Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Мы благодарим Сяо-Ронг Пэн и Стефана Халлена за предоставление ресурсов и оптимизацию изоляции адипоцитов, Мартина Урблома за техническую помощь, а Даниэля Олауссона и Малин Лённ за координацию и предоставление человеческого угрюмого.

Анонимные образцы жировой ткани были собраны из брюшной области пациентов, проходящих выборную операцию в университетской больнице Сальгренска в Гетеборге, Швеция. Все испытуемые получили письменную и устную информацию, прежде чем дать письменное информированное согласие на использование ткани. Исследования были одобрены Региональным советом по этике в Гетеборге, Швеция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор метода представлен на рисунке 1.
1. Подготовка буферов, Ткань культуры СМИ, и культуры плит
<ol><li>Подготовьте 5x Кребс Рингер (KR) акции путем растворения 35,1 г NaCl, 1,75 г KCl, 0,82 г KH2PO4, и 1,48 г MgSO47H2O в 900 мл воды. Добавьте 1,84 г CaCl2Х2H 2O и отрегулируйте объем до 1 л, добавив воду. Стерильный фильтр через фильтр 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Из 5x KR фонда, подготовить 1 l буфера, содержащего 1x KR, 25 мМ HEPES, 2 мМ глюкозы, и 2% бычьего сыворотки альбумина (BSA) (называется в дальнейшем как мыть буфер). Отрегулируйте рН до 7,4.</li>
	<li>Приготовьте 500 мл коллагеназного буфера, содержащего 1x HBSS и CaCl2 й MgCl2, 2% BSA, и 450 мл воды (именуемый далее как буфер пищеварения). ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеназа не должна быть добавлена в буфер пищеварения до тех пор, пока жировая ткань не будет взвешена в шаге 2.2.</li>
	<li>Отрегулируйте рН среднего 199 до 7,4.</li>
	<li>Стерильный фильтр как буферов и среднего 199 через 0,22 мкм фильтр колбу и теплой до 37 градусов по Цельсию. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить время, средства культуры тканей могут быть подготовлены и добавлены в пластины перед обработкой жировой ткани. Для 24-колодца пластины формата(рисунок 1A), используйте 0,5'1 мл / хорошо Dulbecco в среднем / ветчина питательной смеси F12 (DMEM/F12), 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицин (пен/стрептомицин) и 20 нм инсулина. Малые молекулы и другие стабильные фармакологические агенты также могут быть добавлены в это время к средствам массовой информации в желаемом макете. Поместите пластины в инкубатор культуры тканей (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).</li>
</ol>2. Рассечение подкожной жировой ткани человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в рамках биологического шкафа безопасности и использовать стерильную технику на протяжении всего процесса изоляции, а также исключительное использование автоклавированного и стерильного оборудования.
<ol><li>Поместите жировую ткань человека в 15 см петри блюдо и добавить небольшой объем среднего 199 держать его увлажненной во время вскрытия.</li>
	<li>Работая с кусочками жирового примерно размера мяча для гольфа, захватывайте большие фиброзные сосуды с помощью пинцета и аккуратно отпускайте адипоциты, соскребая жировую утес с задней частью закрытых ножниц. Откажитесь от больших кусочков фиброзной ткани. Взвесьте обрезанный жир.</li>
</ol>3. Лечение коллагенеза
<ol><li>Добавьте коллагенезу в буфер пищеварения (см. шаг 1.3) при концентрации 1 мг/мл. Стерильный фильтр раствора с помощью стерильного фильтра 0,22 мкм. ПРИМЕЧАНИЕ: Три мл буфера пищеварения на грамм жира рекомендуется (т.е. для 100 г жира, подготовить 300 мл буфера пищеварения с 300 мг типа 2 коллагеназа). ВНИМАНИЕ: Коллагенеза 2 типа опасна для глаз, кожи и может вызвать раздражение дыхательных путей. Носите перчатки, защиту глаз, и работать в вентилируемый капюшон при обработке коллагеназа.</li>
	<li>Переместите примерно 10 г жировой ткани в 15 см чашку Петри и фарш жир тщательно с помощью пары изогнутых ножниц, пока он не станет гладкой однородной смеси и Есть нет больших кусков жировой слева. Повторите этот процесс до тех пор, пока все жиры не будут обработаны. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раунд должен занять около 2 минут, и жировые части должны быть достаточно малы, чтобы они могли быть пайпетами с помощью широкоборного наконечника пипетки. Этот шаг имеет решающее значение для получения высококачественных адипоцитов. Если части слишком большие, время пищеварения должны быть расширены, компрометируя cell viabilty.</li>
	<li>Перенесите фарш в конические трубки мощностью 50 мл с помощью ложки. Добавьте 10 мл измельченной ткани и 30 мл буфера пищеварения к каждой трубке. Масштабируйте до соответствующих объемов, если имеется менее 10 мл фарша.</li>
	<li>Переварить ткани при 37 градусах Цельсия в дрожащем инкубаторе при постоянном возбуждении при 150 об/мин в течение 30–45 мин. После 30 минут, проверить на процесс каждые 5 минут, чтобы избежать переваривания. ПРИМЕЧАНИЕ: Пищеварение завершено, когда жировой раствор однороден без каких-либо больших частей и имеет абрикосовый цвет.</li>
</ol>4. Фильтрация клеточной подвески и очищения зрелых адипоцитов
<ol><li>Поместите воронку поверх стерильной колбы 1 л и поместите стерильный фильтр сетки 250 мкм внутри воронки. Налейте переваренный жир раствор в фильтр, чтобы удалить непереваренные ткани.</li>
	<li>Когда все адипоциты подвески прошел через фильтр, осторожно сжать сетчатый фильтр, чтобы увеличить выход адипоцитов. Налейте в фильтр примерно 50–100 мл буфера для мытья, чтобы промыть его и снова сжать фильтр.</li>
	<li>Налейте изолированную подвеску адипоцита из колбы в разделительную воронку и добавьте буфер стирки до тех пор, пока воронка не будет заполнена почти полностью. Аккуратно инвертировать воронку несколько раз, чтобы смешать подвеску адипоцита с буфером.</li>
	<li>Пусть подвеска стоять в течение 2'3 мин до тех пор, пока есть четкое разделение 2 слоев(Рисунок 1B), с верхним желтым слоем, содержащим зрелые адипоциты и свободный липид и нижний слой, содержащий буфер и жировой строма сосудистой фракции (SVF).</li>
	<li>Откройте сопло на сечение воронки, и медленно уклониться от нижней части в стерильную колбу (клетки из SVF могут быть гранулы и собраны после центрифугации при 200 х г в течение 7 мин). Держите верхний слой зрелыми адипоцитами в воронке разделения.</li>
	<li>Повторите процесс мытья в шагах 4.3-4.5 три раза, чтобы тщательно вымыть зрелые адипоциты и удалить все коллагеназы.</li>
</ol>5. Упаковка зрелых адипоцитов
<ol><li>Откройте сопло и соберите очищенную зрелую подвеску адипоцита в конические трубки 50 мл.</li>
	<li>Слегка упакуйте зрелые адипоциты, вращая трубки при 50 х г в течение 3 мин.</li>
	<li>Используйте 18 G иглу и шприц, чтобы удалить оставшийся буфер стирки ниже подвески адипоцита.</li>
	<li>Удалите свободный липидный слой (масло из небольшой части адипоцитов, которые сломались во время процедуры изоляции), плавающие на вершине зрелых адипоцитов с помощью пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить риск того, что адипоциты будут капать с мембран в шаге 6.5, важно, чтобы липидный слой и все мытье буфера были удалены, когда зрелые адипоциты посеяны на мембраны. По этой причине собирать адипоциты в 3 трубки. Образцы, которые собраны в последнюю произвол, будут иметь наиболее переносной липид и, следовательно, будет самого низкого качества. Однако при тщательном пипетке эти образцы могут быть использованы.</li>
</ol>6. Посев зрелых адипоцитов
<ol><li>Откройте пакет, содержащий проницаемые мембранные вставки(Таблица материалов)и выняйте мембранный компонент. Переверните его вверх дном и поместите на стерильную поверхность, чтобы мембраны выходят на потолок.</li>
	<li>Пипетка 30 л упакованных зрелых адипоцитов на каждую из мембран(рисунок 1C). Избегайте прикосновения к мембране кончиком. Используйте широкие пипетки советы для семян клеток, или использовать ножницы, чтобы отрезать небольшой кусок кончика пипетки, чтобы сделать его шире.</li>
	<li>Аккуратно инвертировать 50 мл труб с упакованными адипоцитами несколько раз на протяжении всего процесса посева, чтобы обеспечить равномерное распределение адипоцитов с различными размерами.</li>
	<li>Принесите подготовленные многоцветные пластины, содержащие средства массовой информации из инкубатора, в шкаф биобезопасности и снимите крышки. Возьмите мембраны, посеянные адипоцитами, и схватите его снизу, чтобы его можно было перевернуть в шаге 6.5.</li>
	<li>В одном плавном движении инвертировать мембраны с адипоцитами на вершине, так что семенами адипоцитов в настоящее время сталкиваются вниз (Рисунок 1D). Опустите тарелку с адипоцитами в колодцы, содержащие носители информации(рисунок 1E).</li>
	<li>Положите крышку на тарелку и аккуратно перенесите пластину в инкубатор культуры тканей. Избегайте быстрого движения пластины, так как адипоциты могут быть легко выбиты изначально. ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает несколько дней для клеток придерживаться более твердо к мембране.</li>
</ol>7. Содержание адипоцитов и сбор урожая для анализа
<ol><li>Меняйте средства массовой информации по крайней мере каждые 7 дней. Удалите и добавьте носители через отверстие выреза в каждой мембранной вставке. Чтобы удалить носители, используйте шприц и иглу, успокоительную палочку или пипетку с наконечником p200. Чтобы добавить средства массовой информации, используйте пипетку и медленно пипетку новых средств массовой информации в колодцы вдоль стены, чтобы избежать нарушения адипоцитов. ПРИМЕЧАНИЕ: Адипоциты были культивированы в течение 2 недель с одной сменой средств массовой информации после 7 дней. Тем не менее, различные жировые истоки и экспериментальные вопросы могут извлечь выгоду из увеличения изменений в средствах массовой информации.</li>
	<li>Чтобы собрать РНК, удалите носители, как описано в шаге 7.1, и добавьте 500 кЛ буфера лисиса(Таблица материалов)прямо в скважины, чтобы линза клеток. Чтобы зафиксировать клетки для визуализации, добавьте формальдегид непосредственно в колодец при окончательной концентрации 1%. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться при 4 градусах Цельсия.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Мембрана зрелой адипоцита агрегированной культуры (MAAC) является новым методом для долгосрочной культуры свежеизолированных зрелых адипоцитов. При настройке MAAC есть несколько критических шагов в протоколе, которые значительно влияют на урожайность, качество и жизнеспособность зрелых адипоцитов. Много усилий должно быть приложено в фарш жира в шаге 3.2, так как этот шаг непосредственно влияет на количество времени адипоцитов подвергаются коллагенеза. Если кусочки жировой ткани слишком велики, время пищеварения должно быть увеличено, что негативно влияет на жизнеспособность клеток. И наоборот, если ткань обрабатывается слишком мелко ножницами, жизнеспособность может быть затронута также. Для успешной культуры зрелых адипоцитов как MAAC следует уделить особое внимание следующим шагам: для успешного посева адипоцитов на мембраны, крайне важно, чтобы свободный липидный и переносной буфер для мытья выдался из зрелых адипоцитов в шагах 5.3 и 5.4. Оставшийся липидный или моющий буфер снизит поверхностное натяжение адипоцитов и увеличит риск того, что адипоциты высваивают мембраны, когда они переворачиваются. Когда адипоциты посеяны и в средствах массовой информации, клетки остаются в контакте с мембраной в первую очередь через плавучесть, таким образом, медленный и нежный метод рекомендуется при изменении среды, чтобы не потерять клетки. Удалите носители из нижней части скважины, как описано в шаге 7.1 и добавить средства массовой информации медленно pipetting средств вниз по бокам стен. Наконец, экономия времени предложение заключается в том, чтобы подготовить пластины со средствами массовой информации и лечения до процесса изоляции адипоцитов. Особенно для сложных экспериментальных конструкций, предварительной подготовки пластин может сэкономить много времени и гарантирует, что адипоциты помещаются в средствах массовой информации с их лечения, как только они изолированы.
Одним из преимуществ использования MAAC по сравнению с дифференциацией preadipocytes является то, что MAAC сми используется очень просто и не требует нефизиологического гормона коктейль. Здесь мы культивировали MAAC в богатых глюкозой сми (DMEM/F12), 10% FBS, 1% пенн/стреп, и 20 нм инсулина. Важно отметить, что мы обнаружили, что инсулин абсолютно необходим для розиглитазона / pioglitazone приводом индукции UCP110. Инсулин, однако, не требуется для поддержания адипогенного фенотипа клеток. Таким образом, в зависимости от экспериментального вопроса, инсулин может быть включен или опущен.
Процедура, описанная выше, была оптимизирована для изоляции и культуры адипоцитов человека. Тем не менее, мышь, и, возможно, адипоциты другого организма, также могут быть культивированы как MAAC. Если мыши адипоцитов должны быть культивированы как MAAC Есть дополнительные соображения и меры предосторожности, которые следует иметь в виду. Мы обнаружили, что зрелые адипоциты мышей гораздо более хрупкие, чем у людей. В результате время пищеварения должно быть сокращено до абсолютного минимума, чтобы повысить жизнеспособность клеток. Мы также обнаружили, что адипоциты молодых мышей (8-недельных и молодых) дали наиболее надежные и воспроизводимые результаты. Наконец, мышь MAAC может быть культивируется на срок до одной недели, однако, учитывая, что их адипогенный фенотип кажется менее стабильным, чем люди (которые могут быть культивированы в течение по крайней мере две недели) мы рекомендуем культивирование мыши MAAC для минимального необходимого времени для решения экспериментальные вопросы.
Поскольку модель MAAC основана на использовании проницаемых мембран, одним из преимуществ этого метода является возможность совместного культивирования зрелых адипоцитов с другими типами клеток. Ранее мы продемонстрировали способность зрелых адипоцитов и макрофагов перекрестный разговор с помощью MAAC10. Это открывает возможности для дальнейшего изучения связи между ожирением, резистентность к инсулину, и иммунные реакции15,16,17. Будущие эксперименты могут включать другие типы клеток, такие как гепатоциты, предипоциты, эндотелиальные клетки или клетки поджелудочной железы, чтобы еще больше увеличить сложность и переводственную значимость модели MAAC и исследовать перекрестный разговор между несколькими типами клеток.
Несмотря на то, что MAAC, как было показано, превосходит функциональность и идентичность адипоцитов по сравнению с другими моделями adipocyte in vitro, он также имеет ограничения, которые необходимо учитывать. По сравнению с использованием адипоцитов, отличающихся от клеток-предшественников, MAAC является более трудоемкой и трудоемкой моделью. Плиты с мембранами также дороже по сравнению с обычными пластинами клеточной культуры. Важно отметить, что зрелые адипоциты должны быть свежеизолированы каждый раз при посеве и не могут быть расширены или заморожены в запасы, такие как клетки-предшественники. Таким образом, это требует доступа к свежим белым образцам жировой ткани, но также добавляет уровень сложности, вытекающих из донора донора к донору вариации.
Здесь мы представили подробный протокол для изоляции зрелых адипоцитов человека и создания MAAC. Мы показали, что адипоциты, культивированные как MAAC, остаются жизнеспособными в течение двух недель, их адипогенная генная подпись сохраняется, и они реагируют на разнообразный фармакологический агонизм. Использование MAAC позволяет изучать кросс-говорить betweeen адипоцитов и других типов клеток, а также оценки долгосрочных фенотипических изменений зрелых адипоцитов в ответ на различные стимулы.

Во всем мире рост ожирения и связанных с ожирением сопутствующих заболеваний требует разработки новых терапевтических препаратов. Белая жировая ткань (WAT) является важным регулятором метаболизма всего тела, энергетического гомеостаза, и является центральным игроком в развитии резистентности к инсулину и диабета 2 типа (T2D)1,2. Во время хронического избыточного потребления калорий, адипоциты увеличиваются, чтобы справиться с избытком энергии. Тем не менее, адипоцитов липидной емкость может стать превышен, в результате чего повышение циркулирующих уровней жирных кислот и увеличение хранения в периферических нежирных тканей и приводит к липотоксичности3,4.
Отсутствие адипоцитов в пробирке моделей с высокой трансляционной актуальности является ключевой задачей в разработке новых методов лечения ожирения и T2D. Ex vivo explant модель, где маленькие кусочки жировой ткани культивируются, связана с быстрыми изменениями в экспрессии адипогенных генов, вызванных гипоксией и воспалением5,6. Потолочные культуры (CCs), где зрелые адипоциты плавают и придерживаться верхней части медиа заполненные колбы, быстро дедифференцировать в фибробластоподобных клеток, не хватает липидов7,8,9,10. Наиболее часто используемой моделью является адипоциты, дифференцированные в пробирке от совершенных прекурсоров. Дифференцированные клетки, однако, морфологически отличаются от зрелых адипоцитов in vivo, так как они гораздо меньше по размеру и не имеют неилоглазной липидной капли. Другие ограничения с этой моделью включают нефизиологическую потребность химического коктейля для диска дифференциации, а также изменчивость в эффективности дифференциации, которые могут быть затронуты рядом факторов11,12,13,14.
Недавно мы разработали мембраны зрелой адипоцитовой агрегированной культуры (MAAC), метод для долгосрочной культуры свежеизолированных зрелых адипоцитов, где адипоциты культивируются под проницаемыми мембранами10. Непредвзятый анализ данных секвенирования РНК показал, что по отношению к жировой ткани explants и in vitro-дифференцированных адипоцитов, MAAC больше всего похож на свежеизолированные адипоциты. MAAC может быть использован для культуры зрелых адипоцитов, изолированных как от подкожной, так и из висцеральной жировой ткани, а также адипоцитов как от тучных, так и от худых предметов. Эта методология позволяет изучать долгосрочные фенотипические изменения адипоцитов и облегчает совместное выращивание адипоцитов с другими типами клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции зрелых адипоцитов от жировой ткани человека и как настроить систему MAAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

Дисрегуляция белой жировой ткани (WAT) играет центральную роль в развитии резистентности к инсулину и диабета 2 типа (T2D). Для разработки новых методов лечения T2D требуются более физиологически значимые модели in vitro adipocyte. Это исследование описывает новую технику изолировать и культуры зрелых адипоцитов человека. Этот метод озаглавлен MAAC (мембранная зрелая адипоцитная агрегированная культура), и по сравнению с другими моделями adipocyte in vitro, MAAC обладает адипогенной генной подписью, которая является самой близкой к свежеизолированным зрелым адипоцитам. Использование MAAC, адипоциты могут быть культивированы из худой и ожирением пациентов, различных жировые склады, совместно культурные с различными типами клеток, и что важно, может храниться в культуре в течение 2 недель. Функциональные эксперименты также могут быть выполнены на MAAC, включая поглощение глюкозы, липогенез, и липоиз. Кроме того, MAAC решительно реагирует на разнообразный фармакологический агонизм и может быть использован для изучения фенотипических изменений адипоцитов, включая трансдифферециацию белых адипоцитов в коричнево-подобные жировые клетки.

Зрелые адипоциты, культивированные как MAAC сохраняет свою функцию, фенотип, и могут быть использованы для изучения адипоцитов ответы на различные фармакологические методы лечения. После 1 недели культуры MAAC изолированы от подкожной жировой ткани поддерживать характерные неилокулярные липидные капли, найденные только в зрелых адипоцитов(Рисунок 2A). MAAC культивировался в течение 1 недели во время лечения либо с агнитазонами PPAR' rosiglitazone (Rosi) и pioglitazone (Pio), или глюкокортикоидным рецептором (GR) агонистом дексаметазона (Dex), чтобы определить, если различные ядерные рецепторы гормона (NHR) диск предсказал изменения в вниз по течению целевых генов в MAAC. Рози и Пио увеличили экспрессию спичковых генов PPРАЗ FABP4 и LPL в 4 и 2,3 раза, соответственно, в то время как дексаметазон не имел никакого эффекта(рисунок 2B). Аналогичным образом, дексаметазон надежно управлял экспрессией генов GR-мишеней APOD и FKBP5 в 13- и 55 раз соответственно, в то время как агонисты ППАРЗ не имели значительных эффектов. Ранее мы показали, что свежеизолированные люди зрелые белые адиоциты могут трансдифференцироваться в коричневый, как фенотип в MAAC при лечении рози10. 7-дневное лечение с Rosi или Pio надежно индуцированных экспрессии гена коричневого жира конкретных гена UCP1 в 44-65 раз, а также увеличили экспрессию коричневого жира маркер PDK4 12-18 раз(Рисунок 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Рисунок 1: Визуальная диаграмма установки MAAC. ()Подготовка среды. (B) Изоляция и упаковка зрелых адипоцитов. (C) Посев зрелые адипоциты на мембраны. (D) Перевернутые мембраны при сохранении адипоцитов прилагается. (E) Снижение мембран в среду и изменение среды. Эта цифра была изменена из Harms et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Рисунок 2: MAAC поддерживает неилоглазный внешний вид в течение одной недели и реагирует на разнообразный фармакологический агонизм. (A) Представитель 4x и 10x яркие поле изображения MAAC после одной недели культуры. Адипоциты, которые имеют средний диаметр 100 мкм с большими неилокулярными липидными каплями легко различимы. (B) мРНК уровни пшень PPAR и глюкокортикоидных рецепторов (GR) целевых генов в MAAC после 7 дней лечения с транспортным средством (Vehc), rosiglitazone (Рози), pioglitazone (Пио), или дексаметазон (Декс). Рози, Пио и Декс были использованы при конечной концентрации 10 мКм. (C) мРНК уровней коричневого жира обогащенных генов в MAAC после 7 дней лечения с транспортным средством (Vehc), rosiglitazone (Рози), pioglitazone (Пио), или дексаметазон (Декс). Рози, Пио и Декс были использованы в окончательной концентрации 10 мкм. Для всех данных экспрессии генов, TATA-связывающий протеин (TBP) был использован как внутренне управление нормализации. Статистика была рассчитана с помощью односторонней ANOVA с помощью теста tukey-множественных сравнений. (средний SD, n No 3, зрп злт; 0,05; Злт; 0,01; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Мембрана зрелой адипоцита агрегированной культуры (MAAC) является новым методом для культуры зрелых человеческих адипоцитов. Здесь мы подробно, как изолировать адипоциты от человеческого жирового и как создать MAAC.

Изоляция и культура человека зрелых адипоцитов использование Мембраны зрелые Адипоцита Агрегатные культуры (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Одна из проблем в области жировой биологии заключается в поддержании зрелых адипоцитов в культуре. Мы разработали новый метод, который позволяет изучать долгосрочные адипоциты на протяжении больших изменений. Наша методика культуры адипоцитов позволяет изучать клеточные взаимодействия и, как мы надеемся, будет полезна для разработки новых методов лечения диабета и ожирения.Важно внимательно следить за протоколом, так как есть некоторые важные шаги, которые сильно влияют на качество генов и жизнеспособность зрелых адипоцитов. Например, перед покрытием убедитесь, что все свободные липиды и мыть буфер был удален в противном случае липоциты могут сорвать, когда вставки перевернуты. Получив образец подкожной жировой ткани человека, поместите ткань в стерильный биологический шкаф безопасности в 15-сантиметровую чашку Петри.Небольшой объем средних 199 к блюду. Используйте пинцет, чтобы захватить большие фиброзные сосуды в ткани и использовать заднюю часть кончика закрытой пары ножниц, чтобы аккуратно отказаться от жировой вдоль сосуда, чтобы освободить адипоцитов. Когда все клетки были собраны отказаться от больших кусков фиброзной ткани и взвесить обрезанный жир.Для дальнейшего освобождения клеток от жировой ткани, передачи 10 граммов жировой ткани в новую 15-сантиметровую чашку Петри и использовать изогнутые ножницы, чтобы тщательно фарш жира, пока он не станет гладкой однородной смеси без больших кусочков жировой. Когда весь жир был обработан, используйте ложку, чтобы передать 10 миллилитров рубленой ткани в отдельные 50 миллилитров труб и добавить 30 миллилитров буфера пищеварения в каждой трубке. Затем поместите трубки в трясущимся инкубатором при 37 градусах Цельсия и 150 вращениях в минуту в течение 30-35 минут.Пищеварение завершается, когда жировой раствор однороден, абрикосового цвета и отсутствует крупными кусочками. В конце пищеварения, декант усваивается жировой раствор в 250 микрометровый фильтр сетки внутри воронки, установленных в стерильной однолитровой колбе. Когда весь объем адипоцитов суспензии был ускользает, нежный сжать сетчатый фильтр, чтобы увеличить выход адипоцитов и мыть фильтр с 50 до 100 миллилитров мытья буфера, прежде чем сжать фильтр снова.Перенесите изолированный раствор адипоцитов в разделительную воронку и добавьте буфер для мытья до тех пор, пока воронка не будет почти полностью заполнена. Аккуратно инвертировать воронку несколько раз, чтобы смешать адипоцит подвески с буфером и пусть подвеска стоять в течение двух-трех минут, пока не будет четкого разделения слоев. Когда слои отделятся, откройте сопло на воронке и медленно ускользнете от нижнего раствора в стерильную колбу.Когда все коллагеназы были удалены, собирать очищенные зрелые жировые растворы в 50 миллилитров конических труб и слегка упаковать клетки центрифугации. Затем используйте 10 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 18 калибра, чтобы удалить оставшийся буфер мытья под подвеской адипоцитов и использовать пипетку, чтобы удалить свободный липидный слой, плавающий над зрелыми адипоцитами. Для посева зрелых адипоцитов поместите проницаемый мембранный компонент с ног на голову на стерильную поверхность и аккуратно инвертировать трубки упакованных адипоцитов несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.Используя широкий наконечник пипетки скважины, добавьте 30 микролитров упакованных зрелых адипоцитов на каждую мембрану. Инвертировать панель вставки одним плавным движением так, чтобы посеянные адипоциты были на дне вставок. Поместите панель вставок в пластину из 24 хорошо, содержащую от 500 до 1000 микролитров полной 37 градусов по Цельсию среды на колодец.Затем накройте тарелку и аккуратно поместите тарелку в инкубатор культуры тканей. Каждые семь дней культуры, заменить среду через вырез отверстие в каждой вставке. После одной недели культуры, зрелые адипоциты агрегаты изолированы от подкожной жировой ткани поддерживать характерные неилокулярные липидные капли морфологии наблюдается только в зрелых адипоцитов.Лечение агонистами PPAR-GAMMA pioglitazone и rosiglitazone приводит к увеличению экспрессии в отзывчивых генах PPAR-GAMMA, в то время как лечение глюкокортикоидным рецептором агониста дексаметазона не влияет на эти гены. Аналогичным образом, агонист глюкокортикоидных рецепторов надежно управляет экспрессией генов-мишеней глюкокортикоидных рецепторов, в то время как агонисты PPAR-GAMMA не имеют существенного влияния на эти гены. Кроме того, семидневное лечение агонистами PPAR-GAMMA надежно индуцирует экспрессию генов конкретного гена коричневого жира, UCP1.Наша новая модель адипоцитов in vitro может быть использована для функциональных исследований в зрелых адипоцитах, включая поглощение глюкозы, липогенез и липолиз. С помощью этой новой техники культуры адипоцитов мы смогли показать, что зрелые белые адипоциты человека могут трансдифференцированы в коричневые адипоциты.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Подготовка мозга крысы Совокупный культур для Нейрон и исследований Глия развития

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть II: Очистка и культуры прав Островки

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Подготовка Aplysia Сенсомоторной нейронов клеточных культур

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Выделение и культуры взрослых Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Выделение предсердия человека Миоциты для одновременных измерений Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Переходные и мембранные токи

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Обнаружение РНК-связывающих белков<em&gt; In Vitro</em&gt; РНК спускающее в адипоцитов культуры

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Измерение поглощения глюкозы инсулином и сокращением в изолированных и инкубированных зрелых скелетных мышцах мышей

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...