Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
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私たちは、資源を提供し、アディポサイトの孤立を最適化してくれたシャオ・ロン・ペンとステファン・ハレン、技術支援のためのマーティン・ウールボム、そして人間の脂肪を調整し、提供してくれたダニエル・オラウソンとマリン・レンに感謝します。

スウェーデンのヨーテボリにあるサルグレンスカ大学病院で選択的手術を受けている女性患者の腹部から脂肪組織の匿名サンプルを採取した。すべての研究対象者は、組織の使用に関する書面によるインフォームド・コンセントを与える前に、書面および口頭情報を受け取った。研究は、ヨーテボリの地域倫理審査委員会によって承認されました, スウェーデン.
注 : この方法の概要を図 1に示します。
1. バッファー、組織培養培地、および培養プレートの調製
<ol><li>NaClの35.1 g、KClの1.75 g、KH2PO4の0.82 g、MgSO47H2Oの1.48 gを900 mLの水に溶解して、5xクレブスリンガー(KR)ストックを準備します。CaCl 2・2H2Oの1.84gを加え、水を加えて1Lに調整します。0.22 μm フィルターを通して滅菌フィルターを使用し、4 °C で保管します。</li>
	<li>5x KRストックから、1X KR、25 mM HEPES、2 mMグルコース、および2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1Lのバッファーを準備する(後に洗浄緩衝液と称する)。pHを7.4に調整します。</li>
	<li>1x HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA、および450 mLの水(以下、消化緩衝液と称される)を含むコラゲターゼ緩衝液500mLを調製する。 注:コラゲターゼは、脂肪組織がステップ2.2で計量されるまで消化緩衝液に添加すべきではありません。</li>
	<li>ミディアム199のpHを7.4に調整します。</li>
	<li>滅菌フィルターは、0.22 μm フィルターフラスコを介してバッファーおよび媒体 199 の両方をフィルターし、37 °C に暖めます。 注:時間を節約するために、脂肪組織を処理する前に、組織培養培地を準備し、プレートに添加することができます。24ウェルプレートフォーマット(図1A)では、ダルベッコの改良イーグル培地/ハムの栄養混合物F12(DMEM/F12)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)、20nMインスリンの0.5-1 mL/ウェルを使用します。低分子および他の安定な薬理学的薬剤もまた、所望のレイアウトで培地にこの時点で添加することができる。プレートを組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。</li>
</ol>2. ヒト皮下脂肪組織の解剖
注:生物学的安全キャビネット内で作業し、隔離プロセス全体を通して滅菌技術を使用するだけでなく、オートクレーブおよび無菌装置の排他的な使用。
<ol><li>15cmのシャーレにヒト脂肪組織を入れ、解剖中に保湿状態に保つために少量の媒体199を加える。</li>
	<li>ゴルフボールとほぼ同じ大きさの脂肪のピースを扱い、ピンセットで大きな線維性血管をつかみ、閉じたはさみで脂肪を掻き取って脂肪細胞をそっと放します。線維組織の大きな部分を捨てます。トリミングされた脂肪の重量を量る。</li>
</ol>3. コラゲナーゼ治療
<ol><li>コラゲターゼを1mg/mLの濃度で消化バッファーに加えます(ステップ1.3を参照)。滅菌は0.22 μmの滅菌フィルターを使用して溶液をフィルターします。 注:脂肪グラム当たり3mLの消化バッファーが推奨されます(すなわち、100gの脂肪の場合、300mgの2型コラゲナーゼを用いて300mLの消化バッファーを準備します)。 注意:タイプ2コラゲナーゼは、目、皮膚に危険であり、呼吸器刺激を引き起こす可能性があります。手袋、目の保護を着用し、コラゲアーゼを扱う際に換気されたフードで作業してください。</li>
	<li>約10gの脂肪組織を15cmのシャーレに移動させ、滑らかな均質な混合物になり、大きな脂肪が残らないまで、湾曲したはさみを使用して脂肪を慎重にミンチします。すべての脂肪が処理されるまで、このプロセスを繰り返します。 注:各ラウンドは約2分を取る必要があり、脂肪片は、彼らが広いボアピペットチップを使用してピペットすることができるように十分に小さくする必要があります。このステップは、高品質のアディポサイトを生み出すために重要です。破片が大きすぎる場合は、消化時間を延長する必要があり、細胞の介振性を損なう。</li>
	<li>スプーンを使用して50 mL円錐形のチューブにミンチ脂肪を転送します。各チューブに10mLの組織を10mL、消化緩衝液30mLを加えます。10 mL未満のミンチ脂肪が利用可能な場合は、適切な量にスケールダウンします。</li>
	<li>30-45分間150rpmで一定の撹拌を用いて、37°Cで組織を消化します。30分後、過剰消化を避けるために5分ごとにプロセスをチェックしてください。 注:脂肪溶液が大きな部分を持たずに均質で、アプリコット色を持っているとき、消化は完了します。</li>
</ol>4. 細胞懸濁液の濾過と成熟性の薄膜細胞の精製
<ol><li>1L滅菌フラスコの上に漏斗を置き、漏斗の中に無菌250 μmのメッシュフィルターを置きます。消化されていない組織を除去するために、フィルターに消化脂肪溶液を注ぎます。</li>
	<li>すべての透視細胞懸濁液がフィルターを通過したら、メッシュフィルターを静かに絞って、アディポサイトの収率を上げます。約50~100mLの洗浄バッファーをフィルターに注ぎ、洗浄し、フィルターを再度絞ります。</li>
	<li>フラスコから分離したアジポサイト懸濁液を分離漏斗に注ぎ、漏斗がほぼ完全に満たされるまで洗浄バッファーを追加します。ファネルを数回軽く反転させ、アディポサイト懸濁液とバッファーを混ぜます。</li>
	<li>2層の明確な分離(図1B)が存在するまで、2〜3分間の懸濁液を放置し、成熟脂肪細胞と遊離脂質を含むトップイエロー層と、緩衝液と脂肪質間質血管画分(SVF)を含む底層を有する。</li>
	<li>分離漏斗のノズルを開き、下部溶液を滅菌フラスコにゆっくりと溶出させる(SVFの細胞は、200 x gで7分間ペレジレートして回収することができる)。分離漏斗の成熟した利細胞と最上層を保つ。</li>
	<li>4.3~4.5の段階で洗浄プロセスを3回繰り返し、成熟した食状のアディポサイトを十分に洗浄し、コラゲターゼをすべて取り除きます。</li>
</ol>5. 成熟した利状細胞のパッキング
<ol><li>ノズルを開き、精製した成熟したアディポサイト懸濁液を50 mL円錐形のチューブに集め、</li>
	<li>50 x gでチューブを3分間回転させることで、成熟したアディポサイトを軽く詰めます。</li>
	<li>18G針と注射器を使用して、残りの洗浄バッファーをアディポサイト懸濁液の下に取り除きます。</li>
	<li>ピペットを用いて成熟脂肪細胞の上に浮かぶ遊離脂質層(分離手順で壊れた脂肪細胞の小さな部分から油)を除去する。 注:手順6.5で脂肪細胞が膜から滴り落ちるリスクを減らすために、成熟した脂肪細胞を膜に播種したときに脂質層とすべての洗浄バッファーが除去されたことが重要です。このため、3つのチューブでアディポサイトを収集します。最後に収集されたサンプルは、最も多くの持ち越し脂質を持ち、したがって、最も低品質になります。しかし、注意深くピペットでこれらのサンプルを使用することができます。</li>
</ol>6. 成熟したアディポサイトの播種
<ol><li>透過性膜挿入物(材料表)を含むパッケージを開き、膜成分を取り出します。それを逆さまに反転し、膜が天井に面するように無菌表面に置きます。</li>
	<li>各膜にパックされた成熟したアディポサイトのピペット30μL(図1C)。先端で膜に触れないようにしてください。広いボアピペットの先端を使用して細胞を播種するか、ハサミを使用してピペットチップの小片を切り取って広くします。</li>
	<li>播種プロセス全体を通して、詰まったアディポサイトを含む50 mLチューブを数回静かに反転し、異なるサイズのアディポ細胞の均一な分布を確保します。</li>
	<li>インキュベーターからメディアを含む準備されたマルチウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込み、蓋を取り外します。分化した膜を取り出し、下から掴んで、ステップ6.5で反転できるようにします。</li>
	<li>ある滑らかな動きで、薄膜を上にして、種子化されたアディポサイトが下を向いてるようになりました(図1D)。画素を含むプレートを培地を含む井戸に下ろします(図1E)。</li>
	<li>プレートの上に蓋を置き、慎重に組織培養インキュベーターにプレートを転送します。アディポサイトは最初に容易に外れる可能性があるため、プレートの急速な移動を避けてください。 注:細胞が膜にしっかりと付着するまでに数日かかります。</li>
</ol>7. 分析用の利逸細胞の維持と収穫
<ol><li>メディアを少なくとも 7 日ごとに変更します。各膜インサートの切り抜き穴を通してメディアを取り出し、追加します。培地を取り除くために、注射器と針、吸引杖、またはp200チップのピペットを使用します。培地を追加するには、ピペットを使用し、アディポサイトを乱さないように、壁の側面に沿って井戸にゆっくりと新しい媒体をピペットします。 注:アディポサイトは、7日後に1つの培地変更で2週間培養されています。しかし、異なる脂肪源と実験的な質問は、増加したメディアの変化の恩恵を受ける可能性があります。</li>
	<li>RNAを採取するには、ステップ7.1で説明した方法で培地を取り出し、500 μLのリシスバッファー(材料表)をウェルに直接加えて細胞を除去します。イメージングのために細胞を固定するには、1%の最終濃度でウェルに直接ホルムアルデヒドを加えます。 注:細胞は4°Cで保存することができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

著者たちは開示するものは何もない。

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)は、新たに単離された成熟した単離された成熟したアディポサイトの長期培養のための新しい方法である。MAACの設定では、成熟したアディポサイトの収量、品質、生存率に大きな影響を与えるプロトコルにいくつかの重要なステップがあります。このステップは脂肪細胞がコラゲナーゼに曝される時間に直接影響を与えるので、ステップ3.2で脂肪をミンチすることに多くの努力を入れるべきである。脂肪の断片が大きすぎる場合、消化時間を延長する必要があり、細胞の生存率に悪影響を及ぼす。逆に、組織がハサミであまりにも細かく処理された場合、生存率も同様に影響を受ける可能性があります。MAACとして成熟した脂肪細胞の培養を成功させるためには、脂肪細胞を膜に播種するためには、遊離脂質と持ち越し洗浄バッファーを成熟脂肪細胞から除去することが重要です。の手順 5.3 と 5.4 で説明します。残りの脂質または洗浄バッファーは、脂肪細胞の表面張力を低下させ、脂肪細胞が反転したときに膜を滴下するリスクを高めます。アディポサイトが播種され、培地中で、細胞は主に浮力を介して膜と接触したままであるため、細胞を失わないよう培地を交換する際にはゆっくりと穏やかな技術が推奨されます。手順 7.1 で説明したように、ウェルの底からメディアを取り出し、壁の側面にゆっくりとメディアをピペットで取り込んでメディアを追加します。最後に、時間を節約する提案は、アディポサイト分離プロセスの前に媒体および治療でプレートを準備することです。特に複雑な実験計画の場合、プレートを事前に準備することで、多くの時間を節約でき、分離されるとすぐにアディポサイトが培地に入れられます。
分化前生細胞と比較してMAACを使用することの1つの利点は、使用されるMAAC培地が非常に単純であり、非生理学的ホルモンカクテルを必要としないことです。ここでは、グルコースリッチ培地(DMEM/F12)、10%FBS、1%ペン/ストレップ、および20 nMインスリンでMAACを培養しました。重要なことに、UCP110のロシグリタゾン/ピオグリタゾン駆動誘導にはインスリンが絶対に必要であることがわかりました。しかし、インスリンは、細胞のアディポゲン表現型を維持するために必要とされない。したがって、実験の質問に応じて、インスリンを含めるか省略することができる。
上で詳述した手順は、ヒトの分離および培養のために最適化された。しかし、マウス、およびおそらく他の生物のアディポサイトは、MAACとして培養することもできる。マウスのジポサイトを MAAC として培養する場合は、留意すべき追加の考慮事項と注意事項があります。我々は、マウスからの成熟したアディポ細胞がヒトのものよりもはるかに脆弱であることを発見した。その結果、細胞の生存率を高めるために、消化時間を絶対的な最小値に短縮する必要があります。また、若いマウス(生後8週間以下)のアディポサイトが最も堅牢で再現性の高い結果を提供することがわかりました。最後に、マウスMAACは最大1週間培養できますが、その画素性表現型がヒトよりも安定していないように見えることを考えると(少なくとも2週間は培養することができます)、対処に必要な最小限の時間はマウスMAACを培養することをお勧めします実験的な質問。
MAACモデルは透過性膜を用いて行われているため、この技術の利点の1つは、成熟したアディポサイトを他の細胞型と共培養する可能性です。我々は以前MAAC10を使用してクロストークする成熟したアディポサイトおよびマクロファージの能力を実証した。これは、さらに肥満、インスリン抵抗性、および免疫応答15、16、17との間の結合を探求する機会を開きます。今後の実験では、肝細胞、前皮細胞、内皮細胞、膵臓細胞などの他の細胞タイプを組み込んで、MAACモデルの複雑さと翻訳関連性をさらに高め、複数の細胞タイプ間のクロストークを調査することができます。
MAACは、他の体外モデルに対する他のアディポサイトの機能性および同一性を維持する上で優れていることが示されているにもかかわらず、考慮する必要がある制限も有する。前駆細胞から分化したアディポサイトを使用するのと比較して、MAACはより手間がかかり、時間のかかるモデルです。膜を有するプレートも、通常の細胞培養プレートに比べて高価です。重要なことに、成熟したアディポサイトは播種するたびに新たに分離する必要があり、前駆細胞のようなストックに拡大または凍結することはできません。したがって、これは新鮮な白色脂肪組織サンプルへのアクセスを必要とするが、ドナーからドナーのバリエーションに起因する複雑さのレベルも追加する。
ここでは、ヒト成熟した食細胞を分離し、MAACを設定するための詳細なプロトコルを提示しました。我々は、MAACとして培養されたアディポサイトが2週間を通して生存可能であり、その有限性遺伝子シグネチャが保存され、多様な薬理学的作用に反応することを実証した。MAACを使用すると、クロストークベトウィーンのアディポサイトおよび他の細胞タイプの研究、および異なる刺激に応答して成熟したアディポサイトの長期的な表型変化の評価が可能になります。

肥満と肥満関連の併存疾患の世界的な増加は、新しい治療法の開発を必要とします。白色脂肪組織(WAT)は、全身代謝の重要な調節因子であり、エネルギー恒常性、およびインスリン抵抗性および2型糖尿病(T2D)1、2の開発における中心的な役割を果たしている。慢性的な過剰なカロリー消費の間に, アディポサイトは、エネルギーの余剰を処理するために拡大します。しかし、脂肪細胞の脂質貯蔵能力を超えることができ、脂肪酸の循環レベルの上昇および末梢非脂肪組織における貯蔵の増加を生じ、3、4の脂肪毒性をもたらす。
高い翻訳関連性を有する体外モデルのアディポサイトの欠如は、肥満およびT2Dのための新しい治療法の開発における重要な課題である。この元生体外出モデルは、脂肪組織の小片が培養されるところ、低酸素症および炎症によって駆動される脂肪形成遺伝子発現における急速な変化と関連している5、6。成熟した脂肪細胞が浮遊し、培地で満たされたフラスコの上に付着する天井培養物(CC)は、脂質7、8、9、10を欠く線維芽細胞様細胞に急速に脱分化する。最も一般的に使用されるモデルは、コミットされた前駆体からインビトロで区別されたアディポサイトです。しかし、分化した細胞は、サイズが非常に小さく、単軌跡性の脂質滴がないため、生体内の成熟脂肪細胞とは形態的に異なる。このモデルの他の制限は、分化を促進するための化学カクテルの非生理学的必要性、ならびに多数の因子11、12、13、14の影響を受け得る分化効率の変動を含む。
我々は最近、膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を開発し、その経時的に分離した成熟した単量体細胞の長期培養のための方法であり、そこで、透過性膜下でアディポサイトが培養される10。RNA配列決定データの公平な分析は、脂肪組織外植体およびインビトロ分化脂肪細胞に対して、MAACが新たに単離された脂肪細胞に最も類似していることを示している。MAACは、皮下脂肪組織と内臓脂肪組織の両方から単離された成熟した脂肪細胞、ならびに肥満および赤身の被験者の両方からの脂肪細胞を培養するために使用することができる。この方法論は、長期の自己細胞のフェノチピック変化の研究を可能にし、他の細胞型との間のアディポサイトの共培養を容易にする。ここでは、ヒト脂肪組織から成熟した脂肪細胞を分離するための詳細なプロトコルとMAACシステムの設定方法を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

白色脂肪組織(WAT)調節不調は、インスリン抵抗性および2型糖尿病(T2D)の開発において中心的な役割を果たす。T2Dの新しい治療法を開発するには、より生理学的に関連するインビトロのアディポサイトモデルが必要です。本研究は、成熟したヒトの分離細胞を分離し、培養するための新しい技術を記述する。この方法は、MAAC(膜成熟性アディポサイト凝集培養)と題され、他の体外モデルと比較して、MAACは新たに分離された成熟したジポサイトに最も近いアディポ形成遺伝子シグネチャを有する。MAACを使用して、脂肪細胞は、赤身および肥満患者、異なる脂肪食貯蔵所、異なる細胞タイプとの共培養、および重要なことに、2週間培養することができる。機能実験は、グルコース取り込み、脂肪形成、脂肪分解を含むMAACでも行うことができる。さらに、MAACは多様な薬理学的作用に対して強固に反応し、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化を含む脂肪細胞表現型変化を研究するために使用することができる。

MAACとして培養された成熟したジポサイトは、その機能、表現型を保持し、様々な薬理学的治療に対するアディポサイト応答を研究するために使用することができる。皮下脂肪組織から単離された1週間後の培養後MAACは、成熟脂肪細胞にのみ見られる特徴的な単発脂質液滴を維持する(図2A)。MAACは、PPARγアゴニストロシグリタゾン(Rosi)およびピオグリタゾン(ピオ)、またはグルココルチコイド受容体(GR)アゴニストデキサメタゾン(Dex)のいずれかで処理しながら1週間培養し、MAACの下流標的遺伝子の変化を予測した。ロージとピオは、PPARγ応答性遺伝子FABP4およびLPLの発現をそれぞれ4倍と2-3倍ずつ増加させたが、デキサメタゾンは効果がなかった(図2B)。同様に、デキサメタゾンは、GR標的遺伝子APODおよびFKBP5の遺伝子発現をそれぞれ13倍および55倍ずつ強く駆動し、PPARγアゴニストは有意な効果を有しなかった。我々は以前、孤立したヒトの成熟した白色の色素細胞が、Rosi10で処理するとMAACの褐色様表現型に分化できることを実証した。ロージまたはピオによる7日間の治療は、褐色脂肪特異的遺伝子UCP1の遺伝子発現を44〜65倍に強く誘導し、並びに褐色脂肪マーカー PDK4 12-18倍の発現を増加させる(図2C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> 図1:MAACセットアップのビジュアルダイアグラム(A) 培地の準備(B) 成熟したアディポサイトの分離とパッキング。(C) 成熟したアディポサイトを膜に播種する。(D) アディポサイトを付けたまま膜を反転させる。(E) 培地中に膜を下げ、培地を交換する。この図は Harms らの10から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> 図2:MAACは1週間を通して単色の外観を維持し、多様な薬理学的作用に応答する。(A) 1週間培養後のMAACの代表4xおよび10倍明視野画像。大きな単球脂質滴を持つ100μmの平均直径を有する脂肪細胞は容易に識別可能である。(B)PPARγ標的遺伝子およびグルココルチコイド受容体(GR)のmRNAレベルは、MAACにおいて、7日間の治療後に、ビヒクル(Vehc)、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン(Pio)、またはデキサメタゾン(Dex)を標的とする。ロージ、ピオ、デックスは、7日間の治療後にMAAC(Vehc)、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン(Pio)、またはデキサメタゾン(Dex)で10μM(C)の褐色脂肪濃縮遺伝子の最終濃度で使用されました。ロージ、ピオ、デックスは、すべて10μMの最終濃度で使用しました。すべての遺伝子発現データについて、TATA結合タンパク質(TBP)を内部正常化制御として用いた。統計は、Tukeyの多重比較検定を用いて一方向分散分析を使用して計算されました。(平均 ± SD, n = 3, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)は、成熟したヒトアディポサイトを培養する新しい方法である。ここでは、脂肪細胞をヒト脂肪から分離する方法とMAACを設定する方法について詳しく説明します。

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

脂肪生物学の分野における課題の1つは、培養における成熟した脂肪細胞を維持することであった。我々は、大きな変化を通じて長期のアディポサイトの研究を可能にする新しい方法を開発した。当社のアディポサイト培養技術は、細胞相互作用の研究を可能にし、糖尿病および肥満の新しい治療法の開発に役立つことを願っています。成熟したアディポサイトの遺伝子の質と生存率に大きな影響を与える重要なステップがあるので、プロトコルに注意深く従うことが重要です。例えば、めっきの前に、遊離脂質と洗浄バッファーがすべて除去されていることを確認してください。さもなければ、リポサイトは、挿入物が反転したときにはれてしまう可能性があります。ヒト皮下脂肪組織サンプルを受け取った後、15センチメートルのペトリ皿の滅菌生物学的安全キャビネットに組織を入れる。皿に小さな199のボリューム。ピンセットを使用して組織内の大きな線維化血管をつかみ、閉じたハサミの先端の裏側を使用して、脂肪細胞を放出するために容器に沿って脂肪を静かにスクラップします。すべての細胞が収集されると、線維組織の大きな部分を捨て、トリミングされた脂肪を計量します。脂肪組織からさらに細胞を放出するには、脂肪組織の10グラムを新しい15センチメートルのペトリ皿に移し、湾曲したはさみを使用して脂肪の大きな部分のない滑らかな均質混合物になるまで慎重に脂肪をミンチします。すべての脂肪が処理されたら、スプーンを使用して10ミリリットルの細切り組織を個々の50ミリリットルチューブに移し、各チューブに30ミリリットルの消化バッファーを追加します。その後、37°Cの揺れインキュベーターにチューブを置き、毎分150回転を30〜35分間置きます。脂肪溶液が均質で、アプリコット色が付き、大きな部分が存在しない場合、消化は完了する。消化の終わりに、消化された脂肪溶液を無菌1リットルフラスコにセットされた漏斗の中の250マイクロメートルのメッシュフィルターにデカントする。アディポサイト懸濁液の全容が排除されたら、疎和にメッシュフィルターを絞って、アディポサイトの収量を増加させ、フィルターを再び絞る前に50〜100ミリリットルの洗浄バッファーでフィルターを洗浄します。分離漏斗に分離されたアジポサイト溶液を移し、漏斗がほぼ完全に満たされるまで洗浄バッファーを加える。漏斗を数回軽く反転させて、アディポサイト懸濁液をバッファーと混合し、層の明確な分離が起きるまでサスペンションを2〜3分間放置します。層が分離したら、漏斗のノズルを開き、ゆっくりと滅菌フラスコに底液を解き放ちます。コラゲナーゼをすべて取り除いたら、精製した成熟したアディポサイト溶液を50ミリリットルの円錐形チューブに集め、遠心分離によって軽く細胞を詰めます。次に、18ゲージの針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、脂肪細胞懸濁液の下に残りの洗浄バッファーを除去し、ピペットを使用して成熟した脂肪細胞の上に浮かぶ自由な脂質層を除去する。成熟したアディポサイトの播種のために、透過性膜挿入成分を無菌表面に逆さまに置き、パックされたアディポサイトのチューブを数回穏やかに反転させ、細胞の均等な分布を確保する。広いボアピペットチップを使用して、各膜に30マイクロリットルのパックされた成熟したアディポサイトを加えます。1 つの滑らかな動きで挿入パネルを反転して、シードされたアディポサイトが挿入物の底部に配置されるようにします。インサートのパネルを、井戸あたり37度の完全な培地の500〜1,000マイクロリットルを含む24ウェルプレートに入れなさい。その後、プレートを覆い、慎重にプレートを組織培養インキュベーターに入れる。培養の7日ごとに、各インサートの切り抜き穴を介して培地を交換する。培養の1週間後、成熟脂肪細胞凝集体は、成熟脂肪細胞でのみ観察される特徴的な単一の脂質液滴形態を維持する皮下脂肪組織から分離した凝集体である。PPAR-GAMMAアゴニストのピオグリタゾンおよびロシグリタゾンによる治療は、PPAR-GAMMA応答性遺伝子の発現増加をもたらすが、グルココルチコイド受容体アゴニストデキサメタゾンによる治療はこれらの遺伝子に影響を及ぼさない。同様に、グルココルチコイド受容体アゴニストはグルココルチコイド受容体標的遺伝子の遺伝子発現を強く駆動し、PPAR-GAMMAアゴニストはこれらの遺伝子に有意な影響を及ぼさない。さらに、PPAR-GAMMAアゴニストによる7日間の治療は、褐色脂肪特異的遺伝子UCP1の遺伝子発現を強く誘導する。当社の新しい脂肪細胞in vitroモデルは、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解を含む成熟脂肪細胞の機能研究に使用できます。この新しいアディポサイト培養技術により、ヒトの成熟した白色のアディポサイトが茶色のようなアディポサイトにトランスパ分化できることを示すことができました。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

マウスから単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの測定

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...