero sullo stent visualizzato attraverso la trachea traslucida del mouse. Dopo 21 giorni, il marcatore di colorante nero può essere utilizzato per confermare il mantenimento della posizione dello stent all'interno della trachea. I test di biocompatibilità che utilizzano colorazione immunofluorescente per marcatori di infiammazione acuta e cronica dimostrano che il costrutto stent PLLA-PCL non è immunoreattivo come determinato dal numero minimo di cellule immunitarie presenti dopo il posizionamento in assenza di lesioni.Manipolare le vie aeree in modo delicato e atraumatico è fondamentale per il successo della procedura. La forza eccessiva, le intubazioni multiple e il collasso dello stent possono portare alla morte animale. Dopo il trattamento con stent di eluizione della rapamicina, è possibile eseguire la valutazione della sopravvivenza, l'espressione genica tramite PCR quantitativa in tempo reale, l'immunoanalisi tra cui citometria del flusso, ELISA e immunoistochimica.Poiché fornisce una piattaforma di successo per l'eluizione dei farmaci in un modello di topo, questa tecnica apre la strada a future indagini di terapie applicate localmente nella stenosi laringotracheale. Il diclorometano è un liquido corrosivo. Assicurarsi di utilizzare sempre una cappa aspirante, dispositivi di protezione individuale e materiali non corrosivi

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