Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 è stato un dono del Dr. Svonimir Dogic. Questa ricerca è stata sostenuta dal fondo start-up del Dr. Kun-Ta Wu nel Worcester Polytechnic Institute. Ringraziamo il Dr. vonimir Dogic per i protocolli per purificare ed etichettare la tubulina e per sintetizzare i fluidi attivi. Siamo grati al Dr. Marc Ridilla per la sua esperienza nell'espressione e purificazione delle proteine. Ringraziamo il dottor William Benjamin Roger per averci aiutato a costruire il palco a temperatura controllata. Riconosciamo Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) per l'uso dello strumento dei materiali biologici (BMF). Riconosciamo la Royal Society of Chemistry per l'adattamento delle figure di Bate et al. su Soft Matter33.

1. Preparazione delle MT
AVVISO: In questo passaggio purifichiamo le tubuline dal tessuto cerebrale bovino. Cervello bovino può causare variante malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Pertanto, i rifiuti cerebrali e le relative soluzioni, bottiglie e punte di pipette dovrebbero essere raccolti in un sacchetto di rifiuti organici e smaltiti come rifiuti biopericolosi secondo le regole dell'istituzione.
<ol><li>Purificare le tubuline dal cervello bovino (modificato da...

Il controllo della materia attiva in situ apre la porta all'auto-organizzazione diretta della materia attiva4,5,24,28,54. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo della temperatura per controllare i fluidi attivi guidati dalla chinesina, basati su MT in situ, in base alla caratteristica di Arrhenius del sistema29<sup...

La materia attiva è differenziata dalla materia passiva convenzionale a causa della sua capacità di convertire l'energia chimica in lavoro meccanico. Un materiale che possiede tale capacità può consistere in entità viventi o non viventi come batteri, insetti, colloidi, cereali e filamenti citoscheletrici1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste entità materiali interagiscono con i rispettivi vicini. Su scala più ampia, si auto-organizzano in vortici turbolenti (turbolenza attiva) o flussi di materiale11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensione dell'auto-organizzazione della materia attiva ha portato a varie applicazioni in navette molecolari, dispositivi ottici e calcolo parallelo21,22,23. Per portare le applicazioni al livello successivo richiede un controllo al di là dell'auto-organizzazione. Ad esempio, Palacci e altri hanno sviluppato un colloide incapsulato di ematite che si è autopropulso solo se esposto alla luce blu controllata manualmente, che ha portato alla comparsa di cristalli viventi24. Morin ealtri stabilì il controllo dei colloidi Quincke rotolanti utilizzando un campo elettrico esterno regolabile, con conseguente affollamento colloidale in un canale 25 simile a uncircuito. Questi lavori precedenti dimostrano il ruolo del controllo locale nelle applicazioni e migliorano la base di conoscenze della materia attiva.
In questo articolo, ci concentriamo sulla controllabilità dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli (MT) basati sulla kinesina. I fluidi sono costituiti da tre componenti principali: MT, motori molecolari di chinasina e impoveritori. Gli esaurienti inducono una forza di esaurimento per impacchettare le MT, che vengono successivamente colmeggiate da cluster motori. Questi motori camminano lungo l'MTsverso l'estremità più. Quando una coppia di MTsis pontianti antiparallela, i motori corrispondenti camminano in direzioni opposte. Tuttavia, i motori sono legati in un cluster e non sono in grado di camminare a parte, in modo da scivolare in modo cooperativo coppie di MT (interfilamento scorrevole, Figura 1A). Queste dinamiche scorrevoli si accumulano, causando fasci di MT per estendere fino a raggiungere il loro punto di instabilità deformazione e rottura (fasci estensivi, Figura 1B)26. I fasci rotti sono anneriti dalla forza di esaurimento, che successivamente si estende di nuovo, e le dinamiche si ripetono. Durante il processo della dinamica di ripetizione, i movimenti del fascio mescolano il liquido vicino, inducendo flussi che possono essere visualizzati doping con traccianti in scala micron(Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. hanno caratterizzato le velocità medi dei traccianti, scoprendo che le velocità erano regolabili variando le concentrazioni di adenosina tripfofoso (ATP), impoverimenti, gruppi motori, e MT19,27. Tuttavia, tale sintunabilità esisteva solo prima della sintesi del fluido attivo. Dopo la sintesi, la sintonificabilità è stata persa e i fluidi si sono auto-organizzati a modo loro. Per controllare l'attività dei fluidi attivi dopo la sintesi, Ross.et al. ha riportato un metodo utilizzando la dimerizzazione attivata dalla luce delle proteine motorie, consentendo di attivare e disattivare l'attività del fluido utilizzando la luce28. Mentre il controllo della luce è conveniente in termini di attivazione locale dei fluidi, il metodo richiede di riprogettare le strutture delle proteine motorie, insieme a modificare i percorsi ottici in un microscopio. Qui, forniamo un metodo facile da usare per controllare localmente i flussi fluidi senza modifica del microscopio, mantenendo intatta la struttura motoria.
Il nostro metodo di sintonizzazione locale del flusso di fluido attivo si basa sulla legge Arrhenius perché la reazione kinesin-MT è stata segnalata per aumentare con temperatura29,30,31,32. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che la dipendenza dalla temperatura della velocità media di un flusso di fluido attivo ha seguito l'equazione di Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), dove A è un fattore pre-esponenziale, R è la costante di gas, Ea è l'energia di attivazione e T è la temperatura del sistema33. Pertanto, l'attività del fluido è sensibile all'ambiente di temperatura e la temperatura del sistema deve essere costante per stabilizzare le prestazioni del motore e, di conseguenza, la velocità di flusso del fluido34. In questo articolo, dimostriamo l'uso della dipendenza dalla temperatura del motore per ottimizzare continuamente le velocità di flusso dei fluidi attivi regolando la temperatura del sistema. Dimostriamo anche la preparazione di un campione di fluido attivo, seguito dal montaggio del campione in una fase del microscopio la cui temperatura è controllata tramite software per computer. L'aumento della temperatura da 16 a 36 gradi centigradi accelera la velocità media di flusso da 4 a 8 m/s. Inoltre, la sintonabilità è reversibile: aumentando ripetutamente e diminuendo la temperatura in sequenza accelera e decelera il flusso. Il metodo dimostrato è applicabile a una vasta gamma di sistemi in cui le principali reazioni obbediscono alla legge Arrhenius, come l'analisi MT che scivola29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Presentiamo un metodo per utilizzare la temperatura per ottimizzare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali (3D) basati sulla kinesina e basati su microtubuli. Questo metodo consente di regolare le velocità in situ senza la necessità di produrre nuovi campioni per raggiungere diverse velocità desiderate. Inoltre, questo metodo consente il controllo dinamico della velocità. In bicicletta la temperatura porta i fluidi a fluire veloce e lento, periodicamente. Questa controllabilità si basa sulla caratteristica di Arrhenius della reazione kinesina-microtubule, dimostrando un intervallo di velocità di flusso medio controllato di 4-8 sm/s. Il metodo presentato aprirà la porta alla progettazione di dispositivi microfluidici in cui le portate nel canale sono localmente regolabili senza la necessità di una valvola.

La preparazione dei fluidi attivi basati sulla kinesina e basati su MT richiede sia kinesin che MT. Le MT sono state polimerizzate dalle tubuline etichettate (passaggi 1.3 e 1.4) che sono state purificate dai cervelli bovini (passaggio 1.1, Figura 2A), seguiti dal riciclaggio per migliorare la purezza (passaggio 1.2, Figura 2B). Le proteine motorie della cinesia sono state espresse e purificate da E. coli (passaggi 2.1 ...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la temperatura per controllare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali. Il vantaggio di questo metodo non solo consente di regolare le velocità di flusso in situ, ma consente anche il controllo dinamico, ad esempio l'ottimizzazione periodica delle velocità di flusso verso l'alto e verso il basso.

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

La materia attiva è stata usata in varie applicazioni come le ombre molecolari. Per portare l'applicazione al livello successivo, dobbiamo sviluppare la capacità di controllare la materia attiva localmente. Forniamo un metodo facile da usare che non richiede la modifica del fluido attivo.Né la necessità di modificare il percorso ottico del microscopio per ottenere il controllo locale del fluido attivo. Il nostro metodo può essere applicato a una vasta gamma di sistemi in cui le reazioni principali obbediscono alla legge errata come il saggio di planata dei microtubuli o i sistemi basati sugli enzimi. La configurazione prevede un sistema di circolazione dell'acqua.In caso di perdite, l'acqua può danneggiare il microscopio. Pertanto, prima di adottare il nostro protocollo, è importante assicurarsi che il sistema sia privo di perdite. Il nostro protocollo richiede il montaggio del campione di vetro in una fase di temperatura.Mentre il manoscritto descrive la procedura di montaggio, manca di sottigliezze meccaniche come fissare il campione allo stadio. A dimostrare la procedura, saranno Teagan Bate, Edward Jarvis e Megan Varney. Teagan ed Edward sono studenti laureati, e Megan è uno studente universitario di un laboratorio.Per preparare fluidi attivi in un tubo di Eppendorf, mescolare 16 punti sette microlitri di otto milligrammi per microtubuli millilitro con sei punti sette microlitri di un punto otto micromolare chinasi cluster motore, e un punto uno microlitri di 500 millimolare DTT in M2B ad alto sale. Raggruppare i microtubuli aggiungendo 11 punti quattro microlitri del 7% di peso in polietilene glicole. Quindi attivare i motori a cinesinina aggiungendo due microlitri a otto punti di ATP da 50 millimolare.Mantenere le concentrazioni di ATP aggiungendo due microlitri a otto punti di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi a due punti e 13 punti tre microlitri di 200 millimolare fosfenolo piruvato. Ridurre l'effetto di sbiancamento fotografico aggiungendo 10 microlitri di Trolox millimolare, un punto uno microlitri di tre punti cinque milligrammi per millilitro catalasi, un punto un microlitri di 20 milligrammi per millilitro glucosio ossidasi e un punto un microlitri di 300 milligrammi per millilitro glucosio. Tracciate il movimento del fluido aggiungendo un punto sei microlitri di zero punto zero due cinque per cento di volume per particelle di tracciante di volume.Aggiungere M2B ad alto sale per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Successivamente, sciacquare uno scivolo di vetro rivestito in poliacrilammide e coprire lo scivolamento con acqua DI. Asciugare gli occhiali con aria pressurizzata.Posizionare gli occhiali su una superficie pulita e piatta. Tagliare un canale largo tre millimetri nel film di cera. La larghezza totale è della stessa larghezza del coperchio in vetro scivolare a 20 millimetri.Inserire la cera tra lo scivolo e lo slittamento del coperchio per formare un canale di cella di flusso per il fluido. Aderire al vetro al film di cera posizionando il complesso di cera di vetro su una piastra calda di 80 gradi Celsius per sciogliere la cera. Durante la fusione, premere il coperchio scivolare delicatamente con una punta di pipetta per aderire uniformemente al film di cera alle superfici di vetro.Dopo l'adesione, raffreddare il complesso di vetro a temperatura ambiente. Caricare prontamente i fluidi attivi preparati sul canale di flusso con la punta della pipetta ad angolo lontano dall'apertura del canale e a contatto con la superficie dello scivolo di vetro. Sigillare il canale con colla UV.Dopo aver costruito una configurazione di controllo della temperatura, posizionare il campione di fluido attivo sulla superficie dello zaffiro con il lato scorrevole che contatta la superficie. Fissare lo scivolo di vetro con nastro adesivo. Utilizzando nastro di rame, collegare thermosensor alla superficie di slittamento del coperchio.Per montare la configurazione su uno stadio di microscopio, con lo scivolo di scorrimento del coperchio rivolto verso gli obiettivi, fissare la configurazione con morsetti per aghi da palco al microscopio. Accendere il regolatore di temperatura e la pompa del serbatoio del pesce. Segui la guida dei produttori per impostare la temperatura target.Abilitare il controllo della temperatura. E registrare i dati sulla temperatura di ThermoSensor. Immagini il campione con un intervallo di tempo costante su una microscopia fluorescente dotata di un cubo filtrante GFP per monitorare le particelle di tracciante etichettate Alexa 488 nel mix attivo.Regola l'intervallo di tempo per consentire lo spostamento del tracciante tra i fotogrammi entro nove pixel. Per i traccianti di imaging che si muovono a 10 micrometri al secondo, utilizzando un obiettivo quattro volte superiore, si consiglia che l'intervallo di tempo sia da uno a cinque secondi. Salvare le immagini come file TIF, denominare i file in base al numero di fotogramma e archiviarli in una cartella separata.Per questi fluidi attivi basati su microtubuli guidati dalla cinesicina, la temperatura è stata controllata a 10, 20, 30 e 40 gradi Celsius. La fluttuazione della temperatura è stata entro il punto zero da uno a zero punti tre gradi Celsius per quattro ore dimostrando la stabilità e l'affidabilità di questa configurazione di controllo della temperatura. I traccianti venivano immagini ogni due secondi, che le immagini sequenziali permettevano di tracciare le traiettorie del tracciante.Le velocità medie misurate da 20 a 36 gradi Celsius, sembravano essere quasi indipendenti dal tempo a zero o due ore. Dove a 10 e 40 gradi Celsius, le velocità medie sono decadte rapidamente a causa della depolimerizzazione dei microtubuli al di sotto dei 16 gradi Celsius e dei cluster di chiesina che non funzionano correttamente rispettivamente sopra i 36 gradi Celsius. Quando le temperature del sistema si alternavano tra i 20 e i 30 gradi Celsius ogni 30 minuti, le velocità medie dei fluidi attivi non solo acceleravano e decelerano di conseguenza, ma rispondevano anche al cambiamento di temperatura entro 10 secondi.I fluidi attivi iniziano a funzionare male, quando vengono raffreddati sotto i 16 o riscaldati sopra i 36 gradi. Quindi, quando si manipola il regolatore di temperatura, assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 16 e 36 gradi. La capacità di sintonizzare localmente il fluido attivo consente di dirigere la potenza del fluido come la consegna di carichi dal punto A al punto B o lo sviluppo di un dispositivo di microfluidità che non richiede una valvola fisica.L'acrilammide utilizzata per rivestire la vetreria è una neurotossina che può assorbire attraverso la pelle. Indossare dispositivi di protezione adeguati come guanti, cappotti da laboratorio e occhiali di sicurezza per ridurre al minimo i rischi.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Controllo della dimensione, forma e stabilità dei polimeri supramolecolari in acqua

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Ricerca

Ingegneria

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Determinazione campi di flusso 3D tramite multi-camera campo di luce Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Misurazione sperimentale della velocità di sedimentazione delle particelle sferiche in fluidi viscoelastici a base di tensioattivi non raffinati e confinati

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Misurare Materiale microstruttura Under flusso Utilizzo di 1-2 aereo Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Fabbricazione di cavità uniformi su nanoscala tramite silicon direct wafer bonding

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Scansione veloce per studiare goccia Impatto dinamica dei fluidi non newtoniani

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Scrittura e bassa temperatura Caratterizzazione di nanostrutture di ossido

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Visualizzare iporreico flusso Attraverso Bedforms Utilizzando Esperimenti Dye e Simulazione

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Caratterizzazione del set completo Materiale costanti ed i loro dipendenza dalla temperatura dei materiali piezoelettrici Utilizzando risonanza ultrasuoni Spectroscopy

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...