Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 var en gåva från Dr Zvonimir Dogic. Denna forskning stöddes av Dr. kun-ta Wu ' s startfond i Worcester Polytechnic Institute. Vi tackar Dr Zvonimir Dogic för protokollen att rena och etikett tubulin och att syntetisera aktiva vätskor. Vi är tacksamma för Dr Marc Ridilla för hans expertis inom proteinuttryck och rening. Vi tackar Dr William Benjamin Roger för att hjälpa oss med att bygga den temperaturstyrda scenen. Vi erkänner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) för användning av biologiska material Facility (BMF). Vi erkänner det kungliga kemi förbundet för att anpassa siffrorna från BATE et al. on Soft Matter33.

1. beredning av MTs
FÖRSIKTIGHET: i detta steg renar vi tubuliner från nötkreatur hjärnvävnad. Bovint hjärna kan orsaka variant Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (vCJD)35. Därför bör hjärnan avfall och relaterade lösningar, flaskor, och pipettspetsar samlas i en bioavfall påse och bortskaffas som biologiskt farligt avfallet enligt institutionens regler.
<ol><li>Rena tubuliner från bovint hjärna (modifierad från Castoldi et al.36).<ol>
<...

Styra aktiv materia in situ öppnar dörren till riktad självorganisering av aktiv materia4,5,24,28,54. I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att använda temperatur för att styra kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor på plats, baserat på Arrhenius karakteristiska för systemet29,30<...

Aktiv materia är differentierat från konventionell passiv materia på grund av dess förmåga att omvandla kemisk energi till mekaniskt arbete. Ett material som besitter sådan förmåga kan bestå av levande eller icke-levande enheter såsom bakterier, insekter, kolloider, korn, och cytoskelett filament1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa material enheter interagerar med sina grannar. I större skala, de själv organisera i antingen turbulenta-liknande virvlar (aktiv turbulens) eller materialflöden11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En förståelse för självorganisering av aktiv materia har lett till olika tillämpningar i molekylära shuttles, optiska enheter och parallell beräkning21,22,23. För att få program till nästa nivå kräver kontroll bortom självorganisering. Till exempel, Palacci et al. utvecklat en hematite-inkapslad kolloid som självgående endast när de utsätts för manuellt kontrollerade blått ljus, vilket ledde till uppkomsten av levande kristaller24. Morin et al. etablerat kontroll av rullande Quincke kolloider med hjälp av en avstämbara yttre elektriska fält, vilket resulterar i kolloidal flockas i en travet-liknande kanal25. Dessa tidigare arbeten visar den roll som den lokala kontrollen har i tillämpningar och avancerar kunskapsbasen för aktiv materia.
I den här artikeln fokuserar vi på manövrerbarheten av kinesindrivna, mikrotubule (MT)-baserade 3D-aktiva vätskor. Vätskorna består av tre huvudkomponenter: MTs, kinesinet molekylära motorer och nedbrytande medel. De nedbrytande inducerar en utarmning kraft för att bunta MTs, som senare överbryggas av motor kluster. Dessa motorer går längs MTstoward plus änden. När ett par brygged MTsis antiparallel, motsvarande motorer gå i motsatt riktning. Men motorerna är bundna i ett kluster och kan inte gå isär, så de kooperativt glida isär par MTs (interfilament glidande, figur 1a). Dessa glidande dynamik ackumuleras, orsakar buntar av MTsto förlänga tills de når sin buckling instabilitet punkt och bryta (extensile buntar, figur 1B)26. De trasiga buntarna glödgas av den utarmning kraft, som därefter sträcker sig igen, och dynamiken upprepa. Under processen av den upprepande dynamiken, bunt rörelser rör den närliggande vätskan, inducera flöden som kan visualiseras genom dopning med Micron-skala spårämnen (figur 1C). Sanchez et al. och Henkin et al. har karakteriserat medelvärdet av tracers, att finna att hastigheterna var avstämbara genom att variera koncentrationerna av adenosintrifosfat (ATP), beklagar, motoriska kluster, och MTS19,27. Emellertid, sådan inställnings existerade endast före aktiv vätske syntes. Efter syntesen, var inställnings förlorad, och vätskorna självorganiserade på sitt eget sätt. För att kontrollera aktiv vätske aktivitet efter syntes, rapporterade Ross.et al. en metod med hjälp av ljus-aktiverade Dimerization av motorproteiner, vilket gör att vätske aktivitet att stämmas av och på med hjälp av ljus28. Medan ljusstyrning är praktiskt när det gäller lokalt aktivera vätskor, metoden kräver omkonstruktion av strukturer av motorproteiner, tillsammans med att ändra de optiska banorna i ett mikroskop. Här ger vi en lättanvänd metod för lokalt kontrollerade vätskeflöden utan Mikroskop modifiering samtidigt som motor strukturen hålls intakt.
Vår metod för lokalt trimning av aktivt vätskeflöde baseras på Arrhenius-lagen eftersom kinesin-MT-reaktionen har rapporterats öka med temperatur29,30,31,32. Våra tidigare studier visade att temperaturberoendet av medelhastigheten av ett aktivt vätskeflöde följde Arrhenius ekvation: v = a exp (-Ea/RT), där a är en före exponentiell faktor, R är gaskonstanten, EA är aktiveringsenergin och T är system temperaturen33. Därför är vätske aktivitet känslig för temperatur miljön, och system temperaturen måste vara konsekvent för att stabilisera motorns prestanda, och därmed vätske flödeshastigheten34. I den här artikeln visar vi användningen av motorns temperaturberoende för att kontinuerligt ställa in flödeshastigheterna för aktiva vätskor genom att justera system temperaturen. Vi demonstrerar också beredningen av ett aktivt vätske prov, följt av att montera provet på ett Mikroskop skede vars temperatur styrs via datorprogram. Att öka temperaturen från 16 ° c till 36 ° c påskyndar medelvärdet av flödeshastigheterna från 4 till 8 μm/s. Dessutom är inställnings reversibel: upprepade gånger ökar och minskar temperaturen sekventiellt accelererar och bromsar flödet. Den demonstrerade metoden är tillämplig på ett brett spektrum av system där de viktigaste reaktionerna lyda Arrhenius lag, såsom MT glidflygning assay29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Vi presenterar en metod för att använda temperatur för att finjustera flödeshastigheterna för kinesindrivna, mikrotubule-baserade tredimensionella (3D) aktiva vätskor. Denna metod gör det möjligt att trimma hastigheter på plats utan att behöva tillverka nya prover för att nå olika önskade hastigheter. Dessutom möjliggör denna metod dynamisk kontroll av hastighet. Cykling temperaturen leder vätskor för att flöda snabbt och långsamt, regelbundet. Denna manövrerbarhet baseras på Arrhenius-karakteristik för kinesinmikrotubule-reaktionen, vilket visar ett kontrollerat medelvärde för flödeshastighet på 4 – 8 μm/s. Den presenterade metoden kommer att öppna dörren till utformningen av mikroflödessystem enheter där flödeshastigheter i kanalen är lokalt avstämbar utan behov av en ventil.

Att förbereda kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor kräver både kinesinet och MTs. MTs polymeriserades från märkta tubuliner (steg 1,3 och 1,4) som renades från nötkreatur hjärnor (steg 1,1, figur 2A), följt av återvinning för att förbättra renhet (steg 1,2, figur 2B). Kinesins motorproteiner uttrycks i och renas från E. coli (steg 2,1 och 2,2, figur 2B)<...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Målet med detta protokoll är att använda temperatur för att kontrollera flödeshastigheterna hos tredimensionella aktiva vätskor. Fördelen med denna metod gör det inte bara möjligt att reglera flödeshastigheter på plats, utan möjliggör även dynamisk styrning, till exempel att regelbundet trimma flödeshastigheter upp och ned.

Kontrollera flödeshastigheter av Mikrotubule-baserade 3D aktiva vätskor med temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktiv materia har använts i olika tillämpningar som molekylära skuggor. För att få ansökan till nästa nivå måste vi utveckla förmågan att kontrollera den aktiva frågan lokalt. Vi tillhandahåller en lättanvänd metod som inte kräver modifiering av den aktiva vätskan.Inte heller behovet av att modifiera den optiska vägen av mikroskop för att uppnå den lokala kontrollen av den aktiva vätskan. Vår metod kan tillämpas på ett brett spektrum av system där de viktigaste reaktionerna lyder den felaktiga lagen såsom mikrotubuli glidningsanalys eller enzymbaserade system. Upplägget innebär ett vattencirkulationssystem.Om det uppstår läckor kan vatten skada mikroskopet. Därför, innan vi antar vårt protokoll, är det viktigt att se till att systemet är läckagefritt. Vårt protokoll kräver montering av glasprovet på en temperatursteg.Medan manuskriptet beskriver monteringsförfarandet, saknar det mekaniska subtiliteter som att säkra provet till scenen. Visar förfarandet, kommer att Teagan Bate, Edward Jarvis, och Megan Varney. Teagan och Edward är doktorander, och Megan är en grundutbildning student från ett laboratorium.För att förbereda aktiva vätskor i ett Eppendorf-rör, blanda 16 punkt sju mikroliter på åtta milligram per milliliter mikrotubuli med sex punkt sju mikroliter av en punkt åtta mikromolar kinesin motor kluster, och en punkt en mikroliter av 500 millimolar DTT i hög salt M2B. Bunt mikrotubuli genom att lägga till 11 punkt fyra mikroliter av sju procent vikt i vikt polyetylenglykol. Aktivera sedan kinesinmotorer genom att lägga till två punkt åtta mikroliter på 50 millimolar ATP.Bibehåll ATP-koncentrationerna genom att tillsätta två punkt åtta mikroliter av lager pyruvat kinas/laktat dehydrogenas, och 13 punkt tre mikroliter av 200 millimolar fosfenol pyruvat. Minska foto blekning effekt genom att lägga till 10 mikroliter av 20 millimolar Trolox, en punkt en mikroliter av tre punkt fem milligram per milliliter katalas, en punkt en mikroliter på 20 milligram per milliliter glukosoxidas, och en punkt en mikroliter på 300 milligram per milliliter glukos. Spåra vätskans rörelse genom att lägga till en punkt sex mikroliter av nollpunkt noll två fem procent volymspårarpartiklar volymprocent.Tillsätt högsalt M2B för att uppnå en total volym på 100 mikroliter. Därefter skölj en polyakrylamidbelagd glasrutschbana och täckglidning med DI-vatten. Torka glasen med trycksatt luft.Placera glasen på en ren, plan yta. Skär en tre millimeter bred kanal i vaxfilmen. Den totala bredden är samma bredd som glaskåpan slip på 20 millimeter.Sätt i vaxet mellan glid- och täckslit för att bilda en flödescellkanal för vätska. Följ glaset till vaxfilmen genom att placera glasvaxkomplexet på en 80 grader Celsius värmeplatta för att smälta vaxet. Under smältningen trycker du försiktigt på täckslitten med en pipettspets för att likformigt hålla fast vaxfilmen på glasytorna.Efter vidhäftning, kyl glaskomplexet till rumstemperatur. Ladda omgående de förberedda aktiva vätskorna till flödeskanalen med pipettspetsen i en vinkel bort från kanalöppningen och i kontakt med glasglidytan. Täta kanalen med UV-lim.Efter att ha byggt upp en temperaturkontrollinställning, placera det aktiva vätskeprovet på safirytan med glidsidan som kontaktar ytan. Säkra glasglaset med papperstejp. Använd koppartejp, fäst ThermoSensorn på täckslisytan.För att montera inställningen på ett mikroskop skede, med locket glida vänd mot målen, säkra inställningen med mikroskop steg nål klämmor. Sätt på temperaturregulatorn och fisktankpumpen. Följ tillverkarna guide för att ställa in måltemperaturen.Aktivera temperaturkontroll. Och spela in ThermoSensor temperaturdata. Avbilda provet med ett konstant tidsintervall på en fluorescerande mikroskopi utrustad med en GFP-filterkub för att övervaka Alexa 488-märkta spårpartiklar i den aktiva blandningen.Justera tidsintervallet så att spårämnesförskjutningen mellan bildrutorna kan ligga inom nio pixlar. För avbildningsspårare som rör sig med 10 mikrometer per sekund, med hjälp av ett fyra gånger objektivt, rekommenderas tidsintervallet att vara en till fem sekunder. Spara bilderna som TIF-filer, namnge filerna baserat på ramnummer och lagra dem i en separat mapp.För denna kinesin driven microtubule baserade aktiva vätskor, temperaturen kontrollerades vid 10, 20, 30 och 40 grader Celsius. Fluktuationen i temperatur var inom nollpunkt en till nollpunkt tre grader Celsius i fyra timmar som visar stabilitet och tillförlitlighet i denna temperaturkontroll setup. Spårämnena avbildades varannan sekund, vilket de sekventiella bilderna tillät för att spåra spårämnesbanor.Medelvärdet hastigheter mätt vid 20 till 36 grader Celsius, verkade vara nästan tid oberoende vid noll till två timmar. Där som vid 10 och 40 grader Celsius, medelvärdet hastigheter förfallas snabbt orsakas av mikrotubule depolymerization under 16 grader Celsius och kinesin kluster krånglar över 36 grader Celsius respektive. När systemtemperaturen var alternerade mellan 20 och 30 grader Celsius var 30:e minut accelererade de aktiva vätskornas medelhastigheter inte bara och avtades därefter, utan de svarade också på temperaturförändringen inom 10 sekunder.Aktiva vätskor börjar krångla, när de kyls under 16 eller värms upp över 36 grader. Så när du manipulerar temperaturregulatorn, se till att temperaturen är mellan 16 och 36 grader. Förmågan att trimma aktiv vätska lokalt, möjliggör att styra vätskeeffekten såsom att leverera laster från punkt A till punkt B eller utveckla en mikrofluiditetsenhet som inte kräver en fysisk ventil.Akrylamid som används för att belägga glas är ett nervgift som kan absorbera genom huden. Använd ordentlig skyddsutrustning som handskar, labbrockar och skyddsglasögon för att minimera risken.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Styra storlek, form och stabilitet Supramolekylära polymerer i vatten

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Bestämma 3D Flow Fält via flera kameror ljusfält Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Högupplöst, hög hastighet, tredimensionell video Imaging med Digital Fringe Projection Tekniker

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Experimentell mätning av sedimenteringshastigheten för sfäriska partiklar i odefinierade och begränsade tensidbaserade savförtunnande viskoelastiska vätskor

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Mätning Material Mikro Under Flow Använda 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Tillverkning av enhetliga håligheter i nanoskala via Silicon Direct Wafer Bonding

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Snabb bildteknik för att studera Drop Impact Dynamics av ​​icke-newtonska vätskor

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Skriva och låg temperatur karakterisering av Oxide nanostrukturer

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Visualisering hyporheiska Flöde genom Bedforms Använda Dye Experiment och Simulering

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Karakterisering av full uppsättning Material Constants och deras temperaturberoende för piezoelektriska material med användning av resonans Ultraljud spektroskopi

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...