Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 var en gave fra Dr. Zvonimir Dogic. Denne forskning blev støttet af Dr. kun-ta Wus opstartsfond i Worcester Polytechnic Institute. Vi takker Dr. Zvonimir Dogic for protokollerne til at rense og mærke Tubulin og til at syntetisere aktive væsker. Vi er taknemmelige for Dr. Marc Ridilla for hans ekspertise i protein ekspression og rensning. Vi takker Dr. William Benjamin Roger for at hjælpe os med at bygge det temperaturstyrede stadie. Vi anerkender Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) for brug af den biologiske materiale facilitet (BMF). Vi anerkender det kongelige kemi selskab for at tilpasse tallene fra BATE et al. på Soft Matter33.

1. forberedelse af MTs
Forsigtig: i dette trin renser vi tubuliner fra bovin hjernevæv. Bovin hjernen kan forårsage variant Creutzfeldt-Jakob sygdom (vCJD)35. Derfor bør hjerne affald og relaterede opløsninger, flasker og pipettespidser opsamles i en bioaffald taske og bortskaffes som biologisk farligt affald i henhold til institutionens regler.
<ol><li>Purify tubuliner fra kvæg hjernen (modificeret fra Castoldi et al.36).<ol>
<li>Transpor...

Kontrol af aktiv substans in situ åbner døren til styret selvorganisering af aktivstof4,5,24,28,54. I denne artikel præsenterer vi en protokol for brug af temperatur til at kontrollere kinesin-drevne, MT-baserede aktive væsker in situ, baseret på Arrhenius-karakteristisk for systemet29,30,</s...

Aktivstof er differentieret fra konventionelle passive stoffer på grund af sin evne til at omdanne kemisk energi til mekanisk arbejde. Et materiale, der besidder en sådan kapacitet kan bestå af levende eller ikke-levende enheder såsom bakterier, insekter, kolloider, kerner, og cytoskeletale filamenter1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse materielle enheder interagerer med deres naboer. I større målestok, de selv-organisere sig i enten turbulente-lignende hvirvler (aktiv turbulens) eller materialestrømme11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En forståelse af selvorganisering af aktivstof har ført til forskellige anvendelser i molekylære Shuttles, optiske enheder, og parallel beregning21,22,23. At bringe ansøgninger til det næste niveau kræver kontrol ud over selvorganisering. For eksempel, Palacci et al. udviklet en hematite-indkapslet kolloid, at selvkørende kun når de udsættes for manuelt kontrolleret blåt lys, hvilket førte til fremkomsten af levende krystaller24. Morin et al. etablerede kontrol af rullende Quincke kolloider ved hjælp af en tunable ekstern elektrisk felt, hvilket resulterer i kolloid strømmer i en væddeløbsbane-lignende kanal25. Disse tidligere værker demonstrere rollen som lokal kontrol i applikationer og fremme videnbasen af aktive stof.
I denne artikel fokuserer vi på styrbarhed af kinesin-drevne, mikrotubulus (MT)-baserede 3D-aktive væsker. Væskerne består af tre hovedkomponenter: MTs, kinesin Molecular Motors og depletants. De depletanter fremkalde en udtynding kraft til at bundte MTs, som senere bridged af motor klynger. Disse motorer går langs MTstoward plus enden. Når et par bridged MTsis antiparallel, de tilsvarende motorer gå i modsatte retninger. Men motorerne er bundet i en klynge og er ude af stand til at gå fra hinanden, så de i samarbejde glider fra hinanden par af MTs (interfilament glidende, figur 1a). Disse glidende dynamik ophobes, forårsager bundter af MTsto forlænge indtil nå deres Buckling ustabilitet punkt og pause (extensile bundter, figur 1B)26. De brudte bundter er udglødet af nedbrydningen kraft, som efterfølgende strækker sig igen, og dynamikken gentage. Under processen med den gentagne dynamik, røre bundt bevægelser de nærliggende flydende, inducerende strømme, der kan visualiseres ved doping med micron-Scale røbestoffer (figur 1C). Sanchez et al. og henkin et al. har karakteriseret de gennemsnitlige hastigheder af røbestoffer, konstatering af, at hastigheder var tunable ved at variere koncentrationerne af adenosin trifosfat (ATP), depletants, motor klynger, og MTs19,27. Men, en sådan tunbarhed eksisterede kun før aktiv væske syntese. Efter syntese, den tunbarhed var tabt, og væsker selvorganiserede på deres egen måde. For at kontrollere aktiv væske aktivitet efter syntese, Ross.et al. rapporteret en metode ved hjælp af lys-aktiveret denne af motor proteiner, så væske aktivitet, der skal tunet til og fra ved hjælp af lys28. Mens lys kontrol er praktisk i form af lokalt aktivering af væsker, metoden kræver redesigne strukturerne af motor proteiner, sammen med at ændre de optiske stier i et mikroskop. Her giver vi en brugervenlig metode til lokal styring af væske strømme uden mikroskop modifikation, samtidig med at motor strukturen bevares intakt.
Vores metode til lokal tuning aktiv fluid flow er baseret på Arrhenius loven, fordi kinesin-MT reaktion er blevet rapporteret at stige med temperatur29,30,31,32. Vores tidligere undersøgelser viste, at temperatur afhængigheden af den gennemsnitlige hastighed af en aktiv fluid flow fulgte Arrhenius ligningen: v = a exp (-EA/rt), hvor a er en præ-eksponentiel faktor, R er gaskonstanten, EA er aktiveringsenergien, og T er systemets temperatur33. Derfor er flydende aktivitet følsom over for temperatur miljøet, og system temperaturen skal være konsistent for at stabilisere motorens ydeevne, og dermed væskestrømmen hastighed34. I denne artikel viser vi brugen af motorens temperaturafhængighed til løbende at finjustere strømningshastigheden af aktive væsker ved at justere system temperaturen. Vi demonstrerer også forberedelsen af en aktiv væskeprøve, efterfulgt af montering af prøven på et mikroskop stadie, hvis temperatur styres via computer software. En forøgelse af temperaturen fra 16 °C til 36 °C øger den gennemsnitlige strømningshastighed fra 4 til 8 μm/s. Desuden er tunbarhed reversibel: gentagne gange øger og sænker temperaturen sekventielt accelererer og decelererer flowet. Den demonstrerede metode gælder for en lang række systemer, hvor de vigtigste reaktioner adlyder Arrhenius-loven, såsom MT gliding assay29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Vi præsenterer en metode til at bruge temperatur til at tune strømningshastigheder af kinesin-drevne, microtubule-baserede tredimensionale (3D) aktive væsker. Denne metode giver mulighed for tuning hastigheder in situ uden at det er nødvendigt at fremstille nye prøver for at nå forskellige ønskede hastigheder. Desuden giver denne metode mulighed for dynamisk kontrol af hastighed. Cykling temperaturen fører væsker til at flyde hurtigt og langsomt, periodisk. Denne styrbarhed er baseret på Arrhenius-karakteristikken af kinesin-microtubule-reaktionen, der viser et kontrolleret gennemsnitligt strømningshastighedsområde på 4 – 8 μm/s. Den præsenterede metode vil åbne døren til udformningen af mikrofluidisk enheder, hvor strømningshastigheder i kanalen er lokalt tunable uden behov for en ventil.

Klargøring af kinesin-drevne, MT-baserede aktive væsker kræver både kinesin og MTs. MTs blev polymeriseret fra mærkede tubuliner (trin 1,3 og 1,4), der blev renset fra kvæg hjerner (trin 1,1, figur 2A), efterfulgt af genanvendelse for at forbedre renhed (trin 1,2, figur 2B). Kinesinmotorproteinerne blev udtrykt i og renset fra E. coli (trin 2,1 og 2,2, figur 2B)<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Målet med denne protokol er at bruge temperatur til at styre strømningshastigheden af tredimensionelle aktive væsker. Fordelen ved denne metode ikke kun giver mulighed for regulering af strømningshastigheder in situ, men også giver mulighed for dynamisk kontrol, såsom periodisk tuning flow hastigheder op og ned.

Styring af strømningshastigheder for 3D-aktive væsker med mikrotubulus ved hjælp af temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktive stof er blevet brugt i forskellige applikationer som molekylære skygger. For at bringe ansøgningen til det næste niveau, er vi nødt til at udvikle evnen til at styre det aktive stof lokalt. Vi tilbyder en brugervenlig metode, der ikke kræver ændring af den aktive væske.Heller ikke behovet for at ændre den optiske sti mikroskop for at opnå den lokale kontrol af den aktive væske. Vores metode kan anvendes på en bred vifte af systemer, hvor de vigtigste reaktioner adlyder den fejlagtige lov, såsom microtubule glidende analyse eller enzymbaserede systemer. Opsætningen involverer et vandcirkulationssystem.Hvis der opstår utætheder, kan vand beskadige mikroskopet. Derfor, før du vedtager vores protokol, er det vigtigt at sikre, at systemet er lækagefrit. Vores protokol kræver montering af glasprøven på en temperaturfase.Mens manuskriptet beskriver monteringsproceduren, mangler det mekaniske finesser såsom at fastgøre prøven til scenen. Demonstrere proceduren, vil blive Teagan Bate, Edward Jarvis, og Megan Varney. Teagan og Edward er kandidatstuderende, og Megan er en bachelor studerende fra et laboratorium.For at forberede aktive væsker i et Eppendorf-rør blandes 16 punkt syv mikroliter på otte milligram pr. millilitermikrotuli med seks punkt syv mikroliter på et punkt otte mikromolar kinesinmotorklynger og et punkt en mikroliter på 500 millimolar DTT i højsalt M2B. Bundt mikrotubuli ved at tilføje 11 punkt fire mikroliter af syv procent vægt efter vægt polyethylenglycol. Derefter aktivere kinesin motorer ved at tilføje to punkt otte mikroliter af 50 millimolar ATP.ATP-koncentrationerne fastholdes ved at tilsætte to punkt otte mikroliter af stock pyruvatkinase/laktatdehydrogenase og 13 point tre mikroliter på 200 millimolar phosphenolpyuvat. Reducer foto blegning effekt ved at tilføje 10 mikroliter af 20 millimolar Trolox, et punkt et mikroliter på tre punkt fem milligram per milliliter catalise, et punkt en mikroliter af 20 milligram per milliliter glukose oxidase, og et punkt et mikrolitere på 300 milligram per milliliter glukose. Spor bevægelsen af væsken ved at tilføje et punkt seks mikroliter af nul nul to fem procent volumen efter volumen sporstof partikler.Tilsæt høj salt M2B for at opnå et samlet volumen på 100 mikroliter. Dernæst skylles en polyaylamid belagt glas dias og dække slip med DI vand. Tør glassene med trykluft.Placer glassene på en ren, flad overflade. Skær en tre millimeter bred kanal i voksfilmen. Den samlede bredde er den samme bredde som glasdækslet slip på 20 millimeter.Indsæt voks mellem dias og dække slip til at danne et flow celle kanal for væske. Klæbe glasset til voks filmen ved at placere glas voks kompleks på en 80 grader Celsius kogeplade til at smelte voks. Under smeltning, skal du trykke dækslet glide forsigtigt med en pipette spids til ensartet klæbe voks filmen til glasoverflader.Efter vedhæftning afkøles glaskomplekset til stuetemperatur. Læg straks de forberedte aktive væsker på flowkanalen med pipettens spids i en vinkel væk fra kanalåbningen og i kontakt med glasrutsjebanens overflade. Forsegl kanalen med UV-lim.Når du har opbygget en opsætning af temperaturstyring, skal den aktive væskeprøve anbringes på safiroverfladen, mens diassiden kommer i kontakt med overfladen. Fastgør glasrutsjebanen med papirtape. Ved hjælp af kobbertape skal termosensoren fastgøres til dækslets overflade.For at montere opsætningen på et mikroskop fase, med dækslet glide vender mod målene, sikre opsætningen med mikroskop fase nål klemmer. Tænd for temperaturregulatoren og akvariumpumpen. Følg producentens vejledning for at indstille måltemperaturen.Aktiver temperaturregulering. Og optag termosensortemperaturdata. Billede prøven med et konstant tidsinterval på en fluorescerende mikroskopi udstyret med en GFP filterterning til at overvåge Alexa 488-mærkede sporstofpartikler i den aktive blanding.Juster tidsintervallet, så sporstofforskydningen mellem rammerne skal være inden for ni pixel. For billeddannende sporstoffer, der bevæger sig med 10 mikrometer pr. sekund ved hjælp af en fire gange objektiv, anbefales tidsintervallet at være en til fem sekunder. Gem billederne som TIF-filer, navnd filerne baseret på rammenummer, og gem dem i en separat mappe.For denne kinesin drevet mikrotubule baseret aktive væsker, temperaturen blev kontrolleret ved 10, 20, 30 og 40 grader Celsius. Temperaturudsvinget lå inden for nulpunkt en til nulpunktet tre grader Celsius i fire timer, hvilket viste stabiliteten og pålideligheden af denne temperaturstyringsopsætning. Sporstofferne blev afbildet hvert andet sekund, hvilket de sekventielle billeder tillod sporing af sporstofbaner.De gennemsnitlige hastigheder målt ved 20 til 36 grader Celsius, syntes at være næsten tid uafhængig på nul til to timer. Hvor som ved 10 og 40 grader Celsius, de gennemsnitlige hastigheder henfaldet hurtigt forårsaget af mikrotubule depolymerisering under 16 grader Celsius og kinesin klynger funktionsfejl over 36 grader Celsius hhv. Når systemets temperaturer blev vekslet mellem 20 og 30 grader Celsius hver 30 minutter, de gennemsnitlige hastigheder for de aktive væsker ikke kun accelerere og decelerere i overensstemmelse hermed, men de reagerede også på temperaturændringen inden for 10 sekunder.Aktive væsker begynder at fungere forkert, når afkølet under 16 eller opvarmes over 36 grader. Så når man manipulerer temperaturregulatoren, skal du sørge for, at temperaturen er mellem 16 og 36 grader. Evnen til tuning aktiv væske lokalt, giver mulighed for at lede den flydende magt såsom at levere laster fra punkt A til punkt B eller udvikle en microfluidity enhed, der ikke kræver en fysisk ventil.Acrylamid bruges til pels glasvarer er en neurotoksin, som kan absorbere gennem huden. Bær korrekt beskyttelsesudstyr såsom handsker, laboratoriekitler og sikkerhedsbriller for at minimere risikoen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Styring af størrelse, form og stabilitet af supramolekylære polymerer i vand

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Bestemmelse 3D Flow Fields via Multi-kamera Light Field Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Eksperimentel måling af afregningshastigheden af sfæriske partikler i udefinerede og begrænsede overfladeaktive-baserede Shear Thinning Vicoelastic Fluids

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Måling Materiale Mikrostruktur Under Flow Brug 1-2 Plane Flow-Small Angle neutronspredning

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Fremstilling af ensartede nanoskala hulrum via Silicon Direct Wafer Bonding

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Hurtig Imaging teknik til at undersøge Drop Impact Dynamics af ikke-newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Skrivning og lav temperatur Karakterisering af Oxide nanostrukturer

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Visualisere Hyporheic Flow Gennem Bedforms Brug Dye Eksperimenter og Simulering

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Karakterisering af komplet sæt Materiale konstanter og deres temperatur Afhængighed for piezoelektriske materialer Brug Resonant Ultralyd spektroskopi

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...