Name: controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Plasmid K401-BCCP-H6 Dr Zvonimir Dogic bir hediye oldu. Bu araştırma Dr Kun-Ta Wu'nun Worcester Politeknik Enstitüsü'ndeki başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir. Dr. Zvonimir Dogic'e tubulin'i arındırmak ve etiketlemek ve aktif sıvısentezlemek için protokoller için teşekkür ederiz. Dr. Marc Ridilla'ya protein ekspresyonu ve arınma konusundaki uzmanlığı ndan dolayı minnettarız. Dr. William Benjamin Roger'a sıcaklık kontrollü sahneyi inşa etmemizde bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biyolojik Malzeme Tesisi'nin (BMF) kullanımı için Brandeis MRSEC'i (NSF-MRSEC-1420382) kabul ediyoruz. Biz Soft Matter33üzerinde Bate ve ark rakamları adapte için Royal Society of Chemistry kabul ediyoruz.

1. MTs hazırlanması
DİkKAT: Bu adımda büyükbaş beyin dokusundan tubulinleri arındırıyoruz. Sığır beyin varyant Creutzfeldt-Jakob hastalığı neden olabilir (vCJD)35. Bu nedenle, beyin atıkları ve ilgili çözümler, şişeler ve pipet uçları bir biyoatık torbasında toplanmalı ve kurum kurallarına göre biyolojik atık olarak bertaraf edilmelidir.
<ol><li>Büyükbaş beyinden tubulinleri arındırın (Castoldi ve ark.36'dan...

Yerinde aktifmadde kontrol aktif madde4,5,24,28,54yönlendirilmiş öz-organizasyon için kapıyı açar. Bu makalede,sisteminArrhenius karakteristik dayalı, yerinde kinesin tahrikli, MT tabanlı aktif sıvıları kontrol etmek için sıcaklık kullanmak için bir protokol sokulmak,30,<sup ...

Aktif madde, kimyasal enerjiyi mekanik işe dönüştürme yeteneği nedeniyle geleneksel pasif maddeden ayrılır. Bu yeteneğe sahip bir malzeme bakteriler, böcekler, kolloidler, tahıllar ve sitosiskelet selamanları1,2,3,4,5,6,7,8,9,10gibi canlı veya cansız varlıklardan oluşabilir. Bu maddi varlıklar komşuları ile etkileşim. Daha büyük bir ölçekte, onlar kendi kendine türbülans gibi girdaplar (aktif türbülans) veya malzeme akar11,12,13,14,15,16,17,18,19,20içine organize . Aktif maddenin kendi kendine örgütlenmeanlayışı moleküler mekiklerde, optik cihazlarda ve paralel hesaplamada çeşitli uygulamalara yol açmıştır21,22,23. Uygulamaları bir sonraki seviyeye taşımak için öz-organizasyon ötesinde denetim gerektirir. Örneğin, Palacci ve ark. sadece elle kontrol edilen mavi ışığa maruz kaldığında kendinden tahrikli bir hematit kapsüllü kolloid geliştirdi, bu da yaşayan kristallerin ortaya çıkmasına yol açtı24. Morin ve ark. bir yarış pisti gibi kanal25kolloidal akın sonuçlanan, bir tasmalı dış elektrik alanı kullanarak haddeleme Quincke kolloidlerin kontrolü kurdu. Bu önceki çalışmalar, uygulamalarda yerel kontrolün rolünü göstermekte ve aktif maddenin bilgi tabanını ilerletiyor.
Bu makalede, kinesin güdümlü, mikrotübül (MT) tabanlı 3D aktif sıvıların kontrol edilebilirliğine odaklanıyoruz. Sıvılar üç ana bileşenden oluşur: MTs, kinesin moleküler motorlar, ve depletantlar. Depletantlar, daha sonra motor kümeleri tarafından köprülenir MTs, bohça için bir tükenme kuvveti neden. Bu motorlar artı sonuna doğru MTs boyunca yürümek. Bir çift köprülü MTsis antiparallel, karşılık gelen motorlar zıt yönlere yürümek. Ancak, motorlar bir kümeye bağlanır ve birbirinden ayrılamaz, bu nedenle birlikte mt çiftlerini (interfilament sürgülü, Şekil 1A)ayırırlar. Bu sürgülü dinamikler birikir, MTsto demetleri kendi bükme istikrarsızlık noktasına ulaşana kadar uzatmak ve kırmak neden (ektensilen demetleri, Şekil 1B)26. Kırık demetler, daha sonra tekrar uzayan tükenme kuvveti tarafından annealed edilir ve dinamikleri tekrar. Yinelenen dinamiğin işlemi sırasında, demet hareketleri mikron ölçekli izleyicilerle doping yaparak görüntülenebilen yakındaki sıvıyı karıştırır(Şekil 1C). Sanchez ve ark. ve Henkin ve ark. adenozin trifosfat (ATP), depletants, motor kümeleri ve MTs19,27konsantrasyonları değiştirerek hızları yetersiz olduğunu bularak, izleyicilerin ortalama hızları karakterize var . Ancak, bu tür bir alabilme sadece aktif sıvı sentezinden önce mevcut. Sentezden sonra, ayarı kaybedildi ve sıvılar kendi yollarında kendi kendine organize edildi. Sentezden sonra aktif sıvı aktivitesini kontrol etmek için, Ross.et al. motor proteinlerin ışık-aktive dimerization kullanarak bir yöntem bildirdi, sıvı aktivitesi ışık kullanılarak ayarlanması ve kapalı izin28. Işık kontrolü sıvıların yerel olarak aktive olması açısından kullanışlı olsa da, yöntem motor proteinlerinin yapılarının yeniden tasarlanması ve optik yolların mikroskopiçinde değiştirilmesini gerektirir. Burada, motor yapısını sağlam tutarken mikroskop modifikasyonu olmadan sıvı akışlarını yerel olarak kontrol etmek için kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.
Kinesin-MT reaksiyonu sıcaklık29,30,31,32ile arttığı bildirilmiştir çünkü lokal olarak tuning aktif sıvı akışı yöntemimiz Arrhenius yasasına dayanmaktadır. Önceki çalışmalarımız, aktif bir sıvı akışının ortalama hızının sıcaklık bağımlılığının Arrhenius denklemini takip ettiğini gösterdi: v = A exp(-Ea/RT), A'nın üstel bir faktör olduğu, R gaz sabiti, Ea aktivasyon enerjisi ve T sistem sıcaklığı33' tür. Bu nedenle, sıvı aktivitesi sıcaklık ortamına duyarlıdır ve sistem sıcaklığının motor performansını dengelemek için tutarlı olması gerekir ve sonuç olarak, akışkan akış hızı34. Bu makalede, sistem sıcaklığını ayarlayarak aktif sıvıların akış hızlarını sürekli olarak ayarlamak için motorun sıcaklık bağımlılığının kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca aktif bir sıvı numunesinin hazırlanmasını ve ardından numunenin bilgisayar yazılımı ile kontrol edilen bir mikroskop aşamasına monte edilerek kanıtlıyoruz. Sıcaklığın 16 °C'den 36 °C'ye yükseltilen hızları 4'ten 8 μm/s'ye çıkar. Ayrıca, ayarlanabilirlik geri döndürülebilir: sıcaklığın art arda artması ve azalması akışı hızlandırır ve yavaşlar. Gösterilen yöntem, ana reaksiyonların Arrhenius yasalarına uyduğunun geniş bir yelpazede uygulanabilir, örneğin MT süzülen tetkik29,30,31,32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Trolox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC216550050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2074038</td>
			<td>Water tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31.75 mm diameter uncoated, sapphire window</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>43-637</td>
			<td>Sapphire disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551</td>
			<td>R.S. HUGHES</td>
			<td>054007-27551</td>
			<td>Copper tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1402-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate dipotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN802829</td>
			<td>APS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>Ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antivibration Table</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>63-7590S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-760</td>
			<td>Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucket-plastic white - 2 gallon</td>
			<td>Bon</td>
			<td>84-715</td>
			<td>Water bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD00045</td>
			<td>4x air objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>96372</td>
			<td>GFP filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CH-109-1.4-1.5</td>
			<td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling block</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom milled aluminum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td>Triphenylmethane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC165680050</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWSIL 340 Heat Sink Compound</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1446622</td>
			<td>Thermal paste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200CB05</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421</td>
			<td>Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422</td>
			<td>Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18861</td>
			<td>Tracer particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GpCpp</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-405L</td>
			<td>Guanosine-5'[(&#945;,&#946;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS Power&#39;s 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07428NBCW</td>
			<td>Copper wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410</td>
			<td>NaHEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance blender machine</td>
			<td>AIMORES</td>
			<td>AS-UP1250</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His GraviTrap</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11003399</td>
			<td>Gravity Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol 99%</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>231000099</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-10 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>K-Glutamate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5057</td>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td>3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP-3022</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>MP-3022</td>
			<td>Thermocouple</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC138450500</td>
			<td>TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E112352</td>
			<td>Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland Optical Adhesive 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>UV glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td>Protein standard ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm PM996 Wrap , 4&#34; Wide; 125 Ft/Roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06720-40</td>
			<td>Wax film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe 300 ultra Illumination System Single 
			Band , 3mm Light Guide control Pod 
			power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PE-300-UT-L-SB-40</td>
			<td>Cool LED Illuminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%</td>
			<td>BeanTown Chemical</td>
			<td>129745</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300</td>
			<td>PEG. Average molecular weight 20,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PS0300</td>
			<td>DC power supply of the gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>PS-12-8.4A</td>
			<td>DC power supply of the temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-0294</td>
			<td>PK/LDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B005JWA612</td>
			<td>Fish tank pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71403</td>
			<td>Competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MT6JZMR</td>
			<td>Microwave for boiling the water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-720</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648310</td>
			<td>Tris-HCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70.1 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-916</td>
			<td>Paper tapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>Glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75799-268</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Gel box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYLA 5.5 USB3.0 Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ZYLA5.5-USB3</td>
			<td>Monochrome CCD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlling flow speeds of microtubule-based 3d active fluids using temperature

Biz kinesin tahrikli, mikrotübül tabanlı üç boyutlu (3D) aktif sıvıların akış hızlarını ayarlamak için sıcaklık kullanmak için bir yöntem salıyoruz. Bu yöntem, farklı istenilen hızlara ulaşmak için yeni numuneler üretmek gerek kalmadan yerinde hızları tuning sağlar. Ayrıca, bu yöntem hızın dinamik kontrolünü sağlar. Sıcaklık bisiklet hızlı ve yavaş, periyodik olarak akış sıvıları yol açar. Bu kontrol edilebilirlik, kinesin-mikrotübül reaksiyonunun Arrhenius karakteristik özelliğine dayanarak 4-8 m/s kontrollü bir ortalama akış hızı aralığını gösterir. Sunulan yöntem, kanaldaki akış hızlarının bir vanaya gerek kalmadan yerel olarak ölçülebilir olduğu mikroakışkan cihazların tasarımına kapı açacaktır.

Kinesin güdümlü, MT bazlı aktif sıvıların hazırlanması hem kinesin hem de MT gerektirir. MT'ler sığır beyinlerinden saflaştırılan etiketli tubulinlerden (basamak 1.3 ve 1.4) polimerize edildi (basamak 1.1, Şekil 2A),saflığı artırmak için geri dönüşüm takip edildi (adım 1.2, Şekil 2B). Kinesin motor proteinleri E. coli (basamak 2.1 ve 2.2, Şekil 2B</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature at JoVE.com

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktif madde moleküler gölgeler gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır. Uygulamayı bir sonraki seviyeye taşımak için, aktif maddeyi yerel olarak kontrol etme yeteneğini geliştirmemiz gerekir. Aktif sıvının değiştirilmesini gerektirmeyen kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.Ne de aktif sıvının yerel kontrol elde etmek için mikroskop optik yolu değiştirmek gerekir. Yöntemimiz, ana reaksiyonların mikrotübül süzme test veya enzim bazlı sistemler gibi hatalı yasalara uydukları geniş bir sistem yelpazesine uygulanabilir. Kurulum bir su sirkülasyon sistemi içerir.Sızıntılar meydana gelirse, su mikroskoba zarar verebilir. Bu nedenle, protokolümüzü kabul etmeden önce, sistemin sızdırmaz olmasını sağlamak önemlidir. Protokolümüz cam örneğinin sıcaklık aşamasına monte sini gerektirir.El yazması montaj prosedürünü açıklarken, örneği sahneye çıkarmak gibi mekanik inceliklerden yoksundur. Prosedürü gösteren, Teagan Bate, Edward Jarvis ve Megan Varney olacaktır. Teagan ve Edward yüksek lisans öğrencileri, ve Megan bir laboratuvar dan bir lisans öğrencisidir.Bir Eppendorf tüpünde aktif sıvıları hazırlamak için, mililitre mikrotübbaşına sekiz miligramlık 16 nokta yedi mikrolitreile bir nokta sekiz mikromolar kinesin motor kümelerinin altı nokta yedi mikrolitresini ve yüksek tuzlu M2B'de 500 milimolar DTT'lik bir mikrolitreyi karıştırın. Ağırlık polietilen glikol ile yüzde yedi ağırlık 11 nokta dört mikrolitre ekleyerek paket mikrotübüller. Sonra 50 milimolar ATP iki nokta sekiz mikrolitre ekleyerek kinesin motorları etkinleştirin.Stok pirüuvat kinaz /laktat dehidrogenaz iki nokta sekiz mikrolitre ve 200 milimolar fosfenol pirüuvat 13 nokta üç mikrolitre ekleyerek ATP konsantrasyonları koruyun. 20 milimolar Trolox 10 mikrolitre ekleyerek fotoğraf ağartma etkisini azaltmak, mililitre katalaz başına üç nokta beş miligram bir nokta bir mikrolitre, mililitre glikoz oksidaz başına 20 miligram bir nokta bir mikrolitre, ve mililitre glikoz başına 300 miligram bir mikrolitre. Hacim izleyici parçacıkları tarafından sıfır noktası sıfır iki yüzde beş hacim bir nokta altı mikrolitre ekleyerek sıvının hareketini izleyin.Toplam 100 mikrolitre hacim elde etmek için yüksek tuz Lu M2B ekleyin. Daha sonra, bir poliakrilamid kaplı cam slayt durulayın ve DI su ile kapak kayma. Basınçlı hava ile gözlük kuru.Gözlükleri temiz, düz bir yüzeye yerleştirin. Balmumu filminde üç milimetre genişliğinde bir kanal kes. Toplam genişlik, 20 milimetrelik cam kapak lı kapakla aynı genişliktedir.Sıvı için bir akış hücre kanalı oluşturmak için slayt ve kapak kayma arasında balmumu ekleyin. Balmumu eritmek için 80 derece santigrat sıcak plaka üzerine cam balmumu kompleksi yerleştirerek balmumu film için cam yapıştırın. Erime sırasında, balmumu filmini cam yüzeylere düzgün bir şekilde yapıştırmak için kapağı bir pipet ucuyla hafifçe bastırın.Yapışmadan sonra cam kompleksini oda sıcaklığına kadar soğutun. Hazırlanan aktif sıvıları, pipet ucu yla kanal açılışından uzakta ve cam slayt yüzeyi ile temas halinde bir açıyla akış kanalına derhal yükleyin. Kanalı UV tutkalla kapatın.Bir sıcaklık kontrol kurulumu yaptıktan sonra, aktif sıvı örneğini safir yüzeye yerleştirin ve slayt tarafı yüzeye temas edin. Cam kaydırağı kağıt bantla sabitleyin. Bakır bant kullanarak, ThermoSensor'u kapak kayma yüzeyine takın.Kuruluma mikroskop aşamasına monte etmek için, kapak kaymalı kaydırağı hedeflere bakacak şekilde, mikroskop aşaması iğne kelepçeleri ile kurulumu güvence altına alayın. Sıcaklık kontrol cihazını ve akvaryum pompasını açın. Hedef sıcaklığı ayarlamak için üreticiler kılavuzunu izleyin.Sıcaklık kontrolünü etkinleştirin. Ve ThermoSensor sıcaklık verilerini kaydedin. Aktif karışımdaki Alexa 488 etiketli izleme parçacıklarını izlemek için GFP filtre küpüyle donatılmış bir floresan mikroskopide sabit bir zaman aralığıyla örneği görüntüleyin.Çerçeveler arasındaki izleyici yer değiştirmesinin dokuz piksel içinde olmasını sağlamak için zaman aralığını ayarlayın. Saniyede 10 mikrometre hızla hareket eden görüntüleme izleyicileri için, dört kat nesnel kullanılarak, zaman aralığının bir ila beş saniye olması önerilir. Resimleri TIF dosyaları olarak kaydedin, dosyaları çerçeve numarasına göre adlandırın ve ayrı bir klasörde saklayın.Bu kinesin tahrikli mikrotübül bazlı aktif sıvılar için sıcaklık 10, 20, 30 ve 40 santigrat derecede kontrol edildi. Sıcaklıktaki dalgalanma, bu sıcaklık kontrol kurulumunun kararlılığını ve güvenilirliğini gösteren dört saat boyunca sıfır noktası 1 ila sıfır noktası üç derece santigrat derece içinde ydi. İzleyiciler her iki saniyede bir görüntüleniyor ve sıralı görüntüler izleme yörüngelerini izlemek için izin veriliyor.Ortalama hızları 20-36 santigrat derece olarak ölçülen, neredeyse zaman sıfır iki saat bağımsız olduğu ortaya çıktı. 10 ve 40 santigrat derecede ise, ortalama hızlar mikrotübül depolimerizasyonunun 16 santigrat derecenin altında olması ve kinesin kümelerinin sırasıyla 36 santigrat derecenin üzerinde arızalanması sonucu hızla çürür. Sistem sıcaklıkları her 30 dakikada bir 20 ila 30 derece arasında değiştiğinde, aktif sıvıların ortalama hızları sadece hızlanıp buna göre yavaşlamakla kalmadı, aynı zamanda sıcaklık değişimine 10 saniye içinde yanıt verdi.Aktif sıvılar 16 derecenin altında soğutulduğunda veya 36 derecenin üzerinde ısıtıldığında arızaya başlar. Bu yüzden sıcaklık kontrol cihazını manipüle ederken, sıcaklığın 16 ila 36 derece arasında olduğundan emin olun. Aktif sıvıyı yerel olarak alabilme yeteneği, A noktasından B noktasına kargo lar teslim etmek veya fiziksel bir vana gerektirmeyen bir mikroakışkanlık cihazı geliştirmek gibi akışkan gücünü yönlendirmeye olanak tanır.Cam kaplama için kullanılan akrilamid cilt yoluyla absorbe edebilirsiniz bir nörotoksin olduğunu. Riski en aza indirmek için eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü gibi uygun koruyucu donanımları takın.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Fluid Mechanics

SCIENTISTS IN ACTION

Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water

Su Supramoleküler Polimerlerin Boyut, Şekil ve Stabilite Kontrolü

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult1. At the same time, the ability to do ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Çoklu kamera Işık Alanı Görüntüleme aracılığıyla 3D Akış Alanları Belirleme

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

Sınırlanmamış ve Sınırlı Yüzey Aktif Bazlı Kesme Viskoelastik Sıvılarda Küresel Parçacıkların Yerleşme Hızının Deneysel Ölçümü

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

1-2 Düzlem Flow-Küçük Açı Nötron Saçılma kullanma Malzeme Mikroyapı altında Akış Ölçme

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Fabrication of Uniform Nanoscale Cavities via Silicon Direct Wafer Bonding

Silikon Doğrudan Gofret Yapıştırma ile Tek tip Nano ölçekli Boşlukların İmalatı

Measurements of the heat capacity and superfluid fraction of confined 4He have been performed near the lambda transition using lithographically patterned ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Non-Newtonian Akışkanlar Bırak Etkisi Dynamics Eğitim Hızlı Görüntüleme Tekniği

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Writing and Low-Temperature Characterization of Oxide Nanostructures

Yazma ve Oksit Nanoyapıların Düşük Sıcaklık Karakterizasyonu

Oxide nanoelectronics is a rapidly growing field which seeks to develop novel materials with multifunctional behavior at nanoscale dimensions.  Oxide ...

Visualizing Hyporheic Flow Through Bedforms Using Dye Experiments and Simulation

Boya Deneyler ve Simülasyonu kullanarak yatak oluşumları sayesinde Hyporheic Akışı görselleştirme

Advective exchange between the pore space of sediments and the overlying water column, called hyporheic exchange in fluvial environments, drives solute ...

Characterization of Full Set Material Constants and Their Temperature Dependence for Piezoelectric Materials Using Resonant Ultrasound Spectroscopy

Tam Set Malzeme sabitleri Karakterizasyonu ve rezonans Ultrason Spektroskopisi kullanarak Piezoelektrik Malzemelerin Onların Sıcaklık Bağımlılığı

During the operation of high power electromechanical devices, a temperature rise is unavoidable due to mechanical and electrical losses, causing the ...