Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 foi um presente do Dr. Zvonimir Dogic. Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo start-up do Dr. Kun-Ta Wu no Worcester Polytechnic Institute. Agradecemos ao Dr. Zvonimir Dogic pelos protocolos para purificar e rotular a tubulina e sintetizar fluidos ativos. Somos gratos ao Dr. Marc Ridilla por sua experiência em expressão e purificação de proteínas. Agradecemos ao Dr. William Benjamin Roger por nos ajudar na construção do estágio de temperatura controlada. Reconhecemos Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) para uso da Unidade de Materiais Biológicos (BMF). Reconhecemos a Royal Society of Chemistry para adaptar os números de Bate et al. em Soft Matter33.

1. Preparação de MTs
ATENÇÃO: Nesta etapa, purificamos as tubulinas do tecido cerebral bovino. Cérebro bovino pode causar variante doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Portanto, os resíduos cerebrais e soluções relacionadas, garrafas e dicas de pipetas devem ser coletados em um saco de biolixo e descartados como resíduos bioperigosos de acordo com as regras da instituição.
<ol><li>Purify tubulins do cérebro bovino (modificado de Castoldi et al.<sup class...

Controlar a matéria ativa in situ abre a porta para a auto-organização direcionada da matéria ativa4,5,24,28,54. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o uso da temperatura para controlar os fluidos ativos in situ baseados em quinesina e MT, com base na característica arrhenius do sistema29,30,</s...

A matéria ativa é diferenciada da matéria passiva convencional devido à sua capacidade de converter energia química em trabalho mecânico. Um material que possui tal capacidade pode consistir em entidades vivas ou não vivas, como bactérias, insetos, coloides, grãos e filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,7,8,9,10. Essas entidades materiais interagem com seus vizinhos. Em maior escala, eles se auto-organizam em vórtices turbulentos (turbulência ativa) ou fluxos materiais11,12,13,14,15,16,18,19,20. Uma compreensão da auto-organização da matéria ativa levou a várias aplicações em ônibus moleculares, dispositivos ópticos e computação paralela21,22,23. Para trazer aplicativos para o próximo nível requer controle além da auto-organização. Por exemplo, Palacci et al. desenvolveram um coloide hematita encapsulado que se autopropelia apenas quando exposto à luz azul controlada manualmente, o que levou ao surgimento de cristais vivos24. Morin et al. estabeleceram o controle dos coloides quincke rolando usando um campo elétrico externo tunable, resultando em coloidal reunindo-se em uma pista de corrida como canal25. Esses trabalhos anteriores demonstram o papel do controle local nas aplicações e promovem a base de conhecimento da matéria ativa.
Neste artigo, nos concentramos na controlabilidade dos fluidos ativos 3D baseados em quinesina, microtubule (MT). Os fluidos consistem em três componentes principais: MTs, motores moleculares de cinese e depletantes. Os depletantes induzem uma força de esgotamento para agrupar as MTs, que mais tarde são superadas por aglomerados de motores. Estes motores andam ao longo do MTstoward a extremidade mais. Quando um par de MTsis ponte anti-paralelo, os motores correspondentes andar em direções opostas. No entanto, os motores estão ligados em um cluster e são incapazes de se afastar, então eles deslizam cooperativamente pares de MTs (deslizamento de interfilamento, Figura 1A). Estas dinâmicas deslizantes se acumulam, fazendo com que os feixes de MTsto se estendem até atingir seu ponto de instabilidade e quebra (pacotes extensile, Figura 1B)26. Os feixes quebrados são annealed pela força do esgotamento, que estende subseqüentemente outra vez, e a dinâmica repete. Durante o processo de dinâmica de repetição, os movimentos do feixe agitam o líquido próximo, induzindo fluxos que podem ser visualizados pelo doping com traçadores em escala de mícron (Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. caracterizaram as velocidades médias dos traçadores, descobrindo que as velocidades eram tunable variando as concentrações de triphosfato de adenosina (ATP), depletantes, clusters motores e MTs19,27. No entanto, essa tunabilidade existia apenas antes da síntese de fluidos ativos. Após a síntese, a tunability foi perdida, e os líquidos auto-organizados em sua própria maneira. Para controlar a atividade do fluido ativo após a síntese, Ross.et al. relatou um método usando a imersão ativada pela luz das proteínas motoras, permitindo que a atividade fluida fosse ajustada e desligasse usando a luz28. Enquanto o controle de luz é conveniente em termos de ativar localmente os fluidos, o método requer redesenhar as estruturas de proteínas motoras, juntamente com a modificação dos caminhos ópticos em um microscópio. Aqui, fornecemos um método fácil de usar para controlar localmente os fluxos de fluidos sem modificação do microscópio, mantendo a estrutura motora intacta.
Nosso método de ajuste local do fluxo de fluido ativo é baseado na lei Arrhenius porque a reação kinesin-MT tem sido relatado para aumentar com a temperatura29,30,31,32. Nossos estudos anteriores mostraram que a dependência de temperatura da velocidade média de um fluxo de fluido ativo seguiu a equação de Arrhenius: v = A exp (-Ea/RT), onde A é um fator pré-exponencial, R é a constante de gás, Ea é a energia de ativação, e T é a temperatura do sistema33. Portanto, a atividade fluida é sensível ao ambiente de temperatura, e a temperatura do sistema precisa ser consistente para estabilizar o desempenho do motor e, consequentemente, a velocidade de fluxo defluido34. Neste artigo, demonstramos o uso da dependência de temperatura do motor para ajustar continuamente as velocidades de fluxo de fluidos ativos, ajustando a temperatura do sistema. Também demonstramos a preparação de uma amostra de fluido ativo, seguida pela montagem da amostra em um estágio de microscópio cuja temperatura é controlada através de software de computador. Aumentar a temperatura de 16 °C para 36 °C acelera as velocidades médias de fluxo de 4 para 8 μm/s. Além disso, a tunabilidade é reversível: aumentar e diminuir repetidamente a temperatura acelera sequencialmente e desacelera o fluxo. O método demonstrado é aplicável a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei Arrhenius, como o ensaio de deslizamento mt29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Apresentamos um método para usar a temperatura para ajustar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais (3D) orientados por quineinas, à base de microtúbulos. Este método permite ajustar as velocidades in situ sem a necessidade de fabricar novas amostras para atingir diferentes velocidades desejadas. Além disso, este método permite o controle dinâmico da velocidade. Andar de bicicleta a temperatura leva os fluidos a fluir rápido e lento, periodicamente. Essa controlabilidade é baseada na característica de Arrhenius da reação kinesin-microtubule, demonstrando uma faixa de velocidade de fluxo média controlada de 4-8 μm/s. O método apresentado abrirá a porta para o projeto de dispositivos microfluídicos onde as taxas de fluxo no canal são localmente tunable sem a necessidade de uma válvula.

Preparar os fluidos ativos orientados por quinesinas e MT requer ciinina e MTs. As MTs foram polimerizadas de tubulins rotuladas (etapas 1.3 e 1.4) que foram purificadas dos cérebros bovinos (passo 1.1, Figura 2A),seguidos de reciclagem para aumentar a pureza (passo 1.2, Figura 2B). As proteínas motoras de cinese foram expressas e purificadas de E. coli (passos 2.1 e 2.2, Figura 2...

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Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

O objetivo deste protocolo é usar a temperatura para controlar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais. A vantagem deste método não só permite regular as velocidades de fluxo in situ, mas também permite o controle dinâmico, como ajustar periodicamente as velocidades de fluxo para cima e para baixo.

Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

A matéria ativa tem sido usada em várias aplicações, como sombras moleculares. Para levar a aplicação ao próximo nível, precisamos desenvolver a capacidade de controlar a questão ativa localmente. Fornecemos um método fácil de usar que não requer modificação do fluido ativo.Nem a necessidade de modificar o caminho óptico do microscópio para alcançar o controle local do fluido ativo. Nosso método pode ser aplicado a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei errônea, como o ensaio de deslizamento de microtúbulos ou sistemas baseados em enzimas. A configuração envolve um sistema de circulação de água.Se ocorrerem vazamentos, a água pode danificar o microscópio. Portanto, antes de adotar nosso protocolo, é importante garantir que o sistema esteja livre de vazamentos. Nosso protocolo requer a montagem da amostra de vidro em um estágio de temperatura.Embora o manuscrito descreva o procedimento de montagem, ele carece de sutilezas mecânicas, como fixar a amostra ao estágio. Demonstrando o procedimento, estarão Teagan Bate, Edward Jarvis e Megan Varney. Teagan e Edward são estudantes de pós-graduação, e Megan é uma estudante de graduação de um laboratório.Para preparar fluidos ativos em um tubo Eppendorf, misture 16 pontos sete microliters de oito miligramas por microtúbulos mililitros com seis pontos sete microliters de um ponto oito aglomerados motores de cinesina micromolar, e um ponto um microliters de 500 mililitros DTT em M2B de alto sal. Microtúbulos de feixe adicionando 11 pontos quatro microliters de sete por cento de peso por peso polietileno glicol. Em seguida, ative os motores de quinase adicionando dois ponteiros de oito microlitadores de 50 mililitros ATP.Mantenha as concentrações da ATP adicionando dois pontos oito microliters de piramato de estoque kinase/lactato desidrogenase, e 13 pontos três microliters de 200 milimônios piruvanato de fosfenol. Reduza o efeito de branqueamento fotográfico adicionando 10 microlitros de 20 milimilhas Trolox, um ponto um microlitros de três pontos cinco miligramas por catalase mililitro, um ponto um microlitros de 20 mililígras por mililitro de glicose oxidase, e um ponto um microliters de 300 miligramas por glicose mililitro. Rastreie o movimento do fluido adicionando um ponto seis microliters de zero ponto zero dois cinco por cento de volume por partículas rastreadoras de volume.Adicione M2B de sal alto para alcançar um volume total de 100 microliters. Em seguida, enxágue um slide de vidro revestido de poliacrilamida e cubra o deslizamento com água DI. Seque os copos com ar pressurizado.Coloque os óculos em uma superfície limpa e plana. Corte um canal de três milímetros de largura no filme de cera. A largura total é da mesma largura que a tampa de vidro desliza a 20 milímetros.Insira a cera entre o deslizamento e o deslizamento da tampa para formar um canal de célula de fluxo para fluido. Adere o vidro ao filme de cera colocando o complexo de cera de vidro em uma placa quente de 80 graus Celsius para derreter a cera. Durante o derretimento, pressione a tampa deslize suavemente com uma ponta de pipeta para aderir uniformemente o filme de cera às superfícies de vidro.Após a adesão, esfrie o complexo de vidro à temperatura ambiente. Carregue prontamente os fluidos ativos preparados para o canal de fluxo com a ponta da pipeta em um ângulo longe da abertura do canal e em contato com a superfície do deslizamento de vidro. Sele o canal com cola UV.Depois de construir uma configuração de controle de temperatura, coloque a amostra de fluido ativo na superfície da safira com o lado do slide entrando em contato com a superfície. Fixar o deslizamento de vidro com fita adesiva. Usando fita adesiva, conecte o ThermoSensor à superfície de deslizamento de tampa.Para montar a configuração em um estágio de microscópio, com o deslizamento de tampa voltado para os objetivos, fixe a configuração com grampos de agulha de estágio de microscópio. Ligue o controlador de temperatura e a bomba do aquário. Siga o guia do fabricante para definir a temperatura-alvo.Habilite o controle de temperatura. E registo os dados de temperatura do ThermoSensor. Imagem a amostra com um intervalo de tempo constante em uma microscopia fluorescente equipada com um cubo de filtro GFP para monitorar as partículas de rastreador rotulados Alexa 488 na mistura ativa.Ajuste o intervalo de tempo para permitir que o deslocamento do rastreador entre os quadros esteja dentro de nove pixels. Para rastreadores de imagem que se movem a 10 micrômetros por segundo, usando um objetivo de quatro vezes, recomenda-se que o intervalo de tempo seja de um a cinco segundos. Salve as imagens como arquivos TIF, nomeie os arquivos com base no número do quadro e armazene-as em uma pasta separada.Para este microtúbulo acionado por cinesina, a temperatura foi controlada a 10, 20, 30 e 40 graus Celsius. A flutuação na temperatura foi de zero ponto um a zero ponto três graus Celsius por quatro horas demonstrando a estabilidade e confiabilidade desta configuração de controle de temperatura. Os rastreadores foram imagens a cada dois segundos, o que as imagens sequenciais permitiram para rastrear trajetórias de rastreadores.As velocidades médias medidas de 20 a 36 graus Celsius, pareciam ser quase tempo independentes de zero a duas horas. Enquanto a 10 e 40 graus Celsius, as velocidades médias deterioraram-se rapidamente causadas pela despolimerização de microtúbulos abaixo de 16 graus Celsius e os aglomerados de cinesina com defeito acima de 36 graus Celsius, respectivamente. Quando as temperaturas do sistema foram alternadas entre 20 e 30 graus Celsius a cada 30 minutos, as velocidades médias dos fluidos ativos não só aceleraram e desaceleraram em conformidade, mas também responderam à mudança de temperatura em 10 segundos.Os fluidos ativos começam a funcionar mal, quando resfriados abaixo de 16 ou aquecidos acima de 36 graus. Então, ao manipular o controlador de temperatura, certifique-se de que a temperatura está entre 16 e 36 graus. A capacidade de sintonizar o fluido ativo localmente, permite direcionar a potência do fluido, como entregar cargas do ponto A ao ponto B ou desenvolver um dispositivo de microfluidez que não exija uma válvula física.A acrilamida usada para revestir vidros é uma neurotoxina que pode absorver através da pele. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas, jalecos e óculos de segurança para minimizar o risco.

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