Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Vi takker Xiao-Rong Peng og Stefan Hallen for å ha gitt ressurser og optimalisere adipocyte isolasjon, Martin Uhrbom for teknisk assistanse, og Daniel Olausson og Malin Lönn for å koordinere og gi den menneskelige adipose.

Anonyme prøver av fettvev ble samlet inn fra bukregionen av kvinnelige pasienter som gjennomgikk elektiv kirurgi ved Sahlgrenska universitetssykehus i Göteborg, Sverige. Alle studiefagene fikk skriftlig og muntlig informasjon før de ga skriftlig informert samtykke til bruk av vevet. Studiene ble godkjent av The Regional Ethical Review Board i Göteborg, Sverige.
MERK: En oversikt over metoden er angitt i figur 1.
1. Utarbeidelse av buffere, vevkulturmedier og kulturplater
<ol><li>Forbered en 5x Krebbs Ringer (KR) lager ved å oppløse 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4og 1,48 g MgSO4·7H2O i 900 ml vann. Tilsett 1,84 g CaCl2·2H2O og juster volumet til 1 L ved å legge til vann. Sterilt filter gjennom et 0,22 μm filter og oppbevar ved 4 °C.</li>
	<li>Fra 5x KR lager, forberede 1 L buffer som inneholder 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glukose, og 2% storfe serum albumin (BSA) (referert til heretter som vaskebuffer). Juster pH til 7,4.</li>
	<li>Forbered 500 ml kollagenbuen som inneholder 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2,2 % BSA og 450 ml vann (referert til heretter som fordøyelsesbuffer). MERK: Kollagenene skal ikke legges til fordøyelsesbufferen før etter at fettvevet er veid i trinn 2.2.</li>
	<li>Juster pH på Medium 199 til 7,4.</li>
	<li>Sterilt filter både buffere og medium 199 gjennom en 0,22 μm filterkolbe og varm til 37 °C. MERK: For å spare tid kan vevskulturmediene tilberedes og legges til plater før du behandler fettvevet. For et 24-brønnplateformat (figur 1A),bruk 0,5-1 ml/brønn av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/Hams næringsblanding F12 (DMEM/F12), 10 % føtal storfeserum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin (penn/strep) og 20 nM insulin. Små molekyler og andre stabile farmakologiske midler kan også legges til på dette tidspunktet til media i ønsket layout. Plasser platene i en vevkulturinkubator (37 °C, 5 % CO2).</li>
</ol>2. Disseksjon av humant subkutan fettvev
MERK: Arbeid innenfor et biologisk sikkerhetsskap og bruk steril teknikk gjennom hele isolasjonsprosessen, samt eksklusiv bruk av autoklamt og sterilt utstyr.
<ol><li>Plasser det menneskelige fettvevet i en 15 cm petriskål og legg til et lite volum medium 199 for å holde det fuktig under disseksjonen.</li>
	<li>Arbeide med biter av fett omtrent på størrelse med en golfball, forstå store fibetiske fartøy med pinsett og forsiktig frigjøre adipocytes ved å skrape fettet med baksiden av lukket saks. Kast de store bitene av fibrotisk vev. Vei opp det trimmede fettet.</li>
</ol>3. Behandling av kollagenase
<ol><li>Tilsett kollagenase i fordøyelsesbufferen (se trinn 1.3) ved en konsentrasjon på 1 mg/ml. Sterilt filter oppløsningen ved hjelp av et 0,22 μm sterilt filter. MERK: Tre ml fordøyelsesbuffer per gram fett anbefales (dvs. for 100 g fett, forberede 300 ml fordøyelsesbuffer med 300 mg type 2 kollagenase). FORSIKTIG: Type 2 Kollagenase er farlig for øyne, hud og kan forårsake irritasjon av luftveiene. Bruk hansker, øyebeskyttelse og arbeid i en ventilert hette når du håndterer kollagen.</li>
	<li>Flytt ca 10 g fettvev til en 15 cm petriskål og hakk fettet forsiktig ved hjelp av et par buede saks til det blir en glatt homogen blanding, og det er ingen store biter av fett igjen. Gjenta prosessen til alt fettet er behandlet. MERK: Hver runde skal ta ca. 2 min og fettbitene skal være små nok til at de kan pipettes ved hjelp av en bredboringpipettespiss. Dette trinnet er avgjørende for å gi høy kvalitet adipocytes. Hvis bitene er for store, må fordøyelsestidene utvides, noe som går på akkord med celleviabilty.</li>
	<li>Overfør hakket fett til 50 ml konisk rør ved hjelp av en skje. Tilsett 10 ml hakket vev og 30 ml fordøyelsesbuffer til hvert rør. Skaler ned til passende volumer hvis mindre enn 10 ml hakket fett er tilgjengelig.</li>
	<li>Fordøye vevet ved 37 °C i en ristende inkubator med konstant agitasjon ved 150 o/min i 30–45 min. Etter 30 min, sjekk på prosessen hver 5 min for å unngå overfordøyelse. MERK: Fordøyelsen er fullført når fettoppløsningen er homogen uten store biter og har en aprikosfarge.</li>
</ol>4. Filtrering av cellesuspensjonen og rensing av de modne adipocytter
<ol><li>Plasser en trakt på toppen av en 1 L steril kolbe og plasser et sterilt 250 μm nettingfilter inne i trakten. Hell den fordøyde fettoppløsningen i filteret for å fjerne det ufordøyde vevet.</li>
	<li>Når alle adipocyte suspensjon har passert gjennom filteret, forsiktig klemme mesh filter for å øke utbyttet av adipocytes. Hell ca. 50–100 ml vaskebuffer inn i filteret for å skylle den og klem filteret igjen.</li>
	<li>Hell den isolerte adipocyte suspensjonen fra kolben i en separasjonstrakt og legg til vaskebuffer til trakten er nesten helt fylt. Inverter trakten forsiktig noen ganger for å blande adipocyte suspensjon med bufferen.</li>
	<li>La suspensjonen stå i 2-3 min til det er en tydelig separasjon på 2 lag (figur 1B), med et toppgult lag som inneholder de modne adipocytter og fri lipid og et bunnlag som inneholder bufferen og den fette stroma vaskulær fraksjonen (SVF).</li>
	<li>Åpne dysen på separasjonstrakten, og elut den nederste løsningen sakte inn i en steril kolbe (celler fra SVF kan pelleted og samlet etter sentrifugering ved 200 x g i 7 min). Hold det øverste laget med modne adipocytes i separasjonstrakten.</li>
	<li>Gjenta vaskeprosessen i trinn 4.3−4.5 tre ganger for å vaske de modne adipocytter grundig og fjerne alle kollagenkolene.</li>
</ol>5. Pakking av modne adipocytter
<ol><li>Åpne dysen og samle den rensede modne adipocyte suspensjonen i 50 ml konisk rør.</li>
	<li>Pakk lett de modne adipocytter ved å spinne rørene på 50 x g i 3 min.</li>
	<li>Bruk en 18 G nål og en sprøyte for å fjerne den gjenværende vaskebufferen under adipocyte suspensjon.</li>
	<li>Fjern det frie lipidlaget (olje fra den lille delen av adipocytter som brøt under isolasjonsprosedyren) som flyter oppå de modne adipocytter ved hjelp av en pipette. MERK: For å redusere risikoen for at adipocytter vil dryppe av membranene i trinn 6.5, er det viktig at lipidlaget og all vaskebuffer er fjernet når de modne adipocytter er seedet på membraner. Av denne grunn samle adipocytes i 3 rør. Prøvene som samles inn sist vil ha mest overførbarhet lipid og vil derfor være av lavest kvalitet. Men med forsiktig pipettering kan disse prøvene brukes.</li>
</ol>6. Seeding av modne adipocytter
<ol><li>Åpne pakken som inneholder de gjennomtrengelige membraninnsatsene (Materialtabell)og ta ut membrankomponenten. Snu den opp ned og legg på en steril overflate slik at membranene vender mot taket.</li>
	<li>Pipette 30 μL pakket modne adipocytter på hver av membranene (Figur 1C). Unngå å berøre membranen med spissen. Bruk bredboring pipettetips for å så cellene, eller bruk saks til å kutte av et lite stykke pipettespiss for å gjøre det bredere.</li>
	<li>Inverter forsiktig 50 ml rør med pakkede adipocytter flere ganger gjennom hele frøprosessen for å sikre en jevn fordeling av adipocytter med forskjellige størrelser.</li>
	<li>Ta med de tilberedte multibrønnplatene som inneholder mediet fra inkubatoren til biosikkerhetskabinettet og fjern lokkene. Plukk opp membranene seeded med adipocytes og forstå det fra bunnen slik at det kan invertert i trinn 6.5.</li>
	<li>I en jevn bevegelse invertere membranene med adipocytter på toppen slik at de seedede adipocytter nå vender ned (Figur 1D). Senk platen med adipocytter i brønnene som inneholder medier (Figur 1E).</li>
	<li>Sett lokket på platen og overfør platen forsiktig til en vevkulturinkubator. Unngå rask bevegelse av platen siden adipocytter lett kan løsnes i utgangspunktet. MERK: Det tar noen dager før cellene holder seg mer fast til membranen.</li>
</ol>7. Vedlikehold av adipocytter og høsting for analyse
<ol><li>Endre mediene minst hver 7. Fjern og legg til medier via cutout hullet i hver membran innsats. For å fjerne mediet, bruk en sprøyte og en nål, en aspirerende tryllestav eller en pipette med p200-spiss. For å legge til media, bruk en pipette og sakte pipette nye medier inn i brønnene langs siden av veggen for å unngå å forstyrre adipocytter. MERK: Adipocytter har blitt dyrket i 2 uker med en medieendring etter 7 dager. Imidlertid kan forskjellig fett opprinnelse og eksperimentelle spørsmål ha nytte av økte medieendringer.</li>
	<li>For å høste RNA, fjern mediet som beskrevet i trinn 7.1, og tilsett 500 μL lysisbuffer (Materialtabell) direkte inn i brønnene for å lyse cellene. For å fikse cellene for bildebehandling, legg formaldehyd direkte til brønnen ved en endelig konsentrasjon på 1%. MERK: Cellene kan deretter lagres ved 4 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Membran moden adipocyte aggregat kultur (MAAC) er en ny metode for den langsiktige kulturen av nyisolerte modne adipocytter. Ved å sette opp MAAC er det noen kritiske trinn i protokollen som i stor grad påvirker utbyttet, kvaliteten og levedyktigheten til de modne adipocytter. Mye innsats bør settes i å hakke fettet i trinn 3.2 siden dette trinnet direkte påvirker hvor lang tid adipocytter er utsatt for kollagensosene. Hvis bitene av fett er for store, må fordøyelsestiden utvides som negativt påvirker levedyktigheten til cellene. Omvendt, hvis vevet behandles for fint med saks, kan levedyktighet også påvirkes. For vellykket kultur av modne adipocytter som MAAC, bør man gi spesiell oppmerksomhet til følgende trinn: for vellykket seeding av adipocytter på membranene, er det avgjørende at gratis lipid og carryover vaskebuffer fjernes fra modne adipocytter i trinn 5.3 og 5.4. Gjenværende lipid- eller vaskebuffer vil redusere overflatespenningen til adipocytter og øke risikoen for at adipocytter drypper av membranene når de vendes. Når adipocytter er seeded og i media, cellene forblir i kontakt med membranen primært gjennom oppdrift, dermed en langsom og mild teknikk anbefales når du endrer media for å ikke miste celler. Fjern media fra bunnen av brønnene som beskrevet i trinn 7.1 og legg til medier ved sakte pipettering av medier nedover sidene av veggene. Til slutt er et tidsbesparende forslag å forberede platene med media og behandlinger før adipocyte isolasjonsprosessen. Spesielt for komplekse eksperimentelle design, pre-forbereder platene kan spare mye tid og sikrer at adipocytes er plassert i media med sine behandlinger så snart de er isolert.
En fordel med å bruke MAAC sammenlignet med differensiering preadipocytes er at MAAC media som brukes er veldig enkelt og krever ikke en ufysiologisk hormon cocktail. Her har vi dyrket MAAC i glukoserike medier (DMEM/F12), 10 % FBS, 1 % penn/strep og 20 nM insulin. Viktigere, vi har funnet ut at insulin er absolutt nødvendig for rosiglitazon / pioglitazon drevet induksjon av UCP110. Insulin er imidlertid ikke nødvendig for å opprettholde cellenes adipogenfefetype. Derfor, avhengig av det eksperimentelle spørsmålet, kan insulin inkluderes eller utelates.
Prosedyren som er beskrevet ovenfor, er optimalisert for isolasjon og kultur av humane adipocytter. Men mus, og muligens andre organismens adipocytter, kan også dyrkes som MAAC. Hvis mus adipocytes skal dyrkes som MAAC er det flere hensyn og forholdsregler som bør holdes i tankene. Vi har funnet ut at modne adipocytter fra mus er mye mer skjøre enn de fra mennesker. Som et resultat bør fordøyelsestiden forkortes til et absolutt minimum for å øke cellelevedyktigheten. Vi fant også at adipocytter fra unge mus (8 uker gamle og yngre) ga de mest robuste og reproduserbare resultatene. Til slutt kan mus MAAC dyrkes i opptil en uke, men gitt at deres adipogenfefetype ser mindre stabil enn mennesker (som kan dyrkes gjennom minst to uker) anbefaler vi å kulturing mus MAAC for minimum nødvendig tid til å ta opp eksperimentelle spørsmål.
Siden MAAC-modellen er basert på bruk av permeable membraner, er en fordel med denne teknikken muligheten for å co-culturing modne adipocytes med andre celletyper. Vi har tidligere vist evnen til modne adipocytter og makrofager til krysstale gjennom bruk av MAAC10. Dette åpner opp muligheter til å utforske sammenhengen mellom fedme, insulinresistens ogimmunresponser 15,16,17. Fremtidige eksperimenter kan innlemme andre celletyper som hepatocytter, preadipocytes, endotelceller eller bukspyttkjertelceller for ytterligere å øke kompleksiteten og den translasjonelle relevansen av MAAC-modellen og undersøke krysssnakk mellom flere celletyper.
Selv om MAAC har vist seg å være overlegen til å opprettholde funksjonalitet og identitet av adipocytter i forhold til andre adipocyte in vitro modeller, det har også begrensninger som må vurderes. Sammenlignet med å bruke adipocytter differensiert fra forløperceller, er MAAC en mer arbeidskrevende og tidkrevende modell. Plater med membraner er også dyrere sammenlignet med vanlige cellekulturplater. Viktigere, modne adipocytes må være nylig isolert hver gang på seeding og kan ikke utvides eller fryses til aksjer som forløperceller. Dermed krever dette å ha tilgang til friske hvite fettvevsprøver, men legger også til et nivå av kompleksitet som stammer fra donor til donorvariasjoner.
Her har vi presentert en detaljert protokoll for å isolere modne adipocytter og sette opp MAAC. Vi har vist at adipocytes kultivert som MAAC forblir levedyktig gjennom to uker, deres adipogene gensignatur er bevart, og de reagerer på ulike farmakologiske agonisme. Bruk av MAAC gjør det mulig å studere kryss-snakk betweeen adipocytes og andre celletyper, og vurderingen av langsiktige fenotypiske endringer av modne adipocytter som svar på forskjellige stimuli.

Den verdensomspennende økningen i fedme og fedmerelaterte kobiditeter krever utviklingen av nye terapeutiske midler. Hvitt fettvev (WAT) er en viktig regulator av hele kroppen metabolisme, energi homeostase, og er en sentral aktør i utviklingen av insulinresistens og type 2 diabetes (T2D)1,2. Under kronisk overflødig kaloriforbruk forstørrer adipocytter for å håndtere overskuddet av energi. Adipocyte lipid lagringskapasitet kan imidlertid bli overskredet, noe som resulterer i en økning av sirkulerende nivåer av fettsyrer og økt lagring i perifert ikke-fettvev og fører til lipotoksisitet3,4.
Mangelen på adipocyte in vitro modeller med høy translasjonell relevans er en viktig utfordring i utviklingen av nye behandlinger for fedme og T2D. Ex vivo explant modellen, hvor små biter av fettvev er kultivert, er forbundet med raske endringer i adipogengenuttrykk drevet av hypoksi og betennelse5,6. Takkulturer (CCer) hvor modne adipocytes flyter og holder seg til toppen av mediefylte flasker, raskt dedifferensiere til fibroblastlignende celler som mangler lipid7,8,9,10. Den mest brukte modellen er adipocytes differensiert in vitro fra engasjerte forløpere. Differensierte celler er imidlertid morfologisk forskjellig fra modne adipocytter in vivo siden de er mye mindre i størrelse og mangler en unilocular lipid dråpe. Andre begrensninger med denne modellen inkluderer det ufysiologiske behovet for en kjemisk cocktail for å drive differensiering, samt variasjon i differensieringseffektivitet som kan påvirkes av en rekke faktorer11,12,13,14.
Vi har nylig utviklet membran modne adipocyte aggregat kultur (MAAC), en metode for langsiktig kultur av nyisolerte modne adipocytter, hvor adipocytes er kultivert under permeable membraner10. Objektiv analyse av RNA sekvensering susing data har vist at i forhold til fettvev explants og in vitro-differensiert adipocytes, MAAC er mest lik nyisolerte adipocytter. MAAC kan brukes til å kultur modne adipocytter isolert fra både subkutan og visceral adipose vev, samt adipocytes fra både overvektige og magre. Denne metoden tillater studiet av langsiktige adipocyte fenotypiske endringer og letter co-kultur av adipocytter med andre celletyper. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av modne adipocytter fra humant fettvev og hvordan du setter opp MAAC-systemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

Hvit fettvev (WAT) dysregulering spiller en sentral rolle i utviklingen av insulinresistens og type 2 diabetes (T2D). For å utvikle nye behandlinger for T2D, er det nødvendig med mer fysiologisk relevante in vitro adipocyte-modeller. Denne studien beskriver en ny teknikk for å isolere og kultur modne menneskelige adipocytter. Denne metoden har tittelen MAAC (membran moden adipocyte aggregat kultur), og sammenlignet med andre adipocyte in vitro modeller, MAAC har en adipogen gensignatur som er nærmest nyisolerte modne adipocytter. Ved hjelp av MAAC kan adipocytter dyrkes fra magre og overvektige pasienter, forskjellige fettdepoter, co-kultivert med forskjellige celletyper, og viktigst, kan holdes i kultur i 2 uker. Funksjonelle eksperimenter kan også utføres på MAAC inkludert glukoseopptak, lipogenese og lipolyse. Videre reagerer MAAC robust på ulike farmakologiske agonisme og kan brukes til å studere adipocyte fenotypiske endringer, inkludert transdifferensiering av hvite adipocytter i brunlignende fettceller.

Modne adipocytter kultivert som MAAC bevarer sin funksjon, fenotype, og kan brukes til å studere adipocyte svar på ulike farmakologiske behandlinger. Etter 1 uke med kultur MAAC isolert fra subkutan fettvev opprettholde den karakteristiske unilocular lipid dråpe funnet bare i modne adipocytter (Figur 2A). MAAC ble dyrket i 1 uke mens behandlet med enten PPARγ agonists rosiglitazone (Rosi) og pioglitazon (Pio), eller glukokortikoid reseptoren (GR) agonist deksametason (Dex) for å avgjøre om ulike kjernefysiske hormonreseptor (NHR) agonister stasjonen spådde endringer i nedstrøms målgener i MAAC. Rosi og Pio økte uttrykket for PPARγ responsive gener FABP4 og LPL med henholdsvis 4 og 2-3 ganger, mens deksametason ikke hadde noen effekt (figur 2B). Tilsvarende drev deksametason robust genuttrykket til GR-målgenene APOD og FKBP5 med henholdsvis 13- og 55 ganger, mens PPARγ-agonistene ikke hadde noen signifikante effekter. Vi har tidligere vist at nyisolerte menneskelige modne hvite adipocytter kan transdifferensiere til en brun-lignende fenotype i MAAC når de behandles med Rosi10. En 7 dagers behandling med Rosi eller Pio induserte robust genuttrykket til det brune fettspesifikke genet UCP1 med 44-65 ganger, samt økt uttrykket for den brune fettmarkøren PDK4 12-18 ganger (figur 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Figur 1: Visuelt diagram for MAAC-oppsett. (A) Utarbeidelse av medium. (B) Isolasjon og pakking av modne adipocytter. (C) Seeding modne adipocytes på membraner. (D) Invertering membraner mens du holder adipocytes festet. (E) Senke membranene inn i mediet og endre mediet. Dette tallet er endret fra Harms et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Figur 2: MAAC opprettholder unilocular utseende gjennom en uke og reagerer på ulike farmakologiske agonisme. (A) Representative 4x og 10x lyse feltbilder av MAAC etter en uke med kultur. Adipocytter som har en gjennomsnittlig diameter på 100 μm med store unilocular lipiddråper er lett merkbare. (B) mRNA nivåer av PPARγ målgener og glukokortikoid reseptor (GR) målgener i MAAC etter 7 dagers behandling med kjøretøy (Vehc), rosiglitazon (Rosi), pioglitazon (Pio), eller deksametason (Dex). Rosi, Pio og Dex ble alle brukt ved en endelig konsentrasjon på 10 μM. (C) mRNA nivåer av brune fettberikede gener i MAAC etter 7 dagers behandling med kjøretøy (Vehc), rosiglitazon (Rosi), pioglitazon (Pio), eller deksametason (Dex). Rosi, Pio og Dex ble alle brukt ved en endelig konsentrasjon på 10 μM. For alle genuttrykksdata ble TATA-bindende protein (TBP) brukt som en intern normaliseringskontroll. Statistikk ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligninger test. (gjennomsnittlig ± SD, n = 3, * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membran moden adipocyte aggregat kultur (MAAC) er en ny metode for å kultur modne menneskelige adipocytes. Her beskriver vi hvordan du isolerer adipocytter fra menneskelig fett og hvordan du setter opp MAAC.

Isolasjon og kultur av menneskelige modne adipocytter ved hjelp av membran modne adipocyte aggregerte kulturer (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

En utfordring innen fettbiologi har vært å opprettholde moden adipocyte i kulturen. Vi har utviklet en ny metode som gjør det mulig å studere langsiktig adipocyte gjennom store endringer. Vår adipocyte kultur teknikk tillater studiet av celle interaksjoner og vil forhåpentligvis være nyttig for utvikling av nye behandlinger for diabetes og fedme.Det er viktig å følge protokollen nøye, da det er noen kritiske skritt som i stor grad påvirker genkvaliteten og levedyktigheten til de modne adipocytter. For eksempel, før plating sørg for at alle gratis lipid og vask buffer er fjernet ellers lipocytter kan rive av når innsatsene er invertert. Etter å ha mottatt den menneskelige subkutane fettvevsprøven, legg vevet i et sterilt biologisk sikkerhetsskap i en 15 centimeter petriskål.Et lite volum medium 199 til parabolen. Bruk pinsett for å forstå store fibrotiske kar i vevet og bruk baksiden av spissen av en lukket saks for å forsiktig skrape fettet langs fartøyet for å frigjøre adipocytter. Når alle cellene er samlet kaste de store bitene av fibrotisk vev og veie trimmet fett.For ytterligere å frigjøre cellene fra fettvevet, overfør 10 gram fettvev til en ny 15 centimeter petriskål og bruk buet saks til å forsiktig hakke fettet til det blir en jevn homogen blanding uten store biter av fett. Når alt fettet er behandlet, bruk en skje til å overføre 10 milliliter hakket vev til individuelle 50 milliliter rør og tilsett 30 milliliter fordøyelsesbuffer til hvert rør. Plasser deretter rørene i en ristende inkubator ved 37 grader Celsius og 150 rotasjoner per minutt i 30 til 35 minutter.Fordøyelsen er komplett når fettløsningen er homogen, aprikosfarget og fraværende av store stykker. På slutten av fordøyelsen, dekantere fordøyd fett løsning i en 250 mikrometer mesh filter inne i en trakt satt i steril en liter kolbe. Når hele volumet av adipocytt suspensjon har blitt unnsluppet, forsiktig presse mesh filteret for å øke utbyttet av adipocytter og vaske filteret med 50 til 100 milliliter vaskebuffer før klemme filteret igjen.Overfør den isolerte adipocyttløsningen til en separasjonstrakte og legg til vaskebuffer til trakten er nesten helt fylt. Snu trakten forsiktig et par ganger for å blande adipocyttsuspensjonen med bufferen og la suspensjonen stå i to til tre minutter til det er en distinkt separasjon av lagene. Når lagene er separert, åpner du dysen på trakten og unnviker sakte bunnoppløsningen i en steril kolbe.Når alle kollagenase er fjernet, samle renset moden adipocytt løsning i 50 milliliter koniske rør og lett pakke cellene ved sentrifugering. Deretter bruker du en 10 ml sprøyte utstyrt med en 18 gauge kanyle for å fjerne den gjenværende vaskebufferen under adipocyttfjæringen og bruk en pipette til å fjerne det frie lipidlaget som flyter over de modne adipocytter. For såing av modne adipocytter, plasser den gjennomtrengelige membraninnsatskomponenten opp ned på en steril overflate og forsiktig inverter rørene til pakkede adipocytter et par ganger for å sikre en jevn fordeling av celler.Bruk en bred pipettespiss til å tilsette 30 mikroliter med pakkede modne adipocytter på hver membran. Inverter innsatspanelet i en jevn bevegelse slik at de seedede adipocytter er på bunnen av innsatsene. Plasser panelet av innsatser i en 24 brønnplate som inneholder 500 til 1000 mikroliter med komplett 37 grader Celsius medium per brønn.Deretter dekker platen og legger platen forsiktig i en vevskultur inkubator. Hver sjuende dag med kultur, erstatte mediet via cutout hullet i hver innsats. Etter en uke med kultur opprettholder modne adipocyttaggregater isolert fra subkutant fettvev den karakteristiske uilokulære lipiddråpemorfologien som bare observeres i modne adipocytter.Behandling med PPAR-GAMMA-agonister pioglitazon og rosiglitazon resulterer i et økt uttrykk i PPAR-GAMMA responsive gener, mens behandling med glukokortikoidreseptoragonist deksametason ikke har noen effekt på disse genene. På samme måte driver glukokortikoidreseptoragonisten robust genuttrykket av glukokortikoidreseptormålgener, mens PPAR-GAMMA-agonistene ikke har noen signifikant effekt på disse genene. I tillegg induserer syv dagers behandling med PPAR-GAMMA-agonistene robust genuttrykket til det brune fettspesifikke genet, UCP1.Vår nye adipocytt in vitro modell kan brukes til funksjonelle studier i modne adipocytter, inkludert glukoseopptak, lipogenese, og lipolyse. Med denne nye adipocyte kultur teknikken har vi vært i stand til å vise at menneskelige modne hvite adipocytter kan transdifferentiate til brun-lignende adipocytter.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolering av humant Atrial myocytes for samtidige målinger av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter og Membran Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning av RNA-bindende proteiner etter<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down i adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Måling av insulin- og sammentrekningstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert moden skjelettmuskulatur fra mus

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og anrikning av humane lungeepiteliale stamceller for organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...