Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Vi takker Xiao-Rong Peng og Stefan Hallen for at have skaffet ressourcer og optimeret adipocytisolationen Martin Uhrbom for teknisk bistand, og Daniel Olausson og Malin Lönn for at koordinere og levere den menneskelige fedt.

Anonyme prøver af fedtvæv blev indsamlet fra maveregionen af kvindelige patienter, der gennemgik elektiv kirurgi på Sahlgrenska Universitetshospital i Göteborg, Sverige. Alle forsøgspersoner modtog skriftlige og mundtlige oplysninger, før de gav skriftligt informeret samtykke til brugen af vævet. Undersøgelserne blev godkendt af The Regional Ethical Review Board i Göteborg, Sverige.
BEMÆRK: Der findes en oversigt over metoden i figur 1.
1. Forberedelse af buffere, vævkultur medier, og kultur plader
<ol><li>Forbered en 5x Krebbs Ringer (KR) lager ved at opløse 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4,og 1,48 g MgSO4·7H2O i 900 ml vand. Der tilsættes 1,84 g CaCl2·2H2O, og volumenet justeres til 1 L ved at tilsætte vand. Sterilt filter gennem et filter på 0,22 μm og opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Fra 5x KR lager, forberede 1 L buffer indeholdende 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glukose, og 2% kvæg serum albumin (BSA) (benævnt det i det følgende benævnt vaske buffer). Juster pH til 7,4.</li>
	<li>Forbered 500 ml kollagen buffer, der indeholder 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2,2% BSA, og 450 ml vand (benævnt i det følgende som fordøjelse buffer). BEMÆRK: Kollagennase bør ikke føjes til fordøjelsesbufferen, før fedtvævet er blevet vejet i trin 2.2.</li>
	<li>Juster pH-værdien af Medium 199 til 7,4.</li>
	<li>Sterilt filter både buffere og medium 199 gennem en 0,22 μm filterkolbe og varm til 37 °C. BEMÆRK: For at spare tid kan vævskulturmediet tilberedes og tilføjes til plader, før de behandler fedtvævet. For et 24-brønds pladeformat (Figur 1A) skal du bruge 0,5−1 ml/brønd af Dulbeccos modificerede Eagles medium/Hams næringsstofblanding F12 (DMEM/F12), 10 % føtal kvægserum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (penn/strep) og 20 nM insulin. Små molekyler og andre stabile farmakologiske agenser kan også tilsættes på dette tidspunkt til medierne i det ønskede layout. Pladerne anbringes i en vævskulturkuvøse (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>2. Dissektion af humant subkutan fedtvæv
BEMÆRK: Arbejd i et biologisk sikkerhedsskab, og brug steril teknik gennem hele isolationsprocessen samt eksklusiv brug af autoclaved og sterilt udstyr.
<ol><li>Placer det menneskelige fedtvæv i en 15 cm petriskål og tilsæt en lille mængde medium 199 for at holde det fugtet under dissektion.</li>
	<li>Arbejde med stykker af fedt omtrent på størrelse med en golfbold, greb store fibrotiske fartøjer med pincet og forsigtigt frigive adipocytter ved at skrabe fedt med bagsiden af lukkede saks. Kassér de store stykker fibrotisk væv. Afvej det trimmede fedt.</li>
</ol>3. Behandling af kollagen
<ol><li>Tilføj kollagennase til fordøjelsesbufferen (se trin 1.3) ved en koncentration på 1 mg/ml. Sterilt filter opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm sterilt filter. BEMÆRK: Tre ml fordøjelsebuffer pr. gram fedt anbefales (dvs. for 100 g fedt, forbered 300 ml fordøjelsesbuffer med 300 mg type 2 kollagen). FORSIGTIG: Type 2 Collagenase er farligfor øjnene, huden og kan forårsage irritation af luftvejene. Bær handsker, øjenbeskyttelse, og arbejd i en ventileret hætte, når du håndterer kollagen.</li>
	<li>Flyt ca. 10 g fedtvæv til en 15 cm petriskål og hakke fedtet omhyggeligt ved hjælp af et par buede saks, indtil det bliver en glat homogen blanding, og der er ingen store stykker fedt tilbage. Gentag processen, indtil alt fedtet er blevet forarbejdet. BEMÆRK: Hver runde skal tage ca. 2 min, og fedtstykkerne skal være små nok, så de kan pipetteres ved hjælp af en bredboret pipettespids. Dette trin er afgørende for at give høj kvalitet adipocytter. Hvis brikkerne er for store, vil fordøjelsestiden skal forlænges, hvilket kompromitterer celleviabilty.</li>
	<li>Overfør hakket fedt i 50 ml koniske rør ved hjælp af en ske. Tilføj 10 ml hakket væv og 30 ml fordøjelsesbuffer til hvert rør. Skaler ned til passende mængder, hvis der er mindre end 10 ml hakket fedt.</li>
	<li>Vævet fordøjes ved 37 °C i en rystende kuvøse med konstant omrøring ved 150 omdr./min. i 30−45 min. Efter 30 min, kontrollere processen hver 5 min for at undgå over-fordøjelse. BEMÆRK: Fordøjelsen er færdig, når fedtopløsningen er homogen uden store stykker og har en abrikosfarve.</li>
</ol>4. Filtrering af cellesuspensionen og rensningen af de modne adipocytter
<ol><li>Placer en tragt oven på en 1 L steril kolbe, og anbring et sterilt 250 μm meshfilter inde i tragten. Hæld den fordøjede fedtopløsning i filteret for at fjerne det ufordøjede væv.</li>
	<li>Når alle adipocyte suspensionen er passeret gennem filteret, forsigtigt klemme mesh filter for at øge udbyttet af adipocytter. Hæld ca. 50−100 ml vaskebuffer i filteret for at skylle den og klemme filteret igen.</li>
	<li>Hæld den isolerede adipocyte suspension fra kolben i en separation tragt og tilsæt vask buffer, indtil tragten er næsten helt fyldt. Vend forsigtigt tragten et par gange for at blande adipocytsuspensionen med bufferen.</li>
	<li>Lad suspensionen stå i 2−3 min, indtil der er en særskilt adskillelse på 2 lag(figur 1B),med et topgult lag, der indeholder de modne adipocytter og frie lipider og et bundlag, der indeholder bufferen og den fedte stroma vaskulære fraktion (SVF).</li>
	<li>Åbn dysen på separationstragten, og udluft langsomt bundopløsningen til en steril kolbe (celler fra SVF kan pelleteres og opsamles efter centrifugering ved 200 x g i 7 min). Hold det øverste lag med de modne adipocytter i separationstragten.</li>
	<li>Gentag vaskeprocessen i trin 4.3−4.5 tre gange for grundigt at vaske de modne adipocytter og fjerne alle kollagenerne.</li>
</ol>5. Pakning af de modne adipocytter
<ol><li>Åbn dysen og saml den rensede modne adipocyte suspension i 50 ml koniske rør.</li>
	<li>Pak let de modne adipocytter ved at dreje rørene med 50 x g i 3 min.</li>
	<li>Brug en 18 G-nål og en sprøjte til at fjerne den resterende vaskebuffer under adipocytesuspensionen.</li>
	<li>Fjern det frie lipidlag (olie fra den lille del af adipocytter, der brød under isolationsproceduren) og flyder oven på de modne adipocytter ved hjælp af en pipette. BEMÆRK: For at reducere risikoen for, at adipocytter vil dryppe membranerne i trin 6.5, er det vigtigt, at lipidlaget og alle vaskebufferer er blevet fjernet, når de modne adipocytter er seedet på membraner. Af denne grund indsamle adipocytter i 3 rør. De prøver, der indsamles sidste vil have den mest fremførbare lipid og vil derfor være af den laveste kvalitet. Men med omhyggelig pipettering disse prøver kan anvendes.</li>
</ol>6. Seedning af modne adipocytter
<ol><li>Åbn pakken, der indeholder de gennemtrængelige membranskær (Materialetabellen) og udtag membrankomponenten. Vend den på hovedet og læg den på en steril overflade, så membranerne vender mod loftet.</li>
	<li>Pipette 30 μL emballeret modne adipocytter på hver af membranerne (figur 1C). Undgå at røre membranen med spidsen. Brug bredborepipettespidser til at frø cellerne, eller brug en saks til at afskære et lille stykke pipettespids for at gøre den bredere.</li>
	<li>Forsigtigt vende de 50 ml rør med pakket adipocytter flere gange i hele seedning proces for at sikre en jævn fordeling af adipocytter med forskellige størrelser.</li>
	<li>Bring de forberedte flerbrøndplader, der indeholder medierne fra rugemaskinen, til biosikkerhedsskabet og fjern lågene. Saml membranerne, der er seedet med adipocytter, og tag den fra bunden, så den kan vendes i trin 6.5.</li>
	<li>I en jævn bevægelse invertere membranerne med adipocytter på toppen, således at de seedede adipocytter nu vender nedad (Figur 1D). Sænk pladen med adipocytter i de brønde, der indeholder medier (figur 1E).</li>
	<li>Læg låget på pladen og overfør forsigtigt pladen til en vævskulturkurøse. Undgå hurtig bevægelse af pladen, da adipocytter nemt kan løsnes i første omgang. BEMÆRK: Det tager et par dage for cellerne at holde sig mere fast til membranen.</li>
</ol>7. Vedligeholdelse af Adipocytter og høst til analyse
<ol><li>Skift medierne mindst hver 7. Fjern og tilføj medier via udskæringshullet i hver membranindsats. For at fjerne mediet skal du bruge en sprøjte og en nål, en aspirerende tryllestav eller en pipette med p200-spids. Hvis du vil tilføje medier, skal du bruge en pipette og langsomt pipette nye medier ind i brøndene langs siden af væggen for at undgå at forstyrre adipocytter. BEMÆRK: Adipocytter har været dyrket i 2 uger med et medieskift efter 7 dage. Forskellige fedtoprindelser og eksperimentelle spørgsmål kan dog drage fordel af øgede medieændringer.</li>
	<li>Hvis du vil høste RNA, skal du fjerne mediet som beskrevet i trin 7.1 og tilsættes 500 μL lysisbuffer (Materialetabel) direkte i brøndene til at lyse cellerne. For at fastsætte cellerne til billeddannelse, tilføje formaldehyd direkte til brønden ved en endelig koncentration på 1%. BEMÆRK: Cellerne kan derefter opbevares ved 4 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC) er en ny metode til den langsigtede kultur af frisk isolerede modne adipocytter. Ved oprettelsen af MAAC er der et par kritiske trin i protokollen, der i høj grad påvirker udbyttet, kvaliteten og levedygtigheden af de modne adipocytter. En stor indsats bør sættes i hakke fedt i trin 3,2, da dette trin direkte påvirker den tid adipocytter er udsat for kollagen. Hvis fedtstykkerne er for store, skal fordøjelsestiden forlænges, hvilket påvirker cellernes levedygtighed negativt. Omvendt, hvis vævet behandles for fint med en saks, levedygtighed kan påvirkes så godt. For en vellykket kultur af modne adipocytter som MAAC, bør man være særlig opmærksom på følgende trin: for en vellykket seedning af adipocytter på membranerne, er det afgørende, at gratis lipid og fremførsel vask buffer fjernes fra de modne adipocytter i trin 5.3 og 5.4. Resterende lipid eller vask buffer vil reducere overfladen spænding adipocytter og øge risikoen for adipocytter dryppende-off membranerne, når de er vendt. Når adipocytter er seedet og i medierne, forbliver cellerne i kontakt med membranen primært gennem opdrift, og dermed anbefales en langsom og blid teknik, når medierne skifter til ikke at miste celler. Fjern medier fra bunden af brøndene som beskrevet i trin 7.1, og tilføj medier ved langsomt at pipettere medier ned ad siderne af væggene. Endelig er et forslag til tidsbesparelse at forberede pladerne med medier og behandlinger før adipocyte isolationsprocessen. Især for komplekse eksperimentelle designs, pre-forberede pladerne kan spare meget tid og sikrer, at adipocytter er placeret i medierne med deres behandlinger, så snart de er isoleret.
En fordel ved at bruge MAAC i forhold til at differentiere preadipocytter er, at MAAC medier, der anvendes, er meget enkel og kræver ikke en ufysiologisk hormon cocktail. Her har vi dyrket MAAC i glukose-rige medier (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, og 20 nM insulin. Vigtigere er det, vi har konstateret, at insulin er absolut nødvendig for rosiglitazone / pioglitazone drevet induktion af UCP110. Insulin er dog ikke forpligtet til at opretholde cellernes adipogene fænotype. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål kan insulin derfor medtages eller udelades.
Proceduren beskrevet ovenfor er blevet optimeret til isolering og kultur af menneskelige adipocytter. Men, mus, og muligvis andre organisme adipocytter, kan også dyrkes som MAAC. Hvis mus adipocytter skal dyrkes som MAAC der er yderligere overvejelser og forholdsregler, der bør holdes i tankerne. Vi har konstateret, at modne adipocytter fra mus er langt mere skrøbelige end dem fra mennesker. Som følge heraf bør fordøjelsestiden forkortes til et absolut minimum for at øge cellelevedygtigheden. Vi fandt også ud af, at adipocytter fra unge mus (8 uger gamle og yngre) gav de mest robuste og reproducerbare resultater. Endelig kan mus MAAC dyrkes i op til en uge, men da deres adipogene fænotype synes mindre stabil end mennesker (som kan dyrkes gennem mindst to uger) anbefaler vi dyrkning mus MAAC for den mindste nødvendige tid til at løse eksperimentelle spørgsmål.
Da MAAC-modellen er baseret på brug af gennemtrængelige membraner, er en fordel ved denne teknik muligheden for at sammensmelte modne adipocytter med andre celletyper. Vi har tidligere vist evne til modne adipocytter og makrofager til krydstale gennem brug af MAAC10. Dette åbner mulighed for yderligere at udforske forbindelsen mellem fedme, insulinresistens, og immunrespons15,16,17. Fremtidige eksperimenter kan omfatte andre celletyper såsom hepatocytter, preadipocytter, endotelceller eller pancreasceller for yderligere at øge kompleksiteten og den translationelle relevans af MAAC-modellen og undersøge krydstale mellem flere celletyper.
Selv om MAAC har vist sig at være overlegen i forhold til at opretholde funktionalitet og identitet adipocytter i forhold til andre adipocyte in vitro modeller, det har også begrænsninger, der skal overvejes. I forhold til at bruge adipocytter differentieret fra prækursorceller, MAAC er en mere besværlig og tidskrævende model. Plader med membraner er også dyrere i forhold til almindelige cellekulturplader. Det er vigtigt, at modne adipocytter skal være friskisolerede hver gang ved såning og kan ikke udvides eller fryses til bestande som prækursorceller. Dette kræver således at have adgang til friske hvide fedtvævsprøver, men tilføjer også et kompleksitetsniveau, der stammer fra donor til donorvariationer.
Her har vi fremlagt en detaljeret protokol for isolering af modne menneskeadipocytter og opsætning af MAAC. Vi har vist, at adipocytter dyrket som MAAC forbliver levedygtige gennem to uger, deres adipogene gensignatur bevares, og de reagerer på forskellige farmakologiske agonisme. Brug AF MAAC giver mulighed for undersøgelse af cross-talk betweeen adipocytter og andre celletyper, og vurderingen af langsigtede fænotypiske ændringer af modne adipocytter som reaktion på forskellige stimuli.

Den verdensomspændende stigning i fedme og fedme-relaterede co-morbiditeter kræver udvikling af nye terapeutiske. Hvidt fedtvæv (WAT) er en vigtig regulator af hele kroppen stofskifte, energi homøostase, og er en central aktør i udviklingen af insulinresistens og type 2 diabetes (T2D)1,2. Under kronisk overskydende kalorieforbrug, adipocytter udvide til at håndtere overskuddet af energi. Men, adipocyte lipid lagerkapacitet kan blive overskredet, hvilket resulterer i en stigning i cirkulerende niveauer af fedtsyrer og øget opbevaring i perifere ikke-fedtvæv og fører til lipotoksicitet3,4.
Manglen på adipocyte in vitro-modeller med høj translationel relevans er en central udfordring i udviklingen af nye behandlinger for fedme og T2D. Ex vivo explant model, hvor små stykker fedtvæv er dyrket, er forbundet med hurtige ændringer i adipogene genekspression drevet af hypoxi og betændelse5,6. Loftkulturer (CC'er), hvor modne adipocytter flyder og klæber til toppen af mediefyldte kolber, hurtigt dedifferentieres til fibroblastlignende celler, der mangler lipid7,8,9,10. Den mest almindeligt anvendte model er adipocytter differentieret in vitro fra engagerede prækursorer. De differentierede celler er dog morfologisk adskilt fra modne adipocytter in vivo, da de er meget mindre i størrelse og mangler en unilocular lipid dråbe. Andre begrænsninger med denne model omfatter det ufysiologiske behov for en kemisk cocktail for at drive differentiering samt variation i differentieringseffektivitet , som kan påvirkes af en række faktorer11,12,13,14.
Vi har for nylig udviklet membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC), en metode til langsigtet kultur af friskisolerede modne adipocytter, hvor adipocytter er dyrket under gennemtrængelige membraner10. Uvildig analyse af RNA-sekventeringsdata har vist, at maac i forhold til fedtvævsexplanter og in vitro-differentierede adipocytter minder mest om friskisolerede adipocytter. MAAC kan bruges til at dyrke modne adipocytter isoleret fra både subkutane og visceral fedtvæv, samt adipocytter fra både fede og magert emner. Denne metode gør det muligt at studere langsigtede adipocyte fænotypiske ændringer og letter co-kultur af adipocytter med andre celletyper. Her giver vi en detaljeret protokol for isolering af modne adipocytter fra humant fedtvæv, og hvordan man opretter MAAC-systemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

Hvid fedtvæv (WAT) dysregulering spiller en central rolle i udviklingen af insulinresistens og type 2 diabetes (T2D). For at udvikle nye behandlinger for T2D kræves der mere fysiologisk relevante in vitro adipocytemodeller. Denne undersøgelse beskriver en ny teknik til at isolere og kultur modne menneskelige adipocytter. Denne metode har titlen MAAC (membran modne adipocyte samlede kultur), og sammenlignet med andre adipocyte in vitro modeller, MAAC besidder en adipogenic gensignatur, der er tættest på frisk isolerede modne adipocytter. Ved hjælp af MAAC, kan adipocytter dyrkes fra magert og fede patienter, forskellige fedt depoter, co-kulturmed forskellige celletyper, og vigtigere, kan holdes i kultur i 2 uger. Funktionelle eksperimenter kan også udføres på MAAC herunder glukose optagelse, lipogenese, og lipolyse. Desuden reagerer MAAC robust på forskellige farmakologiske agonisme og kan bruges til at studere adipocyte fænotypiske ændringer, herunder transdifferentiering af hvide adipocytter i brunlignende fedtceller.

Modne adipocytter dyrket som MAAC bevarer deres funktion, fænotype, og kan bruges til at studere adipocyte svar på forskellige farmakologiske behandlinger. Efter 1 uges kultur MAAC isoleret fra subkutan fedtvæv opretholde den karakteristiske unilocular lipid dråbe findes kun i modne adipocytter (Figur 2A). MAAC blev dyrket i 1 uge, mens behandlet med enten PPARγ agonister rosiglitazone (Rosi) og pioglitazone (Pio), eller glukokortikoide receptor (GR) agonist dexamethason (Dex) at afgøre, om forskellige nukleare hormon receptor (NHR) agonister drev forudsagte ændringer i downstream gener mål i MAAC. Rosi og Pio øgede ekspressionen af PPARγ responsive gener FABP4 og LPL med henholdsvis 4 og 2−3 gange, mens dexamethason ikke havde nogen effekt (figur 2B). Tilsvarende dexamethason robust kørte genekspression af GR mål gener APOD og FKBP5 med 13- og 55-fold henholdsvis, mens PPARγ agonists havde ingen væsentlige virkninger. Vi har tidligere vist, at friskisolerede menneskelige modne hvide adipocytter kan differentiere sig til en brun-lignende fænotype i MAAC, når de behandles med Rosi10. En 7 dages behandling med Rosi eller Pio induceret genekspression af det brune fedtspecifikke gen UCP1 med 44-65 gange, samt øget ekspressionen af den brune fedtmarkør PDK4 12-18 fold (Figur 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Figur 1: Visuelt diagram over MAAC-opsætning. (A) Forberedelse af medium. (B) Isolering og pakning af modne adipocytter. (C) Såning modne adipocytter på membraner. (D) Inverterende membraner og samtidig holde adipocytter fastgjort. (E) Sænkning af membranerne i mediet og udskiftning af mediet. Dette tal er blevet ændret fra Harms et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Figur 2: MAAC fastholder unilocular udseende gennem en uge og reagere på forskellige farmakologiske agonisme. (A) Repræsentative 4x og 10x lyse felt billeder af MAAC efter en uge med kultur. Adipocytter, der har en gennemsnitlig diameter på 100 μm med store unilocular lipid dråber er let mærkbar. (B) mRNA-niveauer af PPARγ målgener og glukokortikoidereceptor (GR) er rettet mod gener i MAAC efter 7 dages behandling med køretøj (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) eller dexamethason (Dex). Rosi, Pio og Dex blev alle anvendt ved en endelig koncentration på 10 μM. (C) mRNA-niveauer af brun fedtberigede gener i MAAC efter 7 dages behandling med køretøj (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) eller dexamethason (Dex). Rosi, Pio og Dex blev alle anvendt ved en endelig koncentration på 10 μM. For alle genekspressionsdata blev TATA-bindende protein (TBP) anvendt som en intern normaliseringskontrol. Statistikken blev beregnet ved hjælp af envejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligninger test. (gennemsnitlig ± SD, n = 3, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC) er en ny metode til kultur modne menneskelige adipocytter. Her beskriver vi, hvordan du isolerer adipocytter fra menneskelig fedt, og hvordan du konfigurerer MAAC.

Isolation og kultur af menneskelige modne adipocytter Ved hjælp af membran modne Adipocyte aggregatkulturer (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

En af de udfordringer inden for fedtbiologi har været at opretholde moden adipocyt i kulturen. Vi har udviklet en ny metode, der gør det muligt at studere langsigtet adipocyte gennem store forandringer. Vores adipocyte kultur teknik giver mulighed for undersøgelse af celle interaktioner og vil forhåbentlig være nyttige for udviklingen af nye behandlinger for diabetes og fedme.Det er vigtigt at følge protokollen nøje, da der er nogle kritiske trin, der i høj grad påvirker genkvaliteten og levedygtigheden af de modne adipocytter. For eksempel, før plating sørg for, at alle de frie lipid og vask buffer er blevet fjernet ellers lipocytter kunne rip off, når skær er inverteret. Efter at have modtaget den menneskelige subkutane fedtvævsprøve, placeres vævet i et sterilt biologisk sikkerhedsskab i en 15 centimeter petriskål.Et lille volumen på medium 199 til fadet. Brug pincet til at gribe fat i store fibrotiske fartøjer i vævet og bruge bagsiden af spidsen af en lukket saks til forsigtigt at skrotte fedtet langs fartøjet for at frigive adipocytter. Når alle cellerne er blevet indsamlet kassere de store stykker af fibrotisk væv og vejer det trimmede fedt.For yderligere at frigive cellerne fra fedtvævet, overføre 10 gram fedtvæv i en ny 15 centimeter petriskål og bruge buede saks til omhyggeligt hakke fedtet, indtil det bliver en glat homogen blanding uden store stykker af fedt. Når alt fedtet er blevet behandlet, skal du bruge en ske til at overføre 10 milliliter hakket væv til individuelle 50 milliliterrør og tilsæt 30 milliliter fordøjelsesbuffer til hvert rør. Derefter anbringes rørene i en rystende inkubator ved 37 grader Celsius og 150 rotationer i minuttet i 30 til 35 minutter.Fordøjelsen er færdig, når fedtopløsningen er homogen, abrikosfarvet og fraværende af store stykker. I slutningen af fordøjelsen dekanteres den fordøjede fedtopløsning i et 250 mikrometermaskefilter inde i en tragt, der er sat i steril en liter kolbe. Når hele volumen af adipocyt suspension er blevet undgået, blid klemme mesh filter for at øge udbyttet af adipocytter og vaske filteret med 50 til 100 milliliter vask buffer før klemme filteret igen.Den isolerede adipocytopløsning overføres til en separationstragt, og der tilsættes vaskebuffer, indtil tragten er næsten helt fyldt. Inverter forsigtigt tragten et par gange for at blande adipocytaffringen med bufferen og lad suspensionen stå i to til tre minutter, indtil der er en tydelig adskillelse af lagene. Når lagene er adskilt, åbnes dysen på tragten, og bundopløsningen langsomt slæbes ud i en steril kolbe.Når alle kollagenase er blevet fjernet, indsamles den rensede modne adipocyt opløsning i 50 milliliter koniske rør og let pakke cellerne ved centrifugering. Brug derefter en 10 milliliter sprøjte udstyret med en 18 gauge nål til at fjerne de resterende vask buffer under adipocyt suspension og bruge en pipette til at fjerne den frie lipid lag flyder over de modne adipocytter. Til såning af de modne adipocytter anbringes den gennemtrængelige membranindføringskomponent på hovedet på en steril overflade og let invertere rørene i pakkede adipocytter et par gange for at sikre en jævn fordeling af cellerne.Ved hjælp af en bred borepipettespids tilsættes 30 mikroliter af pakkede modne adipocytter på hver membran. Inverter skærpanelet i én jævn bevægelse, så de seedede adipocytter er i bunden af skærene. Placer panelet af skær i en 24 godt plade, der indeholder 500 til 1, 000 mikroliter af komplet 37 grader Celsius medium per brønd.Derefter dække pladen og forsigtigt placere pladen i et væv kultur inkubator. Hver syvende dag i kultur, erstatte mediet via udskæring hul i hver indsats. Efter en uges kultur opretholder modne adipocytaggregater, der er isoleret fra subkutan fedtvæv, den karakteristiske unilocular lipiddråbemorfologi, der kun observeres i modne adipocytter.Behandling med PPAR-GAMMA agonister pioglitazon og rosiglitazone resulterer i et øget udtryk i PPAR-GAMMA responsive gener, mens behandling med glukokortikoid receptor agonist dexamethason har ingen effekt på disse gener. Tilsvarende glukokortikoide receptor agonist robust drev genekspression af glukokortikoid receptor mål gener, mens PPAR-GAMMA agonister har ingen signifikante virkninger på disse gener. Desuden fremkalder syv dages behandling med PPAR-GAMMA agonister robust genekspressionen af det brune fedtspecifikke gen, UCP1.Vores nye adipocyt in vitro model kan bruges til de funktionelle undersøgelser i modne adipocytter, herunder glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse. Med denne nye adipocyte kultur teknik, vi har været i stand til at vise, at menneskelige modne hvide adipocytter kan transdifferentiate i brun-lignende adipocytter.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolering af Humane Atrielle Myocytter til samtidige målinger af Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter og membranstrømme

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved<em&gt; In vitro</em&gt; RNA Pull-down i fedtcellerne Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Måling af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskulatur fra mus

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og berigelse af humane lungeepitelceller til organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...