Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmider K401-BCCP-H6 var en gave fra Dr. Zvonimir Dogic. Denne forskningen ble støttet av Dr. kun-ta Wu ' s oppstart fondet i Worcester Polytechnic Institute. Vi takker Dr. Zvonimir Dogic for protokollene å rense og merke tubulin og å syntetisere aktive væsker. Vi er takknemlige for Dr. Marc Ridilla for sin ekspertise på protein uttrykk og rensing. Vi takker Dr. William Benjamin Roger for å hjelpe oss med å bygge den temperaturstyrte scenen. Vi erkjenner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) for bruk av biologiske materialer Facility (BMF). Vi erkjenner Royal Society of Chemistry for å tilpasse tallene fra Bate et al. på Soft Matter33.

1. utarbeidelse av MTs
FORSIKTIG: i dette trinnet renser vi tubulins fra storfe hjernevev. Storfe hjerne kan forårsake variant Creutzfeldt-Jakob sykdom (vCJD)35. Derfor bør hjernen avfall og relaterte løsninger, flasker og pipette tips samles i en Biowaste pose og kastes som biologisk farlige avfall i henhold til reglene i institusjonen.
<ol><li>Rens tubulins fra storfe hjernen (modifisert fra Castoldi et al.36).<ol>
<li>Transport ca 1,5 kg ...

Kontrollerende aktiv materie in situ åpner døren til regissert selvorganisering av aktiv materie4,5,24,28,54. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for bruk av temperatur for å kontrollere kinesin-drevne, MT-baserte aktive væsker in situ, basert på Arrhenius karakteristisk for systemet29,30</su...

Aktiv materie er differensiert fra konvensjonell passiv materie på grunn av sin evne til å konvertere kjemisk energi til mekanisk arbeid. Et materiale som besitter slik evne kan bestå av levende eller ikke-levende enheter som bakterier, insekter, Colloids, korn, og cytoskjelettkomponenter filamenter1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse materielle enhetene samhandle med sine naboer. I større skala, de selv-organisere enten turbulente-lignende virvlene (aktiv turbulens) eller materiale renn11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En forståelse av egen organisering av aktiv materie har ført til ulike anvendelser innen molekylær transport, optiske enheter og parallell beregning21,22,23. Å bringe søknader til neste nivå krever kontroll utover selv-organisasjon. For eksempel, utviklet Palacci et al. en hematitt-innkapslet kolloid som selvgående bare når de utsettes for manuelt kontrollert blått lys, noe som førte til fremveksten av levende krystaller24. Morin et al. etablerte kontroll av rullende Kvinke Colloids ved hjelp av en tunable ekstern elektrisk felt, noe som resulterer i kolloidalt flokker i en veddeløpsbane-lignende kanal25. Disse tidligere verkene demonstrerer rollen som lokal kontroll i applikasjoner og fremme kunnskapsbasen av aktiv materie.
I denne artikkelen fokuserer vi på kontrollerbarhet av kinesin-drevne, mikrotubulinettverket (MT)-baserte 3D aktive væsker. Væskene består av tre hovedkomponenter: MTs, kinesin molekylære motorer og depletants. Depletants induserer en trykk kraft for å pakke inn MTs, som senere blir Brokoblet av motor klynger. Disse motorene går langs MTstoward pluss enden. Når et par av bro MTsis antiparallel, den tilsvarende motorene går i motsatt retning. Men motorene er bundet i en klynge og er ikke i stand til å gå fra hverandre, slik at de samarbeider skyve hverandre par av MTs (interfilament glidende, figur 1a). Disse glidende dynamikk akkumuleres, forårsaker bunter av MTsto forlenge til nå sine knekking ustabilitet punkt og Break (extensile bunter, figur 1B)26. Den ødelagte bunter er glødet av nedbryting kraft, som senere strekker seg igjen, og dynamikken gjenta. Under prosessen med gjentatt dynamikk, bunt bevegelsene røre den nærliggende væsken, inducing flyter som kan visualisere ved doping med mikron-skala Bevegelsesuskarphet (figur 1C). Sanchez et al. og Henkin et al. har karakterisert den gjennomsnittlige hastighet på bevegelsesuskarphet, finne at hastighetene ble tunable ved å variere konsentrasjonen av adenosin trifosfat (ATP), depletants, motor klynger, og MTS19,27. Men slike justeringsevne eksisterte bare før aktiv væske syntese. Etter syntese var justeringsevne tapt, og væskene selv-organisert på sin egen måte. For å kontrollere aktiv væske aktivitet etter syntese, Ross.et al. rapporterte en metode ved hjelp av lys aktivert dimerization av motor proteiner, slik at væske aktivitet skal stilles på og av ved hjelp av lys28. Mens lys kontroll er praktisk i form av lokalt aktivere væsker, krever metoden omstrukturere strukturene av motor proteiner, sammen med å endre de optiske banene i et mikroskop. Her gir vi en lett-å-bruke metode for lokalt kontrollerende væske strømmer uten mikroskop modifisering samtidig holde motoren strukturen intakt.
Vår metode for lokalt tuning aktiv væske strømning er basert på Arrhenius loven fordi kinesin-Mt reaksjonen har blitt rapportert å øke med temperatur29,30,31,32. Våre tidligere studier viste at temperaturen avhengighet av gjennomsnittlig hastighet på en aktiv væske strømning fulgt Arrhenius ligningen: v = A exp (-EA/RT), hvor en er en pre-eksponentiell faktor, R er gassen konstant, EA er aktiviseringen energi, og T er system temperaturen33. Derfor er væske aktivitet følsom for temperatur miljøet, og system temperaturen må være konsistent for å stabilisere motorytelsen, og følgelig er væske strømningshastigheten34. I denne artikkelen viser vi bruken av motorens temperatur avhengighet for å kontinuerlig tune strømnings hastighetene til aktive væsker ved å justere system temperaturen. Vi viser også utarbeidelsen av en aktiv væske prøve, etterfulgt av montering av prøven på et mikroskop scene der temperaturen styres via dataprogramvare. Ved å øke temperaturen fra 16 ° c til 36 ° c økes gjennomsnittlig strømningshastighet fra 4 til 8 μm/s. i tillegg er justeringsevne reversibel: gjentatte ganger økende og synkende temperaturen sekvensielt akselererer og bremser flyten. Den viste metoden gjelder for et bredt spekter av systemer der de viktigste reaksjonene adlyder Arrhenius lov, for eksempel Mt gliding analysen29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Vi presenterer en metode for bruk av temperatur for å justere strømnings hastighetene til kinesin, mikrotubulinettverket tredimensjonale (3D) aktive væsker. Denne metoden gjør det mulig å stille inn hastighetene i situ uten å måtte produsere nye prøver for å nå forskjellige ønskede hastigheter. Videre muliggjør denne metoden dynamisk kontroll av hastighet. Sykling temperaturen fører væskene til å flyte raskt og sakte, med jevne mellomrom. Denne kontrollerbarhet er basert på Arrhenius karakteristisk for den kinesin-mikrotubulinettverket reaksjonen, som viser et kontrollert strømnings hastighetsområde på 4 – 8 μm/s. Den presenterte metoden vil åpne døren til utformingen av mikrovæskebasert enheter der strømningshastigheter i kanalen er lokalt tunable uten behov for en ventil.

Ved å klargjøre de kinesin, MT-baserte aktive væskene, kreves både kinesin og MTs. MTs ble polymerisert fra merket tubulins (trinn 1,3 og 1,4) som ble renset fra storfe hjerner (trinn 1,1, figur 2A), etterfulgt av resirkulering for å forbedre renhet (trinn 1,2, figur 2B). Kinesin motor proteiner ble uttrykt i og renset fra E. coli (trinn 2,1 og 2,2, figur 2B)<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Målet med denne protokollen er å bruke temperatur for å kontrollere strømningshastigheter av tredimensjonale aktive væsker. Fordelen med denne metoden gir ikke bare mulighet for regulering av strømningshastigheter i situ, men gir også dynamisk kontroll, som periodisk tuning strømningshastigheter opp og ned.

Kontrollere strømningshastigheter på Mikrotubulinettverket-basert 3D aktive væsker ved hjelp av temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktiv materie har blitt brukt i ulike applikasjoner som molekylære skygger. For å bringe søknaden til neste nivå, må vi utvikle evnen til å kontrollere den aktive saken lokalt. Vi tilbyr en brukervennlig metode som ikke krever modifisering av den aktive væsken.Heller ikke behovet for å endre den optiske banen til mikroskop for å oppnå lokal kontroll av den aktive væsken. Vår metode kan brukes på et bredt spekter av systemer hvor de viktigste reaksjonene adlyder den feilaktige loven som mikrotubulilidende analyse eller enzymbaserte systemer. Oppsettet innebærer et vannsirkulasjonssystem.Hvis det oppstår lekkasjer, kan vann skade mikroskopet. Derfor, før du vedtar vår protokoll, er det viktig å sikre at systemet er lekkasjefritt. Vår protokoll krever montering av glassprøven på et temperaturstadium.Mens manuskriptet beskriver monteringsprosedyren, mangler det mekaniske finesser som å sikre prøven til scenen. Demonstrere prosedyren, vil være Teagan Bate, Edward Jarvis, og Megan Varney. Teagan og Edward er graduate studenter, og Megan er en lavere student fra et laboratorium.For å forberede aktive væsker i et Eppendorf-rør, bland 16 punkt syv mikroliter på åtte milligram per milliliter mikrotubuli med seks punkt syv mikroliter på ett punkt åtte mikromolar kinesin motorklynger, og ett punkt en mikroliter på 500 millimolar DTT i høysalt M2B. Bunt mikrotubuli ved å legge til 11 punkt fire mikroliter på syv prosent vekt av vekt polyetylenglykol. Aktiver deretter kinesinmotorer ved å legge til to punkt åtte mikroliter på 50 millimolar ATP.Opprettholde ATP konsentrasjoner ved å legge to punkt åtte mikroliter av lager pyruvat kinase / laktat dehydrogenase, og 13 punkt tre mikroliter på 200 millimolar fosfenol pyruvat. Reduser fotobleking effekten ved å legge til 10 mikroliter på 20 millimolar Trolox, ett punkt ett mikroliter på tre punkt fem milligram per milliliter katalase, ett punkt ett mikroliter på 20 milliliter glukoseoksidase, og ett punkt en mikroliter på 300 milliliter glukose. Spor bevegelsen av væsken ved å legge til ett punkt seks mikroliter på null punkt null to fem prosent volum etter volum tracer partikler.Tilsett M2B med høyt salt for å oppnå et totalt volum på 100 mikroliter. Skyll deretter en polyakrylamidbelagt glasssklie og dekkslipp med DI-vann. Tørk brillene med trykkluft.Plasser brillene på en ren, flat overflate. Klipp en tre millimeter bred kanal i voksfilmen. Den totale bredden er samme bredde som glassdekselet glir på 20 millimeter.Sett inn voks mellom lysbildet og dekselet slip for å danne en flyt celle kanal for væske. Hold glasset til voksfilmen ved å plassere glassvokskomplekset på en 80 graders Celsius kokeplate for å smelte voksen. Under smeltingen trykker du forsiktig på dekselet med en pipettespiss for å jevnt feste voksfilmen til glassflatene.Etter vedheft, avkjøl glasskomplekset til romtemperatur. Last straks de forberedte aktive væskene til strømningskanalen med pipettespissen i en vinkel vekk fra kanalåpningen og i kontakt med glassglideoverflaten. Forsegle kanalen med UV-lim.Etter å ha bygget et temperaturkontrolloppsett, plasserer du den aktive væskeprøven på safiroverflaten med lysbildesiden som kommer i kontakt med overflaten. Fest glasslysbildet med papirtape. Bruk kobbertape til å feste ThermoSensor til dekksslippoverflaten.For å montere oppsettet på et mikroskopstadium, med dekselet skli vendt mot målene, fest oppsettet med mikroskopets trinn nålklemmer. Slå på temperaturregulatoren og fisketankpumpen. Følg produsentens veiledning for å stille inn måltemperaturen.Aktiver temperaturkontroll. Og registrere ThermoSensor temperaturdata. Bilde prøven med et konstant tidsintervall på en fluorescerende mikroskopi utstyrt med en GFP filterkube for å overvåke Alexa 488-merkede tracerpartikler i den aktive blandingen.Juster tidsintervallet slik at sporingsforskyvningen mellom rammer er innenfor ni piksler. For bildesporinger som beveger seg med 10 mikrometer per sekund, ved hjelp av et fire ganger mål, anbefales tidsintervallet å være ett til fem sekunder. Lagre bildene som TIF-filer, gi filene et navn basert på rammenummer, og lagre dem i en egen mappe.For denne kinesindrevne mikrotubulibaserte aktive væsker ble temperaturen kontrollert ved 10, 20, 30 og 40 grader Celsius. Temperatursvingninger var innenfor nullpunkt ett til null punkt tre grader Celsius i fire timer som viser stabiliteten og påliteligheten til dette temperaturkontrolloppsettet. Sporingsbildene ble avbildet annethvert sekund, som de sekvensielle bildene tillot for sporing av sporingsbaner.Gjennomsnittshastighetene målt ved 20 til 36 grader Celsius, syntes å være nesten tidsuavhengige på null til to timer. Hvor som ved 10 og 40 grader Celsius, forfallte gjennomsnittshastighetene raskt forårsaket av mikrotubul depolymerisering under 16 grader Celsius og kinesinklyngene som feiler over henholdsvis 36 grader Celsius. Når systemtemperaturene ble vekslet mellom 20 og 30 grader Celsius hvert 30.Aktive væsker begynner å svikte, når de avkjøles under 16 eller varmes opp over 36 grader. Så når du manipulerer temperaturregulatoren, sørg for at temperaturen er mellom 16 og 36 grader. Evnen til å justere aktiv væske lokalt, gjør det mulig å styre væskekraften som å levere laster fra punkt A til punkt B eller utvikle en mikrofluiditetsenhet som ikke krever en fysisk ventil.Akrylamidet som brukes til å belegge glass er et nevrotoksin som kan absorbere gjennom huden. Bruk riktig verneutstyr som hansker, laboratoriefrakker og vernebriller for å minimere risikoen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Kontrollere størrelse, form og stabilitet av supramolecular Polymers i Water

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Bestemme 3D strømningsfelt via Multi-kamera lysfeltet Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Eksperimentell måling av sedimenteringshastighet av sfæriske partikler i udefinerte og begrensede overflateaktive skjærfortynnende viskoelastiske væsker

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Måling Material Microstructure Under Flow Bruke 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Spredning

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Fabrikasjon av ensartede nanoskala hulrom via silisium direkte wafer binding

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Rask Imaging teknikken til å studere Drop Impact Dynamics of Non-Newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Skriving og Kulde Karakterisering av Oxide nanostrukturer

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Visualisering Hyporheic Flow Through Bedforms Bruke Dye Eksperimenter og simulering

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Karakterisering av komplett sett Materiale konstanter og temperaturen Avhengighet for piezoelektriske materialer Bruke Resonant Ultralyd Spectroscopy

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...