Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Nous remercions Xiao-Rong Peng et Stefan Hallen d’avoir fourni des ressources et d’avoir optimisé l’isolement des adipocytes, Martin Uhrbom pour son assistance technique, et Daniel Olausson et Malin Lunn d’avoir coordonné et fourni l’adipose humaine.

Des échantillons anonymes de tissu adipeux ont été prélevés dans la région abdominale de patientes subissant une chirurgie élective à l’hôpital universitaire Sahlgrenska de Gothenburg, en Suède. Tous les sujets de l’étude ont reçu des renseignements écrits et oraux avant de donner un consentement éclairé écrit à l’utilisation du tissu. Les études ont été approuvées par le Regional Ethical Review Board de Gothenburg, en Suède.
REMARQUE : Un aperçu de la méthode est fourni à la figure 1.
1. Préparation des tampons, des médias de culture de tissu, et des plaques de culture
<ol><li>Préparer un stock de 5x Krebbs Ringer (KR) en dissolvant 35,1 g de NaCl, 1,75 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, et 1,48 g de MgSO4'7H2O dans 900 ml d’eau. Ajouter 1,84 g de CaCl2x 2H2O et ajuster le volume à 1 L en ajoutant de l’eau. Filtre stérile à travers un filtre de 0,22 m et entreposez-le à 4 oC.</li>
	<li>À partir du stock de 5x KR, préparer 1 L de tampon contenant 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM de glucose, et 2% d’albumine de sérum bovin (BSA) (appelé ci-après tampon de lavage). Ajuster le pH à 7,4.</li>
	<li>Préparer 500 ml de tampon de collagène contenant 1x HBSS - CaCl2 - MgCl2, 2% BSA, et 450 ml d’eau (appelé ci-après comme tampon de digestion). REMARQUE : Le collagène ne doit pas être ajouté au tampon de digestion jusqu’à ce que le tissu adipeux ait été pesé à l’étape 2.2.</li>
	<li>Ajuster le pH de Medium 199 à 7.4.</li>
	<li>Filtre stérile à la fois tampons et moyenne 199 à travers un flacon de filtre de 0,22 m et chaud à 37 oC. REMARQUE : Pour gagner du temps, le support de culture tissulaire peut être préparé et ajouté aux plaques avant de traiter le tissu adipeux. Pour un format de plaque de 24 puits (figure 1A), utilisez 0,5 à 1 ml/puits du mélange f12 /Ham’s nutrient mix F12 (DMEM/F12) modifié de Dulbecco et 20 nM d’insuline. De petites molécules et d’autres agents pharmacologiques stables peuvent également être ajoutés à ce moment-là aux médias dans la disposition désirée. Placer les plaques dans un incubateur de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).</li>
</ol>2. Dissection du tissu adipeux sous-cutané humain
REMARQUE : Travaillez dans un coffret de sécurité biologique et utilisez une technique stérile tout au long du processus d’isolement, ainsi que l’utilisation exclusive d’équipements autoclaved et stériles.
<ol><li>Placez le tissu adipeux humain dans un plat de pétri de 15 cm et ajoutez un petit volume de 199 pour le garder hydraté pendant la dissection.</li>
	<li>En travaillant avec des morceaux d’adipeux d’environ la taille d’une balle de golf, saisissez de grands vaisseaux fibrotiques avec des pinces et relâchez doucement les adipocytes en grattant l’adipose avec le dos des ciseaux fermés. Jeter les gros morceaux de tissu fibrotique. Peser la graisse parée.</li>
</ol>3. Traitement de la collagène
<ol><li>Ajouter du collagène au tampon de digestion (voir l’étape 1.3) à une concentration de 1 mg/ml. Filtre stérile la solution à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 m. REMARQUE : Trois ml de tampon de digestion par gramme de graisse sont recommandés (c.-à-d. pour 100 g de graisse, préparer 300 mL de tampon de digestion avec 300 mg de collagène de type 2). CAUTION: La collagène de type 2 est dangereux pour les yeux, la peau et peut causer une irritation respiratoire. Portez des gants, une protection oculaire et travaillez dans une hotte ventilée lors de la manipulation de la collagène.</li>
	<li>Déplacer environ 10 g de tissu adipeux dans un plat de pétri de 15 cm et émincer soigneusement la graisse à l’aide d’une paire de ciseaux incurvés jusqu’à ce qu’il devienne un mélange homogène lisse et il n’y a plus de gros morceaux d’adipose. Répétez le processus jusqu’à ce que toute la graisse ait été traitée. REMARQUE : Chaque tour devrait prendre environ 2 min et les morceaux d’adipose doivent être assez petits pour qu’ils puissent être pipetted utilisant une pointe de pipette large-bore. Cette étape est cruciale pour produire des adipocytes de haute qualité. Si les morceaux sont trop grands, les temps de digestion devront être prolongés, compromettant la viabilty de cellules.</li>
	<li>Transférer la graisse hachée dans des tubes coniques de 50 ml à l’aide d’une cuillère. Ajouter 10 ml de tissu haché et 30 ml de tampon de digestion à chaque tube. Réduire à des volumes appropriés si moins de 10 ml de gras haché est disponible.</li>
	<li>Diger le tissu à 37 oC dans un incubateur secouant avec une agitation constante à 150 tr/min pendant 30 à 45 min. Après 30 min, vérifiez le processus toutes les 5 min pour éviter la surdigestion. REMARQUE: La digestion est complète lorsque la solution adipeuse est homogène sans gros morceaux et a une couleur abricot.</li>
</ol>4. Filtration de la suspension cellulaire et de la purification des adipocytes matures
<ol><li>Placez un entonnoir sur un flacon stérile de 1 L et placez un filtre stérile à mailles de 250 m à l’intérieur de l’entonnoir. Verser la solution de graisse digérée dans le filtre pour enlever le tissu non digéré.</li>
	<li>Lorsque toute la suspension de l’adipocyte a traversé le filtre, presser doucement le filtre à mailles pour augmenter le rendement des adipocytes. Verser environ 50 à 100 ml de tampon de lavage dans le filtre pour le rincer et presser à nouveau le filtre.</li>
	<li>Verser la suspension isolée d’adipocyte du flacon dans un entonnoir de séparation et ajouter le tampon de lavage jusqu’à ce que l’entonnoir soit presque complètement rempli. Inverser doucement l’entonnoir à quelques reprises pour mélanger la suspension d’adipocyte avec le tampon.</li>
	<li>Laissez la suspension reposer pendant 2 à 3 minutes jusqu’à ce qu’il y ait une séparation distincte de 2 couches (Figure 1B), avec une couche jaune supérieure contenant les adipocytes matures et les lipides libres et une couche inférieure contenant le tampon et la fraction vasculaire de stroma adipeuse (SVF).</li>
	<li>Ouvrez la buse sur l’entonnoir de séparation, et elpelez lentement la solution inférieure dans un flacon stérile (les cellules de la SVF peuvent être granulées et collectées après centrifugation à 200 x g pendant 7 min). Gardez la couche supérieure avec les adipocytes matures dans l’entonnoir de séparation.</li>
	<li>Répétez le processus de lavage en étapes 4,3 à 4,5 trois fois pour bien laver les adipocytes matures et enlever toute la collagène.</li>
</ol>5. Emballage des adipocytes matures
<ol><li>Ouvrez la buse et ramassez la suspension d’adipocyte mature purifiée en tubes coniques de 50 ml.</li>
	<li>Emballez légèrement les adipocytes matures en faisant tourner les tubes à 50 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Utilisez une aiguille de 18 G et une seringue pour enlever le tampon de lavage restant sous la suspension d’adipocyte.</li>
	<li>Enlever la couche lipidique libre (huile de la petite partie des adipocytes qui se sont brisées pendant la procédure d’isolement) flottant sur les adipocytes matures à l’aide d’une pipette. REMARQUE : Pour réduire le risque que les adipocytes s’égouttent des membranes à l’étape 6.5, il est important que la couche lipidique et tous les tampons de lavage aient été enlevés lorsque les adipocytes matures sont enseisés sur les membranes. Pour cette raison, recueillir les adipocytes dans 3 tubes. Les échantillons qui sont recueillis en dernier auront le plus de lipides de report et seront donc de la plus faible qualité. Cependant, avec pipetting soigneux ces échantillons peuvent être utilisés.</li>
</ol>6. Ensemencement d’adipocytes matures
<ol><li>Ouvrez l’emballage contenant les inserts de membrane perméables (Tableau des matériaux) et sortez le composant de membrane. Retournez-le à l’envers et placez-le sur une surface stérile afin que les membranes fassent face au plafond.</li>
	<li>Pipette 30 l d’adipocytes matures emballés sur chacune des membranes (Figure 1C). Évitez de toucher la membrane avec la pointe. Utilisez des pointes de pipette à large serge pour ensemencer les cellules, ou utilisez des ciseaux pour couper un petit morceau d’une pointe de pipette pour la rendre plus large.</li>
	<li>Inverser délicatement les tubes de 50 ml avec des adipocytes emballés plusieurs fois tout au long du processus d’ensemencement afin d’assurer une distribution uniforme des adipocytes de différentes tailles.</li>
	<li>Apportez les plaques multipuits préparées contenant le support de l’incubateur à l’armoire de biosécurité et retirez les couvercles. Ramassez les membranes ensemencées d’adipocytes et saisissez-les par le bas afin qu’il puisse être inversé à l’étape 6.5.</li>
	<li>Dans un mouvement lisse inverser les membranes avec les adipocytes sur le dessus de sorte que les adipocytes enseçants sont maintenant tournés vers le bas (Figure 1D). Abaissez la plaque avec des adipocytes dans les puits contenant des supports (Figure 1E).</li>
	<li>Placez le couvercle sur la plaque et transférez soigneusement la plaque dans un incubateur de culture tissulaire. Évitez le mouvement rapide de la plaque puisque les adipocytes peuvent facilement être délogés au début. REMARQUE : Il faut quelques jours pour que les cellules adhèrent plus fermement à la membrane.</li>
</ol>7. Entretien des adipocytes et récolte pour analyse
<ol><li>Changez les médias au moins tous les 7 jours. Retirer et ajouter le support par le trou de découpe dans chaque insert de membrane. Pour enlever le support, utilisez une seringue et une aiguille, une baguette aspirante ou une pipette avec une pointe p200. Pour ajouter des supports, utilisez une pipette et faites lentement la pipette de nouveaux médias dans les puits le long du côté du mur pour éviter de déranger les adipocytes. REMARQUE : Les adipocytes ont été cultivés pendant 2 semaines avec un changement de médias après 7 jours. Cependant, différentes origines adipeuses et questions expérimentales peuvent bénéficier de changements médiatiques accrus.</li>
	<li>Pour récolter l’ARN, retirez le support tel que décrit à l’étape 7.1, et ajoutez 500 l de tampon de lyse (Tableau des Matériaux) directement dans les puits pour lyser les cellules. Pour fixer les cellules pour l’imagerie, ajouter le formaldéhyde directement au puits à une concentration finale de 1%. REMARQUE : Les cellules peuvent alors être stockées à 4 oC.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. 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Les auteurs n’ont rien à révéler.

La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture à long terme des adipocytes mûrs fraîchement isolés. Lors de la mise en place de MAAC, il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui ont un impact considérable sur le rendement, la qualité et la viabilité des adipocytes matures. Beaucoup d’efforts devraient être mis dans le calcul de la graisse dans l’étape 3.2 puisque cette étape influence directement la quantité de temps les adipocytes sont exposés à la collagène. Si les morceaux d’adipose sont trop grands, le temps de digestion devra être prolongé, ce qui aura un impact négatif sur la viabilité des cellules. Inversement, si le tissu est traité trop finement avec des ciseaux, la viabilité peut également être affectée. Pour la culture réussie des adipocytes mûrs comme MAAC, on devrait accorder une attention particulière aux étapes suivantes : pour l’ensemencement réussi des adipocytes sur les membranes, il est crucial que le tampon libre de lavage de lipide et de report soit enlevé des adipocytes mûrs dans les étapes 5.3 et 5.4. Le reste des lipides ou tampon de lavage réduira la tension de surface des adipocytes et augmentera le risque que les adipocytes s’égouttent les membranes lorsqu’elles sont retournées. Lorsque les adipocytes sont ensedus et dans les médias, les cellules restent en contact avec la membrane principalement par flottabilité, donc une technique lente et douce est recommandée lors du changement de médias pour ne pas perdre de cellules. Retirez les supports du fond des puits tels que décrits à l’étape 7.1 et ajoutez des supports en pipetting lentement les médias sur les côtés des murs. Enfin, une suggestion de gain de temps est de préparer les plaques avec des médias et des traitements avant le processus d’isolement des adipocytes. En particulier pour les conceptions expérimentales complexes, la préparation des plaques peut faire gagner beaucoup de temps et garantit que les adipocytes sont placés dans les médias avec leurs traitements dès qu’ils sont isolés.
Un avantage de l’utilisation de MAAC par rapport à la différenciatisation des préadipocytes est que le média MAAC utilisé est très simple et ne nécessite pas un cocktail d’hormones non physiologiques. Ici, nous avons cultivé MAAC dans les médias riches en glucose (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn/strep, et 20 nM d’insuline. Fait important, nous avons constaté que l’insuline est absolument nécessaire pour la rosiglitazone / pioglitazone conduit induction de UCP110. L’insuline, cependant, n’est pas nécessaire pour maintenir le phénotype adipogenic des cellules. Ainsi, selon la question expérimentale, l’insuline peut être incluse ou omise.
La procédure détaillée ci-dessus a été optimisée pour l’isolement et la culture des adipocytes humains. Cependant, la souris, et peut-être les adipocytes d’autres organismes, peut également être cultivée comme MAAC. Si les adipocytes de souris doivent être cultivés comme MAAC il y a des considérations et des précautions additionnelles qui devraient être gardées à l’esprit. Nous avons constaté que les adipocytes matures de souris sont beaucoup plus fragiles que ceux des humains. En conséquence, le temps de digestion devrait être raccourci à un minimum absolu pour augmenter la viabilité cellulaire. Nous avons également constaté que les adipocytes de jeunes souris (8 semaines et plus jeunes) ont fourni les résultats les plus robustes et reproductibles. Enfin, la souris MAAC peut être cultivée jusqu’à une semaine, cependant étant donné que leur phénotype adipogénique semble moins stable que les humains (qui peuvent être cultivés pendant au moins deux semaines) nous recommandons de cultiver la souris MAAC pour le temps minimum requis pour traiter questions expérimentales.
Puisque le modèle de MAAC est basé sur l’utilisation des membranes perméables, un avantage de cette technique est la possibilité de co-crepage des adipocytes mûrs avec d’autres types de cellules. Nous avons déjà démontré la capacité des adipocytes et des macrophages mûrs à traverser par l’utilisation de MAAC10. Cela ouvre des possibilités d’explorer davantage le lien entre l’obésité, la résistance à l’insuline et les réponses immunitaires15,16,17. De futures expériences pourraient incorporer d’autres types de cellules tels que les hépatocytes, les préadipocytes, les cellules endothéliales ou les cellules pancréatiques afin d’accroître davantage la complexité et la pertinence translationnelle du modèle MAAC et d’étudier le lien entre plusieurs types de cellules.
Même si LE MAAC s’est avéré supérieur au maintien de la fonctionnalité et de l’identité des adipocytes par rapport à d’autres modèles in vitro d’adipocytes, il a également des limitations qui doivent être considérées. Par rapport à l’utilisation d’adipocytes différenciés des cellules précurseurs, MAAC est un modèle plus laborieux et long. Les plaques avec des membranes sont également plus chères par rapport aux plaques de culture cellulaire régulières. Fait important, les adipocytes matures doivent être fraîchement isolés à chaque fois après l’ensemencement et ne peuvent pas être étendus ou congelés en stocks comme les cellules précurseurs. Ainsi, cela nécessite d’avoir accès à des échantillons de tissus adipeux blancs frais, mais ajoute également un niveau de complexité découlant des variations du donneur au donneur.
Ici, nous avons présenté un protocole détaillé pour isoler les adipocytes matures humains et la mise en place de MAAC. Nous avons démontré que les adipocytes cultivés comme MAAC reste viable pendant deux semaines, leur signature adipogenic de gène est préservée, et ils répondent à l’agonisme pharmacologique divers. L’utilisation de MAAC permet l’étude des adipocytes betweeen et d’autres types de cellules, et l’évaluation des changements phénotypiques à long terme des adipocytes matures en réponse à différents stimuli.

L’augmentation mondiale des comorbidités liées à l’obésité nécessite le développement de nouvelles thérapies. Le tissu adipeux blanc (WAT) est un régulateur important du métabolisme de corps entier, de l’homéostasie d’énergie, et est un acteur central dans le développement de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2 (T2D)1,2. Pendant la consommation excessive chronique de calories, les adipocytes agrandissent pour manipuler le surplus d’énergie. Cependant, la capacité de stockage de lipides d’adipocyte peut devenir dépassée, ayant pour résultat une élévation des niveaux circulants des acides gras et le stockage accru dans les tissus non-adipeuses périphériques et menant à la lipotoxicité3,4.
L’absence de modèles in vitro d’adipocyte s’il y a une grande pertinence translationnelle est un défi majeur dans le développement de nouveaux traitements contre l’obésité et le DT2. Le modèle ex vivo ex vivo explante, où de petits morceaux de tissu adipeux sont cultivés, est associé à des altérations rapides de l’expression génique adipogénique entraînée par l’hypoxie et l’inflammation5,6. Les cultures de plafond (CC) où les adipocytes mûrs flottent et adhèrent au dessus des flacons media-remplis, dédifférencient rapidement en cellules fibroblaste-comme manquant de lipide7,8,9,10. Le modèle le plus couramment utilisé est les adipocytes différenciés in vitro des précurseurs engagés. Les cellules différenciées sont, cependant, morphologiquement distinctes des adipocytes mûrs in vivo puisqu’elles sont beaucoup plus petites dans la taille et manquent d’une gouttelette de lipide uniloculaire. D’autres limitations avec ce modèle incluent le besoin non physiologique d’un cocktail chimique pour conduire la différenciation, aussi bien que la variabilité dans l’efficacité de différenciation qui peut être affectée par un certain nombre de facteurs11,12,13,14.
Nous avons récemment développé la culture d’agrégat d’adipocyte mûr de membrane (MAAC), une méthode pour la culture à long terme des adipocytes mûrs fraîchement isolés, où les adipocytes sont cultivés sous les membranes perméables10. L’analyse impartiale des données de séquençage d’ARN a prouvé que par rapport aux explants adipeux de tissu et aux adipocytes in vitro-différenciés, MAAC est plus semblable aux adipocytes fraîchement isolés. MAAC peut être employé pour la culture des adipocytes mûrs isolés du tissu adipeux sous-cutané et viscéral, aussi bien que des adipocytes des sujets obèses et maigres. Cette méthodologie permet l’étude des changements phénotypiques d’adipocyte à long terme et facilite la co-culture des adipocytes avec d’autres types de cellules. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des adipocytes mûrs du tissu adipeux humain et comment mettre en place le système MAAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

La dysrégulation des tissus adipeux blancs (WAT) joue un rôle central dans le développement de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2 (T2D). Pour développer de nouveaux traitements pour le DT2, des modèles d’adipocytes in vitro plus pertinents sur le plan physiologique sont nécessaires. Cette étude décrit une nouvelle technique pour isoler et culturer les adipocytes humains matures. Cette méthode est intitulée MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), et par rapport à d’autres modèles in vitro adipocytes, MAAC possède une signature génétique adipogénique qui est le plus proche des adipocytes matures fraîchement isolés. En utilisant MAAC, les adipocytes peuvent être cultivés à partir de patients maigres et obèses, différents dépôts adipeux, co-cultivés avec différents types de cellules, et surtout, peuvent être conservés en culture pendant 2 semaines. Des expériences fonctionnelles peuvent également être effectuées sur MAAC, y compris l’absorption de glucose, la lipogénèse et la lipolyse. En outre, MAAC répond vigoureusement à l’agonisme pharmacologique divers et peut être employé pour étudier des changements phénotypiques d’adipocyte, y compris la transdifférenciation des adipocytes blancs dans les adipocytes bruns-comme.

Les adipocytes matures cultivés comme MAAC préserve leur fonction, phénotype, et peuvent être employés pour étudier des réponses d’adipocyte à divers traitements pharmacologiques. Après 1 semaine de culture, le MAAC isolé du tissu adipeux sous-cutané maintient la gouttelette lipidique uniloculaire caractéristique que l’on trouve uniquement dans les adipocytes matures (Figure 2A). MAAC a été cultivé pendant 1 semaine alors qu’il était traité avec les rosiglitazone (Rosi) et pioglitazone (Pio) des agonistes du PPAR (Rosi), ou le récepteur glucocorticoïde (GR) dexaméthasone (Dex) pour déterminer si différents agonistes des récepteurs hormonaux nucléaires (NHR) entraînent des changements prévus dans les gènes cibles en aval dans MAAC. Rosi et Pio ont augmenté l’expression des gènes sensibles de PPARmD FABP4 et LPL de 4 et 2-3 fois, respectivement, tandis que la dexaméthasone n’a eu aucun effet (Figure 2B). De même, la dexaméthasone a fortement conduit l’expression génique des gènes cibles GR APOD et FKBP5 par 13 et 55 fois respectivement, tandis que les agonistes de PPAA n’ont eu aucun effet significatif. Nous avons déjà démontré que les adipocytes blancs matures humains fraîchement isolés peuvent se transdifférencier en un phénotype brun-comme dans MAAC une fois traités avec Rosi10. Un traitement de 7 jours avec Rosi ou Pio a fortement induit l’expression génique du gène UCP1 spécifique à la graisse brune par 44-65 fois, ainsi que l’expression accrue du marqueur de graisse brune PDK4 12-18 fois (Figure 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Figure 1 : Diagramme visuel de configuration MAAC. (A) Préparation du milieu. (B) Isolement et emballage des adipocytes matures. (C) Ensemencement des adipocytes matures sur les membranes. (D) Inverser les membranes tout en gardant les adipocytes attachés. (E) Abaisser les membranes dans le milieu et changer le milieu. Ce chiffre a été modifié à partir de Harms et coll.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Figure 2 : Le MAAC maintient l’apparence uniloculaire pendant une semaine et répond à l’agonisme pharmacologique divers. (A) Représentant 4x et 10x images de champ lumineux de MAAC après une semaine de culture. Les adipocytes d’un diamètre moyen de 100 m avec de grandes gouttelettes lipidiques uniloculaires sont facilement discernables. (B) niveaux d’ARNm des gènes cibles de PPARMD et des gènes cibles de récepteur scocorticoïde (GR) dans MAAC après 7 jours de traitement avec le véhicule (Vehc), la rosiglitazone (Rosi), la pioglitazone (Pio), ou la dexaméthasone (Dex). Rosi, Pio et Dex ont tous été utilisés à une concentration finale de 10 m. (C) niveaux d’ARNm de gènes enrichis de graisse brune dans MAAC après 7 jours de traitement avec véhicule (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio), ou dexaméthasone (Dex). Rosi, Pio et Dex ont tous été utilisés à une concentration finale de 10 M. Pour toutes les données d’expression génique, la protéine liant TATA (TBP) a été utilisée comme contrôle de normalisation interne. Les statistiques ont été calculées à l’aide d’ANOVA à sens unique avec le test de comparaisons multiples de Tukey. (moyenne - SD, n ' 3, 'p 'lt; 'p 'lt; 'lt; 0.01; 'p 'lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture des adipocytes humains mûrs. Ici, nous détaillons comment isoler les adipocytes de l’adipose humain et comment mettre en place MAAC.

Isolement et culture des adipocytes matures humains utilisant les cultures agrégées d’adipocytemûr mûr de membrane (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Un défi dans le domaine de la biologie adipeuse a été de maintenir l’adipocyte mûr dans la culture. Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet l’étude des adipocytes à long terme tout au long de grands changements. Notre technique de culture des adipocytes permet l’étude des interactions cellulaires et nous espérons être utile pour le développement de nouveaux traitements pour le diabète et l’obésité.Il est important de suivre attentivement le protocole car il ya quelques étapes critiques qui ont un impact considérable sur la qualité des gènes et la viabilité des adipocytes matures. Par exemple, avant le placage assurez-vous que tous les lipides libres et tampon de lavage a été enlevé sinon les lipocytes pourraient s’arracher lorsque les inserts sont inversés. Après avoir reçu l’échantillon de tissu adipeux sous-cutané humain, placez le tissu dans une armoire stérile de sécurité biologique dans une boîte de Petri de 15 centimètres.Un petit volume de moyen 199 au plat. Utilisez des pinces à épiler pour saisir les gros vaisseaux fibrotiques dans le tissu et utilisez l’arrière de la pointe d’une paire fermée de ciseaux pour gratter doucement l’adipeux le long du navire pour libérer les adipocytes. Lorsque toutes les cellules ont été recueillies jeter les gros morceaux de tissu fibreux et peser la graisse taillée.Pour libérer davantage les cellules du tissu adipeux, transférez 10 grammes de tissu adipeux dans une nouvelle boîte de Pétri de 15 centimètres et utilisez des ciseaux incurvés pour hacher soigneusement la graisse jusqu’à ce qu’elle devienne un mélange homogène lisse sans gros morceaux d’adipeux. Lorsque toute la graisse a été traitée, utilisez une cuillère pour transférer 10 millilitres de tissu haché dans des tubes individuels de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de tampon de digestion à chaque tube. Ensuite, placez les tubes dans un incubateur secouant à 37 degrés Celsius et 150 rotations par minute pendant 30 à 35 minutes.La digestion est complète lorsque la solution adipeuse est homogène, de couleur abricot, et absente des gros morceaux. À la fin de la digestion, décanter la solution de graisse digérée dans un filtre à mailles de 250 micromètres à l’intérieur d’un entonnoir placé dans stérile flacon d’un litre. Lorsque tout le volume de suspension des adipocytes a été éludé, serrez doucement le filtre à mailles pour augmenter le rendement des adipocytes et lavez le filtre avec 50 à 100 millilitres de tampon de lavage avant de presser à nouveau le filtre.Transférer la solution d’adipocytes isolés dans un entonnoir de séparation et ajouter le tampon de lavage jusqu’à ce que l’entonnoir soit presque complètement rempli. Inverser doucement l’entonnoir à quelques reprises pour mélanger la suspension des adipocytes avec le tampon et laisser reposer la suspension de deux à trois minutes jusqu’à ce qu’il y ait une séparation distincte des couches. Lorsque les couches se sont séparées, ouvrez la buse sur l’entonnoir et échappez lentement à la solution inférieure dans un flacon stérile.Lorsque toutes les collagènes ont été enlevées, recueillir la solution purifiée d’adipocyte mature dans des tubes coniques de 50 millilitres et emballer légèrement les cellules par centrifugation. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour enlever le tampon de lavage restant sous la suspension des adipocytes et utilisez une pipette pour enlever la couche lipidique libre flottant au-dessus des adipocytes matures. Pour l’ensemencement des adipocytes matures, placez le composant d’insertion de membrane perméable à l’envers sur une surface stérile et inversez doucement les tubes des adipocytes emballés à quelques reprises pour assurer une distribution uniforme des cellules.À l’aide d’une pointe de pipette à alésage large, ajouter 30 microlitres d’adipocytes matures emballés sur chaque membrane. Inverser le panneau d’insertion en un seul mouvement lisse de sorte que les adipocytes ensemencés sont sur le fond des inserts. Placez le panneau d’inserts dans une plaque de puits de 24 contenant 500 à 1000 microlitres de milieu complet de 37 degrés Celsius par puits.Ensuite, couvrez la plaque et placez soigneusement la plaque dans un incubateur de culture tissulaire. Tous les sept jours de culture, remplacer le milieu par le trou de découpe dans chaque insert. Après une semaine de culture, les agrégats matures d’adipocytes isolés du tissu adipeux sous-cutané maintiennent la morphologie unilocular caractéristique de gouttelette de lipide observée seulement dans les adipocytes mûrs.Le traitement par pioglitazone et rosiglitazone des agonistes PPAR-GAMMA entraîne une augmentation de l’expression des gènes sensibles PPAR-GAMMA, tandis que le traitement par la déxaméthasone agoniste des récepteurs glucocorticoïdes n’a aucun effet sur ces gènes. De même, l’agoniste des récepteurs glucocorticoïdes conduit solidement l’expression génétique des gènes cibles des récepteurs glucocorticoïdes, tandis que les agonistes PPAR-GAMMA n’ont aucun effet significatif sur ces gènes. En outre, le traitement de sept jours avec les agonistes de PPAR-GAMMA induit robustement l’expression de gène du gène spécifique de graisse brune, UCP1.Notre nouveau modèle in vitro d’adipocyte peut être employé pour les études fonctionnelles dans les adipocytes mûrs, y compris l’absorption de glucose, la lipogenèse, et la lipolyse. Avec cette nouvelle technique de culture des adipocytes, nous avons pu montrer que les adipocytes blancs matures humains peuvent se transfferentiate en adipocytes bruns.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

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