Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
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Plasmid K401-BCCP-H6 war ein Geschenk von Dr. Zvonimir Dogic. Diese Forschung wurde vom Start-up-Fonds von Dr. Kun-Ta Wu im Worcester Polytechnic Institute unterstützt. Wir danken Dr. Zvonimir Dogic für die Protokolle zur Reinigung und Kennzeichnung von Tubulin und zur Synthese von Aktivenflüssigkeiten. Wir danken Dr. Marc Ridilla für seine Expertise in der Proteinexpression und -reinigung. Wir danken Dr. William Benjamin Roger für die Unterstützung beim Bau der temperaturgeregelten Bühne. Wir würdigen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) für die Nutzung der Biological Materials Facility (BMF). Wir würdigen die Royal Society of Chemistry für die Anpassung der Figuren von Bate et al. auf Soft Matter33.

1. Vorbereitung von MTs
VORSICHT: In diesem Schritt reinigen wir Tubuline aus Rinderhirngewebe. Rinderhirn kann Die Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD)verursachen 35. Daher sollten die Hirnabfälle und die damit verbundenen Lösungen, Flaschen und Pipettenspitzen in einem Bioabfallbeutel gesammelt und nach den Regeln der Institution als biogefährlicher Abfall entsorgt werden.
<ol><li>Reinigen Sie Tubuline aus dem Rinderhirn (modifiziert von Castoldi et al.<su...

Die Kontrolle der aktiven Materie vor Ort öffnet die Tür zur gerichteten Selbstorganisation der aktiven Materie4,5,24,28,54. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Temperatur zur Steuerung von kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten vor Ort vor, basierend auf der Arrhenius-Kennlinie des Systems29...

Aktive Materie unterscheidet sich von konventioneller Passivmaterie aufgrund ihrer Fähigkeit, chemische Energie in mechanische Arbeit umzuwandeln. Ein Material, das eine solche Fähigkeit besitzt, kann aus lebenden oder nicht lebenden Wesen wie Bakterien, Insekten, Kolloiden, Körnern und Zytoskelettfilamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Diese materiellen Entitäten interagieren mit ihren Nachbarn. In größerem Maßstab organisieren sie sich entweder in turbulenten Wirbeln (aktive Turbulenzen) oder Materialflüsse11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein Verständnis der Selbstorganisation von aktiver Materie hat zu verschiedenen Anwendungen in molekularen Shuttles, optischen Geräten und paralleler Berechnung21,22,23geführt. Um Anwendungen auf die nächste Stufe zu bringen, bedarf es einer Kontrolle über die Selbstorganisation hinaus. Zum Beispiel entwickelten Palacci et al. ein Hämatit-verkapseltes Kolloid, das nur selbstgetrieben wurde, wenn es manuell kontrolliertem blauem Licht ausgesetzt wurde, was zur Entstehung lebender Kristalle führte24. Morin et al. etablierten die Steuerung der rollenden Quincke-Kolloide durch die Verwendung eines abstimmbaren externen elektrischen Feldes, was zu kolloidalen Beflockungen in einem Rennstrecken-ähnlichen Kanal25führte. Diese früheren Arbeiten zeigen die Rolle der lokalen Kontrolle in Anwendungen und fördern die Wissensbasis der aktiven Materie.
In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Steuerbarkeit von kinesingetriebenen, mikrotubuli (MT)-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten. Die Flüssigkeiten bestehen aus drei Hauptkomponenten: MTs, Kinesin-Molekularmotoren und Depletanten. Die Erschöpfungskräfte induzieren eine Erschöpfungskraft, um die MTs zu bündeln, die später durch Motorcluster überbrückt werden. Diese Motoren laufen entlang der MTsgegenüber des Plus-Ends. Wenn ein Paar überbrückte MTsis antiparallel, die entsprechenden Motoren gehen in entgegengesetzte Richtungen. Die Motoren sind jedoch in einem Cluster gebunden und können nicht auseinandergehen, so dass sie kooperative MT-Paare auseinanderschieben (Interfilament-Gleiten, Abbildung 1A). Diese Gleitdynamik akkumuliert, wodurch sich die MTsto-Bündel bis zum Erreichen ihres Knickinstabilitätspunkts ausdehnen und brechen (Extensile-Bündel, Abbildung 1B)26. Die gebrochenen Bündel werden durch die Erschöpfungskraft geglüht, die sich anschließend wieder ausdehnt, und die Dynamik wiederholt sich. Während des Prozesses der sich wiederholenden Dynamik rühren die Bündelbewegungen die nahe flüssigkeitsnahe und induzierenden Ströme, die durch Doping mit Mikron-Tracern visualisiert werden können (Abbildung 1C). Sanchez et al. und Henkin et al. haben die mittleren Geschwindigkeiten von Tracern charakterisiert und festgestellt, dass die Geschwindigkeiten durch Variation der Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP), Depletanten, Motorclustern und MTs19,27abstimmbar waren. Eine solche Tunabilität existierte jedoch erst vor der aktiven Flüssigkeitssynthese. Nach der Synthese ging die Tunability verloren und die Flüssigkeiten selbst organisiert auf ihre eigene Weise. Um die aktive Flüssigkeitsaktivität nach der Synthese zu steuern, berichtete Ross.et al. über eine Methode, bei der die lichtaktivierte Dimerisierung von motorischen Proteinen verwendet wurde, so dass die Flüssigkeitsaktivität mit Licht28ein- und ausgeschaltet werden konnte. Während die Lichtsteuerung in Bezug auf die lokale Aktivierung der Flüssigkeiten praktisch ist, erfordert die Methode eine Neugestaltung der Strukturen von motorischen Proteinen sowie die Änderung der optischen Pfade im Mikroskop. Hier bieten wir eine einfach zu bedienende Methode zur lokalen Steuerung von Flüssigkeitsströmen ohne Mikroskopmodifikation unter Beibehaltung der Motorstruktur.
Unsere Methode der lokalen Abstimmung des aktiven Flüssigkeitsflusses basiert auf dem Arrhenius-Gesetz, da die Kinesin-MT-Reaktion mit der Temperatur29,30,31,32zunimmt. Unsere früheren Studien zeigten, dass die Temperaturabhängigkeit der mittleren Geschwindigkeit eines aktiven Flüssigkeitsflusses der Arrhenius-Gleichung folgte: v = A exp(-Ea/RT), wobei A ein präexponentieller Faktor ist, R die Gaskonstante ist, Ea die Aktivierungsenergie und T die Systemtemperatur33. Daher ist die Flüssigkeitsaktivität empfindlich auf die Temperaturumgebung, und die Systemtemperatur muss konsistent sein, um die Motorleistung und damit die Flüssigkeitsdurchflussgeschwindigkeit34zu stabilisieren. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung der Temperaturabhängigkeit des Motors, um die Fließgeschwindigkeiten von aktiven Flüssigkeiten kontinuierlich zu optimieren, indem die Systemtemperatur eingestellt wird. Wir zeigen auch die Herstellung einer aktiven Flüssigkeitsprobe, gefolgt von der Montage der Probe auf einer Mikroskopstufe, deren Temperatur über Computersoftware gesteuert wird. Die Erhöhung der Temperatur von 16 °C auf 36 °C beschleunigt die mittleren Durchflussgeschwindigkeiten von 4 auf 8 m/s. Zusätzlich ist die Tunbarkeit reversibel: Immer wieder erhöht und verringert die Temperatur sequentiell beschleunigt und verlangsamt den Durchfluss. Die demonstrierte Methode ist auf eine Breite von Systemen anwendbar, bei denen die Hauptreaktionen dem Arrhenius-Gesetz gehorchen, wie z. B. der MT-Gleittest29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Wir stellen eine Methode zur Temperaturoptimierung der Fließgeschwindigkeiten von kinesingetriebenen, mikrotubulienbasierten dreidimensionalen (3D) aktiven Flüssigkeiten vor. Diese Methode ermöglicht es, die Geschwindigkeiten vor Ort zu optimieren, ohne dass neue Proben hergestellt werden müssen, um unterschiedliche gewünschte Geschwindigkeiten zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die dynamische Steuerung der Geschwindigkeit. Durch das Radfahren der Temperatur fließen die Flüssigkeiten in regelmäßigen Abständen schnell und langsam. Diese Steuerbarkeit basiert auf der Arrhenius-Eigenschaft der Kinesin-Mikrotubuli-Reaktion, die einen kontrollierten mittleren Durchflussgeschwindigkeitsbereich von 4–8 m/s demonstriert. Die vorgestellte Methode öffnet die Tür zum Design mikrofluidischer Geräte, bei denen die Durchflussraten im Kanal lokal abstimmbar sind, ohne dass ein Ventil erforderlich ist.

Die Vorbereitung der kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten erfordert sowohl Kinesin als auch MTs. Die MTs wurden aus markierten Tubulinen (Schritte 1.3 und 1.4) polymerisiert, die von Rinderhirnen gereinigt wurden (Schritt 1.1, Abbildung 2A), gefolgt von Recycling zur Verbesserung der Reinheit (Schritt 1.2, Abbildung 2B). Die Kinesin-Motorproteine wurden in E. coli exprimiert und gereinigt (Schritte 2.1...

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Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Temperatur zu verwenden, um die Fließgeschwindigkeiten dreidimensionaler aktiver Flüssigkeiten zu steuern. Der Vorteil dieser Methode ermöglicht nicht nur die Regelung der Durchflussgeschwindigkeiten vor Ort, sondern auch eine dynamische Steuerung, wie z. B. die regelmäßige Abstimmung der Durchflussgeschwindigkeiten nach oben und unten.

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktive Materie wurde in verschiedenen Anwendungen wie molekularen Schatten verwendet. Um die Anwendung auf die nächste Stufe zu bringen, müssen wir die Fähigkeit entwickeln, die aktive Materie lokal zu kontrollieren. Wir bieten eine einfach zu bedienende Methode, die keine Änderung der aktiven Flüssigkeit erfordert.Auch nicht die Notwendigkeit, den optischen Pfad des Mikroskops zu ändern, um die lokale Kontrolle der aktiven Flüssigkeit zu erreichen. Unsere Methode kann auf eine Breite von Systemen angewendet werden, bei denen die Hauptreaktionen dem falschen Gesetz folgen, wie z. B. dem Mikrotubuli-Gleittest oder enzymbasierten Systemen. Bei der Einrichtung handelt es sich um ein Wasserkreislaufsystem.Wenn Lecks auftreten, kann Wasser das Mikroskop beschädigen. Daher ist es vor der Annahme unseres Protokolls wichtig, sicherzustellen, dass das System undicht ist. Unser Protokoll erfordert die Montage der Glasprobe auf einer Temperaturstufe.Während das Manuskript das Montageverfahren beschreibt, fehlt es ihm an mechanischen Feinheiten wie der Sicherung der Probe auf der Bühne. Die Demonstration des Verfahrens werden Teagan Bate, Edward Jarvis und Megan Varney sein. Teagan und Edward sind Doktoranden, und Megan ist Studentin eines Labors.Zur Herstellung von Aktivenflüssigkeiten in einem Eppendorfer Röhrchen mischen Sie 16 Punkt sieben Mikroliter mit acht Milligramm pro Milliliter Mikrotubuli mit sechs Punkt sieben Mikroliter neines Punkt simoligen Kinesin-Motorcluster und einem Punkt einen Mikroliter 500 Millimolar DTT in hochsalzigen M2B. Bündeln Sie Mikrotubuli, indem Sie 11 Punkt vier Mikroliter mit sieben Gewichtsgewicht Polyethylenglykol hinzufügen. Aktivieren Sie dann Kinesinmotoren, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter von 50 Millimolar ATP hinzufügen.Halten Sie die ATP-Konzentrationen aufrecht, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter Pyruvatkinase/Laktat-Dehydrogenase hinzufügen und 13 Punkt drei Mikroliter 200 Millimolarphosphenolpyruvat. Reduzieren Sie den Photobleicheffekt, indem Sie 10 Mikroliter 20 Millimolar Trolox, einen Punkt ein Mikroliter von drei Punkt fünf Milligramm pro Milliliter Katalase, einen Punkt ein Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Glukoseoxidase und einen Punkt ein Mikroliter 300 Milligramm pro Milliliter Glukose hinzufügen. Verfolgen Sie die Bewegung der Flüssigkeit, indem Sie einen Punkt sechs Mikroliter Nullpunkt Null zwei fünf Prozent Volumen pro Volumen Tracer Partikel hinzufügen.Fügen Sie Hochsalz-M2B hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen. Als nächstes spülen Sie einen polyacrylamidbeschichteten Glasschlitten und decken Sie einen Gleit mit DI-Wasser ab. Trocknen Sie die Gläser mit Druckluft.Legen Sie die Gläser auf eine saubere, flache Oberfläche. Schneiden Sie einen drei Millimeter breiten Kanal in die Wachsfolie. Die Gesamtbreite ist die gleiche Breite wie die Glasabdeckung rutschen bei 20 Millimetern.Legen Sie das Wachs zwischen den Schlitten und den Deckelschlupf ein, um einen Durchflusszellkanal für Flüssigkeit zu bilden. Das Glas an der Wachsfolie anbringen, indem Sie den Glaswachskomplex auf eine 80 Grad Celsius heiße Platte legen, um das Wachs zu schmelzen. Während des Schmelzens den Deckel vorsichtig mit einer Pipettenspitze schieben, um den Wachsfilm gleichmäßig an den Glasoberflächen zu befestigen.Nach der Haftung den Glaskomplex auf Raumtemperatur abkühlen. Die vorbereiteten Aktivflüssigkeiten mit der Pipettenspitze in einem Winkel von der Kanalöffnung und in Kontakt mit der Glasschiebefläche in den Strömungskanal laden. Versiegeln Sie den Kanal mit UV-Kleber.Legen Sie nach dem Aufbau einer Temperaturregelung die aktive Flüssigkeitsprobe auf die Saphiroberfläche, wobei die Schiebeseite die Oberfläche ankortiert. Sichern Sie die Glasfolie mit Papierband. Befestigen Sie den ThermoSensor mit Kupferband an der Deckbelegoberfläche.Um das Setup auf einer Mikroskopbühne zu montieren, mit dem Deckel-Rutschen in Richtung der Ziele, sichern Sie das Setup mit Mikroskop-Bühnennadelklemmen. Schalten Sie den Temperaturregler und die Fischtankpumpe ein. Folgen Sie der Herstelleranleitung, um die Zieltemperatur festzulegen.Aktivieren Sie die Temperaturregelung. Und zeichnen Sie ThermoSensor-Temperaturdaten auf. Stellen Sie die Probe mit einem konstanten Zeitintervall auf einer fluoreszierenden Mikroskopie dar, die mit einem GFP-Filterwürfel ausgestattet ist, um die Alexa 488-markierten Tracerpartikel im aktiven Mix zu überwachen.Passen Sie das Zeitintervall an, damit die Tracerverschiebung zwischen Frames innerhalb von neun Pixeln liegen kann. Für bildgebende Tracer, die sich mit 10 Mikrometern pro Sekunde bewegen und ein vierfaches Ziel verwenden, wird empfohlen, das Zeitintervall ein bis fünf Sekunden zu betragen. Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien, benennen Sie die Dateien basierend auf der Framenummer, und speichern Sie sie in einem separaten Ordner.Für diese kinesingetriebenen Mikrotubuli-basierten Aktivenflüssigkeiten wurde die Temperatur bei 10, 20, 30 und 40 Grad Celsius gesteuert. Die Temperaturschwankungen lagen vier Stunden lang innerhalb von Nullpunkt eins bis null Punkt drei Grad Celsius und zeigten die Stabilität und Zuverlässigkeit dieses Temperaturregelungs-Setups. Die Tracer wurden alle zwei Sekunden abgebildet, was die sequenziellen Bilder zur Verfolgung von Tracer-Trajektorien ermöglichten.Die mittleren Geschwindigkeiten, die bei 20 bis 36 Grad Celsius gemessen wurden, schienen bei null bis zwei Stunden nahezu zeitunabhängig zu sein. Bei 10 und 40 Grad Celsius verfielen die mittleren Geschwindigkeiten schnell, verursacht durch Mikrotubuli-Depolymerisation unter 16 Grad Celsius und die Kinesin-Cluster über 36 Grad Celsius. Wenn sich die Systemtemperaturen alle 30 Minuten zwischen 20 und 30 Grad Celsius abwechselten, beschleunigten und verlangsamten sich die mittleren Geschwindigkeiten der aktiven Flüssigkeiten nicht nur entsprechend, sondern reagierten auch auf den Temperaturwechsel innerhalb von 10 Sekunden.Aktive Flüssigkeiten beginnen zu fehlamwerden, wenn sie unter 16 abgekühlt oder über 36 Grad erhitzt werden. Stellen Sie also beim Bearbeiten des Temperaturreglers sicher, dass die Temperatur zwischen 16 und 36 Grad liegt. Die Fähigkeit, aktive Flüssigkeit lokal zu optimieren, ermöglicht die Steuerung der Fluidleistung, wie z. B. die Lieferung von Ladungen von Punkt A nach Punkt B oder die Entwicklung eines Mikrofluiditätsgeräts, das kein physikalisches Ventil erfordert.Das Acrylamid, das zur Beschichtung von Glaswaren verwendet wird, ist ein Neurotoxin, das durch die Haut absorbieren kann. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstungwie Handschuhe, Labormäntel und Schutzbrillen, um das Risiko zu minimieren.

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