Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

פלאממיד K401-בH6-במק הייתה מתנה מדוקטור זוונמיר דוכולינ. מחקר זה נתמך על ידי קרן ההפעלה של ד ר קון-טה וו במכון הפוליטכני של ווסטר. אנו מודים לד ר זוונמיר דויד עבור הפרוטוקולים לטיהור ולטובולין תוויות ולסנתז נוזלים פעילים. אנו אסירי תודה לד ר מארק ריגילה על המומחיות שלו בביטוי חלבונים וטיהור. אנו מודים לד ר ויליאם בנימין רוג'ר על שעזר לנו בבניית הבמה הנשלטת על-ידי טמפרטורה. אנו מכירים את ברנדייס MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) לשימוש במתקן החומרים הביולוגיים (BMF). אנו מכירים את האגודה המלכותית לכימיה על התאמת הנתונים מ Bate ואח '. על חומר רך33.

1. הכנת MTs
התראה: בשלב זה אנו מטהרו את הטובולים מרקמת מוח של שור. המוח של שור עלול לגרום מחלה של הגרסה Creutzfeldt-יאקוב (vCJD)35. לכן יש לאסוף את החומרים הקשורים לפסולת המוח והפתרונות הנלווים, הבקבוקים והפיפטה בשקית biowaste ולהיפטר מפסולת ביולוגית בהתאם לכללי המוסד.
<ol><li>לטה...

שליטה על החומר הפעיל באתרו פותח את הדלת כדי לביים ארגון עצמי של חומר פעיל4,5,24,28,54. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש בטמפרטורה כדי לשלוט kinesin מונחה, MT מבוססי נוזלים פעילים באתרו, מבוסס על המאפיין ...

חומר פעיל מובחנים מחומר פסיבי קונבנציונאלי בשל יכולתה להמיר אנרגיה כימית לעבודה מכנית. חומר שבעל יכולת כזו יכול להיות מורכב מגופים חיים או שאינם חיים, כגון חיידקים, חרקים, colloids, דגנים, וחוטי ציטולדים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. הישויות החומריות האלה. מאינטראקציה עם השכנים שלהם בקנה מידה גדול יותר, הם מסדרים את עצמם לתוך או מערבולות כמו הסוערת (מערבולת פעילה) או חומר זורם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. הבנה של ארגון עצמי של חומר פעיל הובילה ליישומים שונים במעבורות מולקולריות, במכשירים אופטיים ובחישוב מקבילי21,22,23. כדי להביא את היישומים לרמה הבאה יש צורך בשליטה מעבר לארגון העצמי. לדוגמה, פאלאצ'י ואח ' פיתח קולואיד ממטיט שהיה ממונע עצמית רק כאשר הוא נחשף לאור כחול בשליטה ידנית, מה שהוביל להופעת קריסטלים חיים24. מורין ואח ' הקימה את השליטה בגלגול הcolloids של קוויק באמצעות שדה חשמלי חיצוני, והתוצאה היא שנוהרים לכאן בערוץ מסלול המרוצים, כמו25. עבודות קודמות אלה מדגימות את התפקיד של השליטה המקומית ביישומים ומקדמות את בסיס הידע של החומר הפעיל.
במאמר זה, אנו מתמקדים ישור של kinesin מונחה, מיקרוטוכדורית (MT) מבוססי נוזלים פעילים תלת-ממד. הנוזלים מורכבים משלושה מרכיבים עיקריים: MTs, מנועים מולקולריים ומתכלים. מרוקן לגרום כוח מחסור לצרור MTs, אשר מאוחר יותר מגשר על ידי אשכולות מנוע. המנועים האלה הולכים. לאורך הקצה החיובי כאשר זוג מגשר מ, המנועים המקבילים מסתובבים בכיוונים מנוגדים. עם זאת, המנועים מאוגדים באשכול ואינם יכולים להתפרק, ולכן הם בשיתוף זוגות בנפרד של MTs (הזזה בין פילמנט, איור 1א). אלה הדינמיקה הזזה להצטבר, גרימת צרורות של MTsto להאריך עד להגיע אי-יציבות הקריסה שלהם נקודה ושבור (extensile צרורות, איור 1B)26. הצרורות השבורים מופרים על ידי כוח המחסור, המשתרע לאחר מכן, והדינמיקה חוזרת. במהלך תהליך הדינמיקה החוזרת, תנועות הצרור מעוררות את הנוזל הסמוך, גורם לזרמים שניתן לדמיין באמצעות מטים מיקרון בקנה מידה (איור 1ג). סאנצ'ס ואח ' והנקין אל. אפיינו את מהירויות המשמעות של המשדרים, מציאת כי המהירויות היו שונות על ידי שינוי ריכוזי אדנוזין טריפוספט (ATP), מרוקן, אשכולות מנוע, ו MTs19,27. עם זאת, היכולת הזאת קיימת רק לפני סינתזה נוזל פעיל. לאחר הסינתזה, היכולת הייתה לאבד והנוזלים המאורגנים בדרכם. כדי לשלוט על פעילות הנוזל הפעיל לאחר סינתזה, Ross.et al. דיווחו על שיטה באמצעות הפעלת האור המופעל של חלבונים מוטוריים, המאפשר פעילות נוזלים להיות מכוון ולכבות באמצעות אור28. בעוד שבקרת האור נוחה במונחים של הפעלת הנוזלים באופן מקומי, השיטה מחייבת לעצב מראש את המבנים של החלבונים המוטוריים, יחד עם שינוי הנתיבים האופטיים במיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים שיטה קלה לשימוש עבור שליטה מקומית זורם נוזלים ללא שינוי מיקרוסקופ תוך שמירה על מבנה המנוע ללא פגע.
השיטה שלנו לכוונון מקומי זרימה נוזל פעיל מבוסס על חוק arrhenius כי התגובה kinesin-MT כבר דווח להגדיל עם טמפרטורה29,30,31,32. מחקרים קודמים שלנו הראו כי התלות בטמפרטורה של מהירות ממוצע של זרימת נוזל פעיל עקב משוואת Arrhenius: v = exp (-EA/RT), כאשר הוא גורם טרום מעריכי , R הוא קבוע הגז , Ea היא אנרגיית ההפעלה, ו T היא טמפרטורת המערכת33. לכן, פעילות הנוזלים רגישה לסביבת הטמפרטורה, וטמפרטורת המערכת צריכה להיות עקבית כדי לייצב את הביצועים המוטוריים, וכתוצאה מכך מהירות זרימת הנוזלים34. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בתלות הטמפרטורה של המנוע כדי לכוונן ברציפות את מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים על-ידי התאמת טמפרטורת המערכת. אנו גם להדגים את ההכנה של דגימת נוזל פעיל, ואחריו לעלות את המדגם על הבמה מיקרוסקופ אשר הטמפרטורה נשלטת באמצעות תוכנת מחשב. הגדלת הטמפרטורה מ -16 ° c עד 36 ° c מאיץ את מהירויות הזרימה הממוצע בין 4 ל-8 μm/s. בנוסף, יכולת התנועה הפיכה: הגדלה והקטנה של הטמפרטורה ברצף מאיצה ומאטה את הזרימה. השיטה שהוראתה מתאימה למגוון רחב של מערכות בהן התגובות העיקריות מצייתות לחוק ארניוס, כגון שיטת הר הדאייה29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

אנו מציגים שיטה לשימוש בטמפרטורה כדי לכוונן את מהירויות הזרימה של הנוזלים הפעילים, תלת-ממדיים המבוססים על מיקרו-מימדי (3D). שיטה זו מאפשרת כוונון המהירויות באתרו ללא צורך לייצר דגימות חדשות כדי להגיע למהירויות רצויות שונות. כמו-כן, שיטה זו מאפשרת שליטה דינמית במהירות. רכיבה על הטמפרטורה מובילה את הנוזלים לזרום מהר ואיטי, מדי פעם. הישור הזאת מבוססת על המאפיין ארניוס של התגובה המיקרוכימית, הממחיש טווח מהירות מבוקר של זרימה של 4 – 8 μm/s. השיטה המוצגת תפתח את הדלת לעיצוב של התקנים microflu, היכן שקצבי הזרימה בערוץ מסוגלים להיות מקומיים ללא צורך בשסתום.

הכנת מונחה-בסיס, MT מבוססי נוזלים פעילים מחייב הן קינזין ו MTs. MTs היו פולימנים מן הטובולים שכותרתו (שלבים 1.3 ו 1.4) כי היו מטוהרים מן המוח שור (שלב 1.1, איור 2א), ואחריו מיחזור כדי לשפר את טוהר (שלב 1.2, איור 2ב). החלבונים המוטוריים של קינסין הביעו ביטו?...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בטמפרטורה כדי לשלוט על מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים תלת ממדיים. היתרון של שיטה זו לא רק מאפשר להסדיר מהירויות זרימה באתרו, אלא גם מאפשר בקרה דינמית, כגון מהירויות זרימה מעת לעת כוונון מעלה ומתחת.

שליטה במהירויות זרימה של נוזלים פעילים תלת-ממדיים מבוססי מיקרוכדורית באמצעות טמפרטורה

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

חומר פעיל שימש ביישומים שונים כמו צללים מולקולריים. כדי להביא את היישום לשלב הבא, אנחנו צריכים לפתח את היכולת לשלוט בעניין הפעיל באופן מקומי. אנו מספקים שיטה קלה לשימוש שאינו דורש שינוי של הנוזל הפעיל.גם לא הצורך לשנות את הנתיב האופטי של מיקרוסקופ כדי להשיג את השליטה המקומית של הנוזל הפעיל. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות שבהן התגובות העיקריות לציית לחוק שגוי כגון microtubule גלישה assay או מערכות מבוססות אנזים. ההתקנה כרוכה במערכת זרימת מים.אם מתרחשות דליפות, מים עלולים לגרום נזק למיקרוסקופ. לכן, לפני אימוץ הפרוטוקול שלנו, חשוב לוודא שהמערכת דולפת בחינם. הפרוטוקול שלנו דורש הרכבה של דגימת הזכוכית על במה בטמפרטורה.בעוד שכתב היד מתאר את הליך ההרכבה, הוא חסר דקויות מכניות כגון אבטחת המדגם לבמה. הדגמת ההליך תהיה טיגן בייט, אדוארד ג'רוויס ומייגן וארני. טיגן ואדוארד הם סטודנטים לתארים מתקדמים, ומייגן היא סטודנטית לתואר ראשון ממעבדה.כדי להכין נוזלים פעילים בצינור Eppendorf, לערבב 16 נקודה שבעה microliters של שמונה מיליגרם לכל microtubules מיליליטר עם שש נקודה שבעה microliters של נקודה אחת שמונה אשכולות מנוע kinesin micromolar, ונקודה אחת microliters אחד של 500 מילימולאר DTT ב M2B מלח גבוה. צרור microtubules על ידי הוספת 11 נקודה ארבעה microliters של שבעה אחוז משקל לפי משקל פוליאתילן גליקול. לאחר מכן להפעיל מנועי kinesin על ידי הוספת שתי נקודות שמונה microliters של 50 מילימולר ATP.לשמור על ריכוזי ATP על ידי הוספת שתי נקודות שמונה microliters של המניה פירובט קינאז / לקטט דהידרוגנאז, ו 13 נקודה שלושה microliters של 200 מילימול פוסנול פירובט. להפחית את אפקט הלבנת התמונה על ידי הוספת 10 microliters של 20 מילימולאר Trolox, נקודה אחת microliters של שלוש נקודה חמישה מיליגרם לקטלאז מיליליטר, נקודה אחת microliters של 20 מיליגרם לכל oxidase גלוקוז מיליליטר, ונקודה אחת microliters של 300 מיליגרם לכל גלוקוז מיליליטר. עקוב אחר התנועה של הנוזל על ידי הוספת נקודה אחת שישה microliters של אפס נקודה אפס שני חמישה אחוז נפח על ידי חלקיקי מעקב נפח.הוסף M2B מלח גבוה כדי להשיג נפח כולל של 100 microliters. לאחר מכן, יש לשטוף מגלשת זכוכית מצופה פוליאקרילמיד ולכסות במים DI. יבש את המשקפיים באוויר בלחץ.מניחים את המשקפיים על משטח נקי ושטוח. חותכים ערוץ ברוחב 3 מ"מ בסרט השעווה. הרוחב הכולל הוא באותו רוחב כמו החלקת כיסוי הזכוכית ב 20 מילימטרים.הוסף את השעווה בין השקופית לשקופית המכסה כדי ליצור ערוץ תא זרימה לנוזל. לדבוק בזכוכית לסרט שעווה על ידי הנחת קומפלקס שעווה זכוכית על צלחת חמה 80 מעלות צלזיוס כדי להמיס את השעווה. במהלך ההיתוך, לחץ על החלקת העטיפה בעדינות עם קצה פיפטה כדי לדבוק באופן אחיד את סרט השעווה על משטחי הזכוכית.לאחר ההיתוך, מקררים את קומפלקס הזכוכית לטמפרטורת החדר. טען מיד את הנוזלים הפעילים המוכנים לערוץ הזרימה עם קצה פיפטה בזווית הרחק מפתיחת הערוץ וב במגע עם משטח החלקת הזכוכית. לאטום את התעלה עם דבק UV.לאחר בניית הגדרת בקרת טמפרטורה, מקם את דגימת הנוזל הפעילה על משטח הספיר כאשר צד השקופית יוצר קשר עם פני השטח. אבטח את מגלשת הזכוכית עם סרט נייר. באמצעות סרט נחושת, חבר את ThermoSensor למשטח החלקת הכיסוי.כדי לטעון את ההתקנה על שלב מיקרוסקופ, עם החלקת החלקת הכיסוי פונה לכיוון המטרות, לאבטח את ההתקנה עם מלחצי מחט שלב מיקרוסקופ. הפעל את בקר הטמפרטורה ומשאבת מיכלי הדגים. בצע את מדריך היצרנים כדי להגדיר את טמפרטורת היעד.אפשר בקרת טמפרטורה. ותקליט את נתוני הטמפרטורה של תרמו-סנסור. תמונה המדגם עם מרווח זמן קבוע על מיקרוסקופיה פלואורסצנטי מצויד קוביית מסנן GFP כדי לפקח על חלקיקי מעקב Alexa 488 שכותרתו בתמהיל הפעיל.התאימו את מרווח הזמן כדי לאפשר לתזוזת המעקב בין המסגרות להיות בטווח של תשעה פיקסלים. עבור עוקבי הדמיה הנעים במהירות של 10 מיקרומטרים לשנייה, באמצעות מטרה של ארבע פעמים, מרווח הזמן מומלץ להיות דקה עד חמש שניות. שמור את התמונות כקבצי TIF, תן שם לקבצים בהתבסס על מספר המסגרת ואחסן אותם בתיקיה נפרדת.עבור קינסין זה מונחה microtubule נוזלים פעילים, הטמפרטורה נשלטה ב 10, 20, 30, ו 40 מעלות צלזיוס. התנודות בטמפרטורה היו בתוך נקודת האפס אחת עד אפס נקודה שלוש מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות המדגים את היציבות ואת האמינות של הגדרת בקרת טמפרטורה זו. מכשירי המעקב נתגמו כל שתי שניות, מה שהתמונות הרציף אפשרו למעקב אחר מסלולי מעקב.המהירויות הממוצעות שנמדדו ב-20 עד 36 מעלות צלזיוס, נראו כמעט עצמאיות בזמן באפס עד שעתיים. איפה כמו 10 ו 40 מעלות צלזיוס, המהירויות הממוצעות נרקבו במהירות הנגרמת על ידי depolymerization microtubule מתחת 16 מעלות צלזיוס ואת אשכולות kinesin תקלה מעל 36 מעלות צלזיוס בהתאמה. כאשר טמפרטורות המערכת התחלפו בין 20 ל -30 מעלות צלזיוס כל 30 דקות, המהירויות הממוצעות של הנוזלים הפעילים לא רק להאיץ ולהאט בהתאם, אבל הם גם הגיבו לשינוי הטמפרטורה בתוך 10 שניות.נוזלים פעילים מתחילים תקלה, כאשר מקורר מתחת 16 או מחומם מעל 36 מעלות. לכן, בעת מניפולציה בקר הטמפרטורה, להבטיח את הטמפרטורה היא בין 16 ל 36 מעלות. היכולת לכוונן נוזל פעיל באופן מקומי, מאפשרת לכוון את כוח הנוזלים כגון אספקת מטענים מנקודה A לנקודה B או פיתוח התקן microfluidity שאינו דורש שסתום פיזי.האקרילמיד המשמש לציפוי כלי זכוכית הוא רעלן עצבי אשר יכול לספוג דרך העור. ללבוש ציוד מגן נאות כגון כפפות, חלוקי מעבדה ומ המשקפי בטיחות כדי למזער את הסיכון.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

שליטה על גודל, צורה ויציבות של פולימרים מולקולריים במים

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

קביעת שדות זרימה 3D באמצעות מצלמה מרובה אור תחום הדמיה

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

ברזולוציה גבוהה, במהירות גבוהה, הדמיה וידאו תלת ממדית עם טכניקות הקרנה הדיגיטלי פרינג&#39;

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

מדידה ניסיונית של מהירות יישוב של חלקיקים כדוריים בנוזלים ויסקואלסטיים לא מכופתרים ומרותקים על בסיס חומרים פעילי שטח

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

מדידת חומר מיקרו תחת זרם באמצעות 1-2 מטוס זרימה קטן זווית ניוטרון פיזור

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

ייצור חללים ננומטריים אחידים באמצעות מליטה וופל ישיר סיליקון

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

טכניקת הדמיה מהירה ללמוד טיפת השפעת דינמיקה של נוזלים ללא הניוטונית

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

כתיבה ואפיון טמפרטורה הנמוכה של ננו Oxide

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

חזותי Hyporheic לזרום דרך Bedforms שימוש ניסויי דיי וסימולציה

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

אפיון מלא סט חומר קבועים תלות בטמפרטורה שלהם עבור חומרים פייזו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אולטראסאונד

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...