Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 était un cadeau du Dr Zvonimir Dogic. Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage du Dr Kun-Ta Wu à l'Institut polytechnique de Worcester. Nous remercions le Dr Zvonimir Dogic pour les protocoles visant à purifier et à étiqueter la tubuline et à synthétiser les fluides actifs. Nous sommes reconnaissants au Dr Marc Ridilla pour son expertise dans l'expression et la purification des protéines. Nous remercions le Dr William Benjamin Roger de nous avoir aidés à construire la scène à température contrôlée. Nous reconnaissons Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) pour l'utilisation de la Facilité des matériaux biologiques (BMF). Nous remercions la Royal Society of Chemistry d'avoir adapté les chiffres de Bate et coll. sur Soft Matter33.

1. Préparation des MT
CAUTION: Dans cette étape, nous purifions les tubulines à partir de tissus cérébraux bovins. Le cerveau bovin peut causer la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ)35. Par conséquent, les déchets cérébraux et les solutions connexes, les bouteilles et les pointes de pipette doivent être collectés dans un sac de biodéchets et éliminés comme déchets biodangereux selon les règles de l'institution.
<ol><li>Purifier les tubul...

Le contrôle de la matière active in situ ouvre la porte à l'auto-organisation dirigée de la matière active4,5,24,28,54. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l'utilisation de la température pour contrôler la kinésine, à base de MT fluides actifs in situ, basé sur la caractéristique Arrhenius du système29,...

La matière active est différenciée de la matière passive conventionnelle en raison de sa capacité à convertir l'énergie chimique en travaux mécaniques. Un matériau qui possède une telle capacité peut consister en des entités vivantes ou non vivantes telles que les bactéries, les insectes, les colloïdes, les grains et les filaments cytosquelettiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ces entités matérielles interagissent avec leurs voisins. À plus grande échelle, ils s'auto-organisent en tourbillons turbulents (turbulence active) ou flux matériels11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Une compréhension de l'auto-organisation de la matière active a conduit à diverses applications dans les navettes moléculaires, dispositifs optiques, et le calcul parallèle21,22,23. Pour amener les applications au niveau suivant, il faut contrôler au-delà de l'auto-organisation. Par exemple, Palacci et coll. ont mis au point un colloïd encapsulé par hématite qui n'est automoteur que lorsqu'il est exposé à la lumière bleue contrôlée manuellement, ce qui a mené à l'émergence de cristaux vivants24. Morin et coll. ont établi le contrôle des colloïdes Quincke roulants à l'aide d'un champ électrique externe réglable, ce qui a entraîné un affluement colloïdal dans un canal de course25. Ces travaux antérieurs démontrent le rôle du contrôle local dans les applications et font progresser la base de connaissances de la matière active.
Dans cet article, nous nous concentrons sur la contrôlabilité des fluides actifs 3D à base de microtubule (MT) à base de kinésie. Les fluides se composent de trois composants principaux : les TM, les moteurs moléculaires de kinésie et les appauvrissements. Les appauvrissements induisent une force d'épuisement pour empaqueter les MT, qui sont plus tard comblés par des groupes moteurs. Ces moteurs marchent le long de la MTstoward l'extrémité plus. Lorsqu'une paire de MTsis pontée antiparallèle, les moteurs correspondants marchent dans des directions opposées. Cependant, les moteurs sont liés dans un cluster et sont incapables de marcher à part, de sorte qu'ils glissent en collaboration à part les paires de MTs (glissement interfilament, Figure 1A). Ces dynamiques de glissement s'accumulent, causant des faisceaux de MTsto s'étendre jusqu'à atteindre leur point d'instabilité et de rupture (faisceaux extésiles, Figure 1B)26. Les faisceaux cassés sont annealed par la force d'épuisement, qui s'étend par la suite encore, et la dynamique se répète. Pendant le processus de la dynamique de répétition, les mouvements de faisceau remuer le liquide voisin, induisant des flux qui peuvent être visualisés par le dopage avec des traceurs à l'échelle micron (Figure 1C). Sanchez et coll. et Henkin et coll. ont caractérisé les vitesses moyennes des traceurs, constatant que les vitesses étaient réglables en variant les concentrationsde triphosphate d'adénosine (ATP), d'épuisements, de grappes motrices et de MT1,27. Cependant, une telle tunability n'existait qu'avant la synthèse active des fluides. Après synthèse, l'amaigrabilité a été perdue, et les fluides auto-organisés à leur manière. Pour contrôler l'activité active des fluides après synthèse, Ross.et al. a signalé une méthode utilisant la dimérisation activée par la lumière des protéines motrices, permettant à l'activité des fluides d'être réglée et désactivée à l'aide de la lumière28. Alors que le contrôle de la lumière est pratique en termes d'activation locale des fluides, la méthode nécessite de repenser les structures des protéines motrices, ainsi que de modifier les trajectoires optiques dans un microscope. Ici, nous fournissons une méthode facile à utiliser pour contrôler localement les flux de fluides sans modification de microscope tout en gardant la structure du moteur intacte.
Notre méthode de régler localement le flux de fluide actif est basée sur la loi Arrhenius parce que la réaction kinesin-MT a été rapportée pour augmenter avec la température29,30,31,32. Nos études précédentes ont montré que la dépendance à la température de la vitesse moyenne d'un flux de fluide actif a suivi l'équation D'Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), où A est un facteur pré-exponentiel, R est la constante du gaz, Ea est l'énergie d'activation, et T est la température du système33. Par conséquent, l'activité des fluides est sensible à l'environnement de température, et la température du système doit être cohérente pour stabiliser les performances du moteur, et par conséquent, la vitesse d'écoulement du fluide34. Dans cet article, nous démontrons l'utilisation de la dépendance à la température du moteur pour régler en permanence les vitesses d'écoulement des fluides actifs en ajustant la température du système. Nous démontrons également la préparation d'un échantillon actif de fluide, suivi par le montage de l'échantillon sur une étape de microscope dont la température est commandée par l'intermédiaire du logiciel d'ordinateur. L'augmentation de la température de 16 à 36 oC accélère la vitesse moyenne d'écoulement de 4 à 8 m/s. De plus, l'advisibilité est réversible : augmenter et diminuer à plusieurs reprises la température accélère et ralentit séquentiellement le débit. La méthode démontrée s'applique à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi Arrhenius, comme l'assay MT29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Nous présentons une méthode pour utiliser la température pour régler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels (3D) à base de kinésine. Cette méthode permet de tuning les vitesses in situ sans avoir besoin de fabriquer de nouveaux échantillons pour atteindre différentes vitesses souhaitées. En outre, cette méthode permet le contrôle dynamique de la vitesse. Le cycle de la température conduit les fluides à circuler rapidement et lentement, périodiquement. Cette maniabilité est basée sur la caractéristique Arrhenius de la réaction kinesin-microtubule, démontrant une plage de vitesse moyenne contrôlée de 4 à 8 m/s. La méthode présentée ouvrira la porte à la conception de dispositifs microfluidiques où les débits dans le canal sont localement réglables sans avoir besoin d'une valve.

La préparation des fluides actifs à base de kinésie, à base de MT, nécessite à la fois de la kinésie et des TM. Les TM ont été polymérisés à partir de tubulines étiquetées (étapes 1.3 et 1.4) qui ont été purifiées à partir de cerveaux bovins (étape 1.1, Figure 2A),suivies du recyclage pour améliorer la pureté (étape 1.2, Figure 2B). Les protéines motrices kinesin ont été exprimées et purifiées à part...

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Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Le but de ce protocole est d'utiliser la température pour contrôler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels. L'avantage de cette méthode permet non seulement de réguler les vitesses de débit in situ, mais permet également un contrôle dynamique, comme le mise au point périodiquement des vitesses de débit de haut en bas.

Contrôle des vitesses de débit des fluides actifs 3D à base de microtubules à l'aide de la température

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

La matière active a été utilisée dans diverses applications comme les ombres moléculaires. Pour amener l’application au niveau suivant, nous devons développer la capacité de contrôler la matière active localement. Nous fournissons une méthode facile à utiliser qui ne nécessite pas de modification du fluide actif.Ni la nécessité de modifier la trajectoire optique du microscope pour atteindre le contrôle local du fluide actif. Notre méthode peut être appliquée à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi erronée comme l’analyse de glisse microtubule ou les systèmes à base d’enzymes. La configuration implique un système de circulation d’eau.En cas de fuite, l’eau peut endommager le microscope. Par conséquent, avant d’adopter notre protocole, il est important de s’assurer que le système est exempt de fuites. Notre protocole exige le montage de l’échantillon de verre sur une étape de température.Bien que le manuscrit décrit la procédure de montage, il manque de subtilités mécaniques telles que la sécurisation de l’échantillon à la scène. Teagan Bate, Edward Jarvis et Megan Varney feront la démonstration de la procédure. Teagan et Edward sont des étudiants diplômés, et Megan est étudiante de premier cycle dans un laboratoire.Pour préparer les fluides actifs dans un tube d’Eppendorf, mélanger 16 points sept microlitres de huit milligrammes par millilitre microtubules avec six points sept microlitres d’un point huit grappes de moteurs de kinésine micromolaire, et un point un microlitres de 500 millimolar DTT en M2B riche en sel. Empaquetez les microtubules en ajoutant 11 points quatre microlitres de sept pour cent de poids par le glycol de polyéthylène de poids. Activez ensuite les moteurs kinésine en ajoutant deux points huit microlitres de 50 millimolar ATP.Maintenir les concentrations d’ATP en ajoutant deux points huit microlitres de kinase pyruvate de stock/déshydrogénase lactate, et 13 points trois microlitres de pyruvate de phosphenol de 200 millimolaires. Réduisez l’effet de blanchiment photo en ajoutant 10 microlitres de Trolox de 20 millimlaires, un point un microlitres de trois points cinq milligrammes par catalase millilitre, un point un microlitres de 20 milligrammes par oxidase de glucose millilitre, et un point un microlitre de 300 milligrammes par glucose millilitre. Suivez le mouvement du fluide en ajoutant un point six microlitres de zéro point zéro deux cinq pour cent de volume par particules traceurs de volume.Ajouter m2B à haute teneur en sel pour atteindre un volume total de 100 microlitres. Ensuite, rincez une glissière en verre enduit de polyacrylamide et recouvrez-la d’eau DI. Sécher les verres avec de l’air pressurisé.Placez les verres sur une surface propre et plane. Couper un canal de trois millimètres de large dans le film de cire. La largeur totale est la même largeur que le glissement de couverture en verre à 20 millimètres.Insérez la cire entre la glissière et le glissement de couvercle pour former un canal cellulaire d’écoulement pour le fluide. Adhérez le verre au film de cire en plaçant le complexe de cire de verre sur une plaque chaude de 80 degrés Celsius pour faire fondre la cire. Pendant la fonte, appuyez doucement sur le couvercle à l’aide d’une pointe de pipette pour coller uniformément le film de cire aux surfaces vitrées.Après l’adhérence, refroidir le complexe de verre à température ambiante. Chargez rapidement les fluides actifs préparés jusqu’au canal d’écoulement avec la pointe de la pipette à un angle éloigné de l’ouverture du canal et en contact avec la surface de la glissière en verre. Sceller le canal avec de la colle UV.Après avoir construit une configuration de contrôle de température, placez l’échantillon de fluide actif sur la surface du saphir avec le côté de la glissière en contact avec la surface. Fixez la glissière en verre avec du ruban adhésif. À l’aide de ruban de cuivre, fixez le ThermoSensor à la surface du glissement du couvercle.Pour monter l’installation sur une scène de microscope, avec la glissière de glissement de couverture orientée vers les objectifs, fixez la configuration avec des pinces d’aiguille d’étape de microscope. Allumez le contrôleur de température et la pompe à réservoir de poisson. Suivez le guide des fabricants pour fixer la température cible.Activer le contrôle de la température. Et enregistrez les données de température ThermoSensor. Imagez l’échantillon avec un intervalle de temps constant sur une microscopie fluorescente équipée d’un cube de filtre GFP pour surveiller les particules traceurs étiquetées Alexa 488 dans le mélange actif.Ajustez l’intervalle de temps pour permettre au déplacement du traceur entre les images d’être à moins de neuf pixels. Pour les traceurs d’imagerie se déplaçant à 10 micromètres par seconde, à l’aide d’un objectif quatre fois, l’intervalle de temps est recommandé d’être de une à cinq secondes. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIF, nommez les fichiers en fonction du numéro d’image et stockez-les dans un dossier distinct.Pour ces fluides actifs à base de microtubules entraînés par la kinésine, la température a été contrôlée à 10, 20, 30 et 40 degrés Celsius. La fluctuation de température a été dans zéro point un à zéro point trois degrés Celsius pendant quatre heures démontrant la stabilité et la fiabilité de cette configuration de contrôle de la température. Les traceurs étaient photographiés toutes les deux secondes, ce que les images séquentielles permettaient de suivre les trajectoires des traceurs.Les vitesses moyennes mesurées entre 20 et 36 degrés Celsius semblaient être presque indépendantes du temps à zéro à deux heures. Là où, à 10 et 40 degrés Celsius, les vitesses moyennes se sont rapidement détériorées en fonction de la dépolymerisation des microtubules inférieure à 16 degrés Celsius et des grappes de kinésine qui dysfonctionnement au-dessus de 36 degrés Celsius respectivement. Lorsque les températures du système ont été alternées entre 20 et 30 degrés Celsius toutes les 30 minutes, les vitesses moyennes des fluides actifs ont non seulement accéléré et ralenti en conséquence, mais elles ont également réagi au changement de température dans les 10 secondes.Les liquides actifs commencent à mal fonctionner lorsqu’ils sont refroidis en dessous de 16 ou chauffés au-dessus de 36 degrés. Ainsi, lors de la manipulation du contrôleur de température, assurez-vous que la température est comprise entre 16 et 36 degrés. La capacité d’accorder le fluide actif localement, permet de diriger la puissance du fluide comme la livraison de cargaisons du point A au point B ou le développement d’un dispositif de microfluidité qui ne nécessite pas de valve physique.L’acrylamide utilisé pour enduire la verrerie est une neurotoxine qui peut absorber à travers la peau. Portez l’équipement protecteur approprié tel que des gants, des manteaux de laboratoire et des lunettes de sécurité pour réduire au minimum le risque.

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