Name: design of a biocompatible drug-eluting tracheal stent in mice with laryngotracheal stenosis
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00
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国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する研究所は、受賞番号1K23DC014082および1R21DC017225(アレクサンダー・ヒレル)の下で。この研究はまた、三物学会と米国外科医大学(アレクサンダー・ヒレル)、米国医師会財団、シカゴ、IL(マダヴィ・ドゥヴリ)、T32 NIDCD研修助成金(ケビン・モッツ)によって財政的に支えられています。

注:ここで説明するすべての方法は、ジョンズホプキンス大学動物ケアと使用委員会(MO12M354)によって承認されました。
1. PLLA-PCLにおけるラパマイシンの調製
<ol><li>70:30 PLLA-PCLポリマー溶液(固有粘度1.3−1.8 DL/G)の2つのガラスバイアル(キャップ付き)を準備します。材料表)1.0%ラパマイシンを含む1つのバイアルとラパマイシンなしの他のバイアルを含むソリュー...

<ol>
	<li>Minnigerode, B., Richter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+subglottic+tracheal+stenosis+in+childhood.">Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood.</a> Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+disease+and+the+T(H)1/T(H)2+paradigm.">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).</li><li>Kaplan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Toxicity+Following+Administration+of+Sirolimus+(formerly+Rapamycin)+for+Psoriasis.">Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis.</a> Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).</li><li>Kalra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New-Generation+Coronary+Stents:+Current+Data+and+Future+Directions.">New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions.</a> Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).</li><li>Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+cisplatin-eluting+tracheal+stent+for+malignant+airway+obstruction:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies.</a> Chest. 144 (1), 193-199 (2013).</li><li>Duvvuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+immunomodulatory+drug-eluting+stent+to+treat+laryngotracheal+stenosis.">Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis.</a> Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).</li><li>Mugru, S. D., Colt, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+of+silicone+stent+insertion+in+patients+with+expiratory+central+airway+collapse.">Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse.</a> Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).</li><li>Hillel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+situ,+in+vivo+murine+model+for+the+study+of+laryngotracheal+stenosis.">An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis.</a> JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).</li><li>Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+PLLA/PCL+blends+and+paclitaxel+release+profiles.">Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles.</a> AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+Drug-eluting+Tracheal+Stent+Could+Reduce+Granulation+Tissue+Formation+in+a+Canine+Model.">Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).</li><li>Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+implantation+into+the+tracheo-bronchial+system+in+rabbits:+histopathologic+sequelae+in+bare+metal+vs.+drug-eluting+stents.">Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents.</a> Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).</li><li>Robey, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+internal+bioabsorbable+PLGA+"finger-type"+stents+in+a+rabbit+tracheal+reconstruction+model.">Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model.</a> Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).</li></ol>

生体内で薬物溶出ステントを正常に構築して使用するための最も重要なステップは、1)望ましい薬物溶出速度に対する最適なPLLA-PCL比を決定し、2)溶出する薬物の適切な濃度を決定し、3)ステントを成形する生体内使用のためのアンギオカテルの周り、および4)致命的な気道閉塞を引き起こすことなく、LTS誘導後にマウスにステントを経口的に送り込む。
気道疾患の動物モ?...

喉頭気管狭窄(LTS)は、イアトロゲン後挿管損傷による気管の病理学的狭窄である。細菌のコロニー形成の組み合わせは、気管切開または気管内チューブに対する異物応答、および患者特異的因子が異常な炎症反応を引き起こす。この不適応免疫応答は、気管内のコラーゲンの沈着につながり、気管およびその後の狭窄1、2の発光狭窄をもたらす。この疾患の現在の治療法は主に外科的であるため、過剰なコラーゲン沈着につながる異常な炎症およびプロ線維性経路を標的とする代替医学的ベースの治療パラダイムの開発が検討されている。mTORシグナル伝達複合体を阻害するラパマイシンは、免疫抑制効果と堅牢な抗線維芽細胞効果を有することが示されている。しかしながら、ラパマイシンが全身的に投与されると、一般的な副作用(例えば、高脂血症、貧血、血小板減少症)は3と発音することができる。私たちの方法論の目的は、これらの全身的な影響を軽減する気道で使用するために実用的な地元の薬物送達のための車両を開発することです。我々の評価は、薬物送達構造に対する局所免疫応答と、線維芽細胞機能を阻害し、局所免疫微小環境を変化させる能力を調査することに焦点を当てている。疾患特異的な結果には、線維症のマーカーを評価する生体内検査が含まれる。
生分解性薬物溶出ステントは、気道4を含む多臓器系における疾患の動物モデルに用いられている。気道狭窄または崩壊の管理のために、以前の調査は、薬物被覆シリコーンおよびニッケルベースのステント5を使用している。PLLA-PCLコンストラクトは、その薬物溶出プロファイルおよび3週間にわたる生理学的状態における機械的強度のためにこの特定の方法に対して選択された、これは、以前に発表された研究6で実証されている。PLLA-PCLはまた、FDA4によって既に承認された生体適合性および生分解性材料である。シスプラチンやMMCを溶出する生体適合性ステントは、ウサギやイヌなどの大型動物モデルで研究されている。しかし、これらの動物モデルでは、ステントは疾患の動物モデルに入れられ、経皮的に移植された。本研究は、気道損傷および喉頭気管狭窄のマウスモデルに経経口的に配置された生体適合性薬物溶出ステントを評価するためのユニークな方法を提供する。免疫調節薬を局所的に溶出し、マウスモデルでの研究のために小型化することができる生体適合性ステントは、翻訳前臨床研究に役立ちます。他の材料構造とのステント利用の以前の試みは、LTS7を区別する基礎炎症を悪化させる堅牢な異物応答を生成しました。この方法論は、我々の知る限り、LTSのマウスモデルにおけるステントベースの薬物送達システムの免疫調節および抗線維化効果を研究する最初の種類である。マウスモデル自体は、気管に対する免疫調節薬の効果を研究するためのいくつかの利点を提供しています。遺伝子組み換えマウスや健康で病気のマウスの実験的コホートを研究することができ、実験的な再現性につながり、費用対効果を向上させることができます。さらに、マウス気管へのステントの送達は、ヒトにおけるこのようなステントの臨床送達を模倣し、この方法の翻訳上の利点をさらに強調する。最後に、薬物とPLLA-PCLステントを製造することができる相対的な容易さは、気管の瘢痕形成を減少させることを目的とした代替薬物療法を提供するための改変を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. For stent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge angiocatheter</td>
			<td>Jelco</td>
			<td>4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270997-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDLGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>739955-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLLA-PCL (70 : 30)</td>
			<td>Evonik Industries AG</td>
			<td>65053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>R-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Animal surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire brush</td>
			<td>Mill-Rose Company</td>
			<td>320101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. For immunohistochemistry staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrival buffer</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93678</td>
			<td>Available from other vendors as well; acidic pH needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-488 antibody</td>
			<td>Lif technology</td>
			<td>a11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-633 antibody</td>
			<td>Lif technology</td>
			<td>a21094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic plus slide</td>
			<td>BSB7028</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>100-10023</td>
			<td>Available from other vendors as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CD3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat antiF4/80 antibody</td>
			<td>Biolengend</td>
			<td>123101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. For quantative PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5mm glass beads</td>
			<td>OMNI International</td>
			<td>19-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Mill Homoginizer</td>
			<td>OMNI International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Specific Forward/Reverse Primers</td>
			<td>Genomic Resources Core Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Mastermix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design of a biocompatible drug-eluting tracheal stent in mice with laryngotracheal stenosis

喉頭気管狭窄(LTS)は、胸外閉塞および著しい息切れにつながる下耳筋炎および気管の病理学的狭窄である。LTSは気管内の異物からの粘膜損傷の結果、組織損傷および局所炎症反応を引き起こし、病理学的瘢痕組織の沈着につながる。LTSの治療は、効果的な医療療法の欠如のために外科的です。この方法の目的は、LTSを有するマウスに配置するために小型化することができる生体適合性ステントを構築することです。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)コンストラクトは、最適な生体力学的強度を有し、生体適合性があり、生体内配置ステントに対して実用的であり、薬物を溶出することができることを実証した。この方法は、局所的に炎症を抑制し、気道線維化を軽減するために、様々な免疫調節剤を試験するための薬物送達システムを提供する。ステントの製造は28-30時間かかり、容易に再生することができ、大きなコホートの実験を可能にする。ここでは、ステント内に薬物ラパマイシンを組み込み、線維化およびコラーゲン沈着を減少させる効果を試験した。結果は、PLLA-PCLテントが信頼性の高いラパマイシン放出を示し、生理学的条件下で機械的に安定であり、生体適合性であり、気管における炎症反応をほとんど誘発することを明らかにした。また、ラパマイシン溶出PLLA-PCLステントは、生体内の気管内の瘢痕形成を減少させた。

本研究で用いたラパマイシンを装填した生分解性PLLA-PCLステント構築物は、生理学的条件下で一貫した予測可能な方法でラパマイシンを溶出することができた(図1)。図2は、LTSのマウスモデルで使用するために22Gアンギオパテテルの周りに鋳造されたPLLA-PCLステントを示す。気管内のラパマイシン溶出の効果が線維化の減衰に有効であるかどうかを?...

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Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

喉頭気管狭窄は、気管気道を重大に狭くし、効果的な医療療法を欠く病理学的瘢痕沈着から生じる。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)ステントを局所薬物送達システムとして用いて、気管内の瘢痕増殖を減少させることを目的とした潜在的な治療法を検討することができる。

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

このプロトコルは、私たちが費用対効果の高い方法で遺伝子組み換え動物を活用することを可能にする喉頭細胞狭窄症の小さな動物モデルで薬物溶出ステントを調査することができます。薬物溶出気道ステントの経方向配置は、喉頭内膜狭窄のより臨床的に関連するモデルを表す気管への開放から動物を惜しむ。この技術は、喉頭内症狭窄を治療するための局所的な薬物送達戦略の前臨床調査を容易にする。この技術は、より大きな動物モデルおよび臨床応用における将来の調査に適用することができる小さな動物モデルにおける薬物溶出気道ステントの翻訳的調査のための実行可能で効果的なプラットフォームを提供する。技術は特に経経口挿管、気管損傷の誘導、および気道ステント配置工程。この技術的に困難な手術の視覚的なデモンストレーションは、細かい詳細の多くが言葉で完全に記述することができないので重要です。ポリマー溶液を含む1%ラパマイシンを作るために、ガラスバイアルに70-30 PLLA-PCLの600ミリグラムにラパマイシンの6ミリグラムを追加します。フュームフードの下で、6ミリリットルのジクロロメタンをラパマイシンに加え、バイアルを制御し、各バイアルに120マイクロリットルのグリセロールを加えます。その後、バイアルをキャップし、PLLA-PCL溶液が室温で6〜12時間均質化できるようにします。無菌材料と技術を使用して、マウス気道ステントを作成するには、カテーテルの回転を遅くしながら、22ゲージフルオロリンエチレンプロピレンベースのアンジオカテーテルの静脈カニューレにPLLA-PCL溶液を補充したラパマイシンの1ミリリットルを塗布する。すべての溶液が適用されたら、アンジオカテーテルの先端を下向きにして成形された血管カテーテルを、真空フードのガラスペトリ皿の端にあるカテーテルのヒルトを支えます。室温で真空状態で24時間後、乾燥したステントコンストラクトからカテーテルを軽くねじってスライドさせ、ステントに対して、鋳造プロセス中に生じた欠陥がないか周回チェックします。視覚化を支援するために、ステントの長さに細い黒い線を引くのが役に立ちます。エッジが軸になるように細かいストレートハサミでキャストされたステントの両端をトリミングし、ハサミを使用して各ステントを3ミリメートル軸セグメントにカットします。次に、3ミリメートルのステントを新しい22ゲージ静脈カテーテルに積み込みます。喉頭筋狭窄誘発の場合、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、最初のマウスを上端の外科プラットフォームに置き、中央切歯の周りのプラットホームの上部に付けられた小さな糸をループする。テープでテーブルに手足を固定し、マウスの首に1.5センチメートルの正中線垂直切開を行います。上に回っている胸腺を分割し、気管を視覚化するために得られた2つの葉を横化します。上にある上にあるステルノヒロイドとステノ甲状腺の筋肉を両側で上の付着で分け、喉頭を通して経道的に22ゲージの血管カテーテルを気管に渡す。小さな鉗子を使用して、カテーテルの正しい配置を助けるためにマウスの前喉頭に圧力をかける。正しく配置された血管カテーテルは、気管を通して白色で視覚化することができます。損傷を誘発するには、挿入された血管カテーテルを通してブレオマイシンコーティングワイヤーブラシを渡し、ワイヤーブラシだけが気管内に残るようにカテーテルをゆっくりと引き出します。細かい鉗子を使用して、ブラシの上に気管にカテーテルを再挿入する前に、ブラシで気管内腔を機械的に破壊するために気管に対する対圧を適用します。ワイヤーブラシを取り外し、先に示したようにブラシを4回挿入して取り外す前に、Bleomycinを再適用します。最後のブレオマイシンの塗布後、気管からカテーテルを取り除く。PLLA-PCLの経方向配置では、細い黒い垂直線が各ステントに組み込まれていることを確認し、プリロードされた血管カテーテルでマウスを経方向に挿管します。ステントは、経頸部切開を通して気管内で視覚化されるべきである。ステントが設置されている場合は、細かい鉗子を使用して、切開を通して気管をしっかりとしっかりとつかんでステントを所定の位置に保持し、カテーテルを取り外します。ステントはできるだけ注意深く配置することが重要です。気管に圧力がかかりすぎると、ステントが崩壊し、気道閉塞や動物の死を引き起こす。ここで使用する組織接着剤または吸収可能な4-0クロミック縫合糸で切開を閉じ、マウスが動物を自宅のケージに戻す前にモニタリングして回復できるようにします。適切な実験エンドポイントで、目的のマウスを手術用プラットフォーム上のスピーヌ位置に置き、細かい湾曲した虹彩はさみを使用して切開を再開します。実演したように気管を露出し、はさみを使用してステントのレベルより下の遠位気管を分割します。次に、近位気管を喉頭の下とステントの上に分け、分割された気管を食道から後道から後で分離する。次に気管からステントを取り出し、気管を10%ホルマリンで24時間固定します。この研究で使用されるPLLA-PCLステント構築物をロードした生分解性ラパマイシンは、生理学的条件下で一貫した予測可能な方法でラパマイシンを溶出することができる。この画像では、微細化された生体適合性ステントは、半透明のマウス気管を介して視覚化されたステント上の黒いマーカーによって示されるように、気管内のその場で観察することができる。21日後、黒色の染料マーカーを使用して、気管内のステント位置の維持を確認することができます。急性および慢性炎症のマーカーに免疫蛍光染色を用いた生体適合性試験は、PLLA-PCLステント構築物が、傷害の不在時に配置後に存在する最小限の免疫細胞数によって決定される免疫反応性ではないことを示している。繊細でトラウマ的な方法で気道を操作することは、手順の成功に不可欠です。過剰な力、複数の挿管、ステントの崩壊は、動物の死につながる可能性があります。ラパマイシン溶出ステントでの治療後、生存率の評価、定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現、フローサイトメトリー、ELISA、免疫体化学を含む免疫測定が行える。マウスモデルにおける薬物溶出のプラットフォームを成功に導くため、この技術は喉頭療法狭窄症における局所応用治療薬の将来の調査への道を開く。ジクロロメタンは腐食性液体です。常にヒュームフード、個人用保護具、非腐食性材料を使用してください

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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