Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmide K401-BCCP-H6 was een geschenk van Dr. Zvonimir Dogic. Dit onderzoek werd gesteund door Dr. kun-ta Wu's start-up Fund in het Worcester Polytechnic Institute. We danken Dr. Zvonimir Dogic voor de protocollen om tubuline te zuiveren en te labelen en actieve vloeistoffen te synthetiseren. We zijn Dr. Marc Ridilla dankbaar voor zijn expertise in eiwit expressie en zuivering. We danken Dr. William Benjamin Roger voor het assisteren bij het opbouwen van de temperatuurgestuurde stage. Wij erkennen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) voor het gebruik van de biologische materialen faciliteit (BMF). We erkennen de Royal Society of Chemistry voor het aanpassen van de cijfers van bate et al. on Soft Matter33.

1. voorbereiding van MTs
Let op: in deze stap zuiveren we tubulinen van runderhersen weefsel. Runderhersenen kunnen een variant Creutzfeldt-Jakob-ziekte (vCJD)35veroorzaken. Daarom moeten het hersen afval en aanverwante oplossingen, flessen en pipetpunten worden opgevangen in een bioafvalzak en worden afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval volgens de regels van de instelling.
<ol><li>Reinig tubulinen van runderhersenen (gewijzigd van Castoldi et al.<sup class="xref...

Het beheersen van actieve materie in situ opent de deur naar gerichte zelforganisatie van actieve materie4,5,24,28,54. In dit artikel presenteren we een protocol voor het gebruik van temperatuur om kinesin-driven, op Mt gebaseerde actieve vloeistoffen in situ te controleren, gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van het systeem29<sup...

Actieve materie wordt onderscheiden van conventionele passieve materie vanwege zijn vermogen om chemische energie om te zetten in mechanisch werk. Een materiaal dat dergelijke capaciteiten bezit, kan bestaan uit levende of niet-levende wezens zoals bacteriën, insecten, colloïden, granen en cytoskelet filamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deze materiële entiteiten communiceren met hun buren. Op grotere schaal organiseren ze zichzelf in turbulente-wervelingen (actieve turbulentie) of materiaalstromen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Een goed begrip van de zelforganisatie van de actieve materie heeft geleid tot verschillende toepassingen in moleculaire shuttles, optische apparaten en parallelle berekening21,22,23. Om toepassingen naar het volgende niveau te brengen, is controle buiten zelforganisatie vereist. Palacci et al. ontwikkelde bijvoorbeeld een colloïde met hematiet-omhulde die zelfrijdend was bij blootstelling aan handmatig gecontroleerd blauw licht, wat leidde tot het ontstaan van levende kristallen24. Morin et al. richtte de controle op rollende Quincke colloïden op met behulp van een afstembare externe elektrische veld, resulterend in colloïdale massaal in een race track-achtige kanaal25. Deze eerdere werken tonen de rol van lokale controle in toepassingen aan en geven de kennisbasis van de actieve materie door.
In dit artikel richten we ons op de bestuurbaarheid van kinesin-driven, microtubulus (MT)-gebaseerde 3D-actieve vloeistoffen. De vloeistoffen bestaan uit drie hoofdbestanddelen: MTs, kinesin moleculaire motoren, en depletanten. De depletie induceren een uitputting kracht om de MTs te bundelen, die later overbrugd worden door motor clusters. Deze motoren lopen langs de MTstoward het plus-uiteinde. Wanneer een paar overbrugd mtsis Antiparallel, lopen de corresponderende motoren in tegengestelde richtingen. Echter, de motoren zijn gebonden in een cluster en zijn niet in staat om uit elkaar te lopen, zodat ze coöperatief glijden paren van MTs (interfilament glijden, Figuur 1a). Deze schuif dynamiek accumuleren, waardoor bundels van MTsto zich uitstrekken tot hun knik instabiliteit punt en breken (extensile bundels, Figuur 1B)26. De gebroken bundels worden gegloeid door de depletie kracht, die zich vervolgens weer uitstrekt, en de dynamiek herhaling. Tijdens het proces van de herhalende dynamiek roeren de bundel bewegingen de nabijgelegen vloeistof, inducerende stromen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van doping met micron-schaal tracers (Figuur 1C). Sanchez et al. en Henkin et al. hebben de gemiddelde snelheden van tracers gekarakteriseerd, bevinding dat de snelheden afstelbaar waren door de concentraties van adenosinetrifosfaat (ATP), depletanten, motor clusters en MTs19,27te variëren. Echter, dergelijke tunability bestond alleen vóór de actieve vloeistof synthese. Na de synthese ging de toenability verloren en de vloeistoffen zelf organiseerden ze op hun eigen manier. Om actieve vloeistof activiteit na synthese te regelen, rapporteerde Ross.et al. een methode met behulp van de lichtgeactiveerde door dimerisatie van motor eiwitten, waardoor vloeistof activiteit in-en uitgeschakeld kan worden met behulp van licht28. Terwijl lichtsturing handig is in termen van het lokaal activeren van de vloeistoffen, vereist de methode het herontwerpen van de structuren van motor eiwitten, samen met het wijzigen van de optische paden in een microscoop. Hier bieden we een eenvoudig te gebruiken methode voor het lokaal beheersen van vloeistofstromen zonder Microscoop modificatie, terwijl de motorische structuur intact blijft.
Onze methode voor het lokaal afstemmen van de actieve vloeistofstroom is gebaseerd op de Arrhenius-wet omdat de kinesin-MT-reactie is gemeld te verhogen met temperatuur29,30,31,32. Onze eerdere studies toonden aan dat de temperatuurafhankelijkheid van de gemiddelde snelheid van een actieve vloeistofstroom de Arrhenius-vergelijking volgde: v = a exp (-EA/RT), waarbij a een pre-exponentiële factor is, R de gasconstante is, EA de activeringsenergie, en T de systeemtemperatuur33. Daarom is de vloeistof activiteit gevoelig voor de temperatuur omgeving en moet de systeemtemperatuur consistent zijn om de motorprestaties te stabiliseren, en bijgevolg de vloeistofstroom snelheid34. In dit artikel demonstreren we het gebruik van de temperatuurafhankelijkheid van de motor om de stroomsnelheden van actieve vloeistoffen continu af te stemmen door de systeemtemperatuur aan te passen. We demonstreren ook de bereiding van een actief vloeistofmonster, gevolgd door het monteren van het monster op een Microscoop-fase waarvan de temperatuur via computer software wordt geregeld. Het verhogen van de temperatuur van 16 °C tot 36 °C versnelt de gemiddelde stromingssnelheid van 4 tot 8 μm/s. Bovendien is de instelbaarheid omkeerbaar: herhaaldelijk verhogen en verlagen de temperatuur sequentieel versnelt en vertraagt de stroom. De Gedemonstreerde methode is toepasbaar op een breed scala van systemen waarbij de belangrijkste reacties gehoorzamen aan de Arrhenius wet, zoals de MT gliding assay29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

We presenteren een methode voor het gebruik van temperatuur om de stroomsnelheden van kinesin-driven, microtubulusgebaseerde driedimensionale (3D) actieve vloeistoffen af te stemmen. Deze methode maakt het mogelijk om de snelheden in situ te tunen zonder de noodzaak om nieuwe monsters te vervaardigen om verschillende gewenste snelheden te bereiken. Bovendien maakt deze methode de dynamische controle van de snelheid mogelijk. Fietsen de temperatuur leidt de vloeistoffen te stromen snel en langzaam, periodiek. Deze bestuurbaarheid is gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van de kinesin-microtubulusreactie, waarbij een gecontroleerd gemiddelde debietbereik van 4 – 8 μm/s wordt aangetoond. De gepresenteerde methode opent de deur naar het ontwerp van microfluïdische apparaten waarbij de stroomsnelheden in het kanaal lokaal instelbaar zijn zonder dat er een ventiel nodig is.

Het voorbereiden van de kinesin-driven, op MT gebaseerde actieve vloeistoffen vereist zowel kinesin als MTs. De MTs werden gepolymeriseerd van gelabelde tubulinen (stappen 1,3 en 1,4) die werden gezuiverd van runderhersenen (stap 1,1, Figuur 2A), gevolgd door recycling om de zuiverheid te verbeteren (stap 1,2, Figuur 2B). De kinesin-motor eiwitten werden uitgedrukt in en gezuiverd uit E. coli (stappen 2,1 en 2,2 <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Het doel van dit protocol is om temperatuur te gebruiken om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te regelen. Het voordeel van deze methode maakt het niet alleen mogelijk om stroomsnelheden in situ te reguleren, maar maakt ook dynamische controle mogelijk, zoals periodiek afstemmen van stroomsnelheden op en neer.

Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Actieve materie is gebruikt in verschillende toepassingen zoals moleculaire schaduwen. Om de toepassing naar een hoger niveau te tillen, moeten we het vermogen ontwikkelen om de actieve materie lokaal te controleren. Wij bieden een gebruiksvriendelijke methode die geen wijziging van de actieve vloeistof vereist.Noch de noodzaak om het optische pad van de microscoop te wijzigen om de lokale controle van de actieve vloeistof te bereiken. Onze methode kan worden toegepast op een breed scala van systemen waar de belangrijkste reacties gehoorzamen aan de onjuiste wet, zoals de microtubbule zweefvliegen of enzym gebaseerde systemen. De opstelling omvat een watercirculatiesysteem.Als er lekkages optreden, kan water de microscoop beschadigen. Daarom is het, voordat we ons protocol aannemen, belangrijk om ervoor te zorgen dat het systeem lekvrij is. Ons protocol vereist montage van het glasmonster op een temperatuurstadium.Terwijl het manuscript de montageprocedure beschrijft, mist het mechanische subtiliteiten zoals het beveiligen van het monster aan het stadium. Het aantonen van de procedure, zal Teagan Bate, Edward Jarvis, en Megan Varney. Teagan en Edward zijn afgestudeerde studenten, en Megan is een student van een laboratorium.Om actieve vloeistoffen in een Eppendorf buis voor te bereiden, meng 16 punt zeven microliters van acht milligram per milliliter microtubuli met zes punt zeven microliters van een punt acht micromolar kinesin motor clusters, en een punt een microliter van 500 millimolar DTT in hoogzout M2B. Bundel microtubuli door toevoeging van 11 punt vier microliters van zeven procent gewicht in gewicht polyethyleenglycol. Activeer kinesinemotoren door twee punt acht microliters van 50 millimolar ATP toe te voegen.Houd de ATP-concentraties op peil door twee punt acht microliter stock pyruvaat kinase/lactaat dehydrogenase toe te voegen en 13-punts drie microliters van 200 millimolar fosfosfovaavaat. Verminder de foto bleken effect door het toevoegen van 10 microliter van 20 millimolar Trolox, een punt een microliter van drie punt vijf milligram per milliliter catalase, een punt een microliter van 20 milligram per milliliter glucose oxidase, en een punt een microliter van 300 milligram per milliliter glucose. Volg de beweging van de vloeistof door het toevoegen van een punt zes microliters van nul punt nul twee vijf procent volume volume door volume tracer deeltjes.Voeg m2B met hoogzout toe om een totaal volume van 100 microliter te bereiken. Spoel vervolgens een polyacrylamide gecoate glazen glijbaan en dek slip met DI water. Droog de glazen met lucht onder druk.Plaats de glazen op een schoon, plat oppervlak. Snijd een drie millimeter breed kanaal in de wasfilm. De totale breedte is dezelfde breedte als de glazen afdekbrief op 20 millimeter.Steek de was tussen de dia en de cover slip om een flow cell kanaal voor vloeistof te vormen. Kleef het glas aan de wasfilm door het glaswascomplex op een 80 graden Celsius-hete plaat te plaatsen om de was te smelten. Druk tijdens het smelten voorzichtig op de afslag met een pipettenpunt om de wasfilm gelijkmatig aan de glasoppervlakken te hechten.Na hechting koelt u het glascomplex af tot kamertemperatuur. Laad de voorbereide actieve vloeistoffen onmiddellijk naar het stroomkanaal met de pipetpunt schuin verwijderd van de kanaalopening en in contact met het glazen schuifoppervlak. Verzegel het kanaal met UV-lijm.Na het bouwen van een temperatuurregelingsinstelling plaatst u het actieve vloeistofmonster op het saffieroppervlak met de schuifzijde die het oppervlak bereikt. Zet de glazen schuif met papiertape vast. Bevestig de ThermoSensor met kopertape aan het oppervlak van de afdekslip.Om de setup te monteren op een microscoop stadium, met de cover slip schuif naar de doelstellingen, zet de setup met microscoop stadium naaldklemmen. Zet de temperatuurregelaar en de aquariumpomp aan. Volg de richtlijnen van de fabrikant om de doeltemperatuur in te stellen.Schakel temperatuurregeling in. En neem temperatuurgegevens van ThermoSensor op. Beeld het monster met een constant tijdsinterval op een fluorescerende microscopie die is uitgerust met een GFP-filterkubus om de Alexa 488-gelabelde tracerdeeltjes in de actieve mix te controleren.Pas het tijdsinterval aan om de verplaatsing van de tracer tussen frames binnen negen pixels te laten liggen. Voor beeldvormende tracers die zich met 10 micrometer per seconde bewegen, met behulp van een viervoudige doelstelling, wordt het tijdsinterval aanbevolen om één tot vijf seconden te zijn. Sla de afbeeldingen op als TIF-bestanden, geef de bestanden een naam op basis van framenummer en bewaar ze in een aparte map.Voor deze kinesine gedreven microtubuli gebaseerde actieve vloeistoffen, werd de temperatuur gecontroleerd op 10, 20, 30, en 40 graden Celsius. De temperatuurschommelingen waren vier uur lang binnen nul punt 1 tot 3 graden Celsius, wat de stabiliteit en betrouwbaarheid van deze temperatuurregelingsopstelling aantoonde. De tracers werden om de twee seconden afgebeeld, wat de sequentiële beelden mogelijk maakten voor het volgen van traceertrajecten.De gemiddelde snelheden gemeten op 20 tot 36 graden Celsius, bleek bijna tijd onafhankelijk op nul tot twee uur. Waar bij 10 en 40 graden Celsius, de gemiddelde snelheden vervallen snel veroorzaakt door microtubuli depolymerization onder de 16 graden Celsius en de kinesine clusters defect boven 36 graden Celsius respectievelijk. Toen de systeemtemperaturen elke 30 minuten tussen de 20 en 30 graden Celsius werden afgewisseld, versnelden niet alleen de gemiddelde snelheden van de actieve vloeistoffen en vertraagden ze dienovereenkomstig, maar reageerden ze ook binnen 10 seconden op de temperatuurverandering.Actieve vloeistoffen beginnen te defect raken, wanneer gekoeld onder 16 of verwarmd boven 36 graden. Dus bij het manipuleren van de temperatuur controller, zorg ervoor dat de temperatuur tussen de 16 en 36 graden. Het vermogen om actieve vloeistof lokaal af te stemmen, maakt het mogelijk om de vloeistofkracht te sturen, zoals het leveren van ladingen van punt A naar punt B of het ontwikkelen van een microfluidity-apparaat dat geen fysieke klep vereist.De acrylamide die wordt gebruikt om glaswerk te coaten is een neurotoxine dat via de huid kan absorberen. Draag de juiste beschermende apparatuur zoals handschoenen, labjassen en veiligheidsbrillen om risico's te minimaliseren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van de supramoleculaire polymeren in water

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Het bepalen van 3D stromingen via Multi-camera Light Field Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Experimentele meting van de bezinksnelheid van bolvormige deeltjes in ongeconfinieerde en beperkte op oppervlakteactieve stoffen gebaseerde afschuifverdunning visco-elastische vloeistoffen

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Meten Materiaal microstructuur Onder Flow Met behulp van 1-2 Plane Flow-Lage hoek neutronenverstrooiing

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Fabricage van uniforme nanoschaalholtes via Silicon Direct Wafer Bonding

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Snelle beeldvormende techniek om te studeren Drop Impact Dynamiek van niet-Newtoniaanse vloeistoffen

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Schrijven en lage temperatuur karakterisering van nanostructuren

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Visualiseren Hyporheic Flow Through bedforms behulp Dye Experimenten en Simulation

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Karakterisering van de volledige set Material constanten en hun Temperatuur Afhankelijkheid van piëzo-elektrische materialen met behulp van Resonant Ultrasound Spectroscopie

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...