Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Agradecemos a Xiao-Rong Peng y Stefan Hallen por proporcionar recursos y optimizar el aislamiento de adipocitos, a Martin Uhrbom por la asistencia técnica, y a Daniel Olausson y Malin Lunn por coordinar y proporcionar el adiposo humano.

Se recogieron muestras anónimas de tejido adiposo de la región abdominal de pacientes femeninas sometidas a cirugía electiva en el Hospital Universitario Sahlgrenska en Gotemburgo, Suecia. Todos los sujetos del estudio recibieron información escrita y oral antes de dar su consentimiento informado por escrito para el uso del tejido. Los estudios fueron aprobados por la Junta Regional de Revisión Etica en Gotemburgo, Suecia.
NOTA: En la Figura 1se proporciona información general sobre el método.
1. Preparación de búferes, medios de cultivo de tejidos y placas de cultivo
<ol><li>Preparar un stock de 5x Krebbs Ringer (KR) disolviendo 35,1 g de NaCl, 1,75 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4y 1,48 g de MgSO4x 7H2O en 900 ml de agua. Añadir 1,84 g de CaCl2x 2H2O y ajustar el volumen a 1 L añadiendo agua. Filtro estéril a través de un filtro de 0,22 m y guárdelo a 4 oC.</li>
	<li>A partir de la población de 5x KR, prepare 1 L de tampón que contenga 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM de glucosa y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) (denominada en lo sucesivo tampón de lavado). Ajuste el pH a 7.4.</li>
	<li>Preparar 500 ml de tampón de colagenasa que contenga 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% De BSA y 450 ml de agua (denominado en adelante tampón de digestión). NOTA: La colagenasa no debe añadirse al tampón de digestión hasta después de que el tejido adiposo haya sido pesado en el paso 2.2.</li>
	<li>Ajuste el pH del Medio 199 a 7.4.</li>
	<li>Filtro estéril tanto tampones como medio 199 a través de un matraz de filtro de 0,22 m y cálido a 37 oC. NOTA: Para ahorrar tiempo, los medios de cultivo de tejidos se pueden preparar y agregar a las placas antes de procesar el tejido adiposo. Para un formato de placa de 24 pocillos(Figura 1A),utilice 0,5 x 1 ml/pozo de la mezcla de nutrientes kódica/jamón de Dulbecco F12 (DMEM/F12), 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (penn/strep) y 20 nM de insulina. Las moléculas pequeñas y otros agentes farmacológicos estables también se pueden añadir en este momento a los medios de comunicación en el diseño deseado. Colocar las placas en una incubadora de cultivo de tejidos (37 oC, 5% CO2).</li>
</ol>2. Disección del tejido adiposo subcutáneo humano
NOTA: Trabajar dentro de un armario de seguridad biológica y utilizar la técnica estéril durante todo el proceso de aislamiento, así como el uso exclusivo de equipos autoclavedos y estériles.
<ol><li>Colocar el tejido adiposo humano en una placa de petri de 15 cm y añadir un pequeño volumen de medio 199 para mantenerlo hidratado durante la disección.</li>
	<li>Trabajando con piezas de adiposo aproximadamente del tamaño de una pelota de golf, agarre grandes recipientes fibrosos con pinzas y libere suavemente los adipocitos raspando el adiposo con la parte posterior de las tijeras cerradas. Deseche los trozos grandes de tejido fibroso. Pesar la grasa recortada.</li>
</ol>3. Tratamiento de la colagenasa
<ol><li>Añadir la colagenasa al tampón de digestión (ver paso 1.3) a una concentración de 1 mg/ml. Filtrar estérilmente la solución utilizando un filtro estéril de 0,22 m. NOTA: Se recomiendan tres ml de tampón de digestión por gramo de grasa (es decir, para 100 g de grasa, preparar 300 ml de tampón de digestión con 300 mg de colagenasa tipo 2). ADVERTENCIA: La colatasa tipo 2 es peligrosa para los ojos, la piel y puede causar irritación respiratoria. Use guantes, protección para los ojos y trabaje en una capucha ventilada cuando manipule la colagenasa.</li>
	<li>Mover aproximadamente 10 g de tejido adiposo a un plato petri de 15 cm y picar la grasa cuidadosamente usando un par de tijeras curvas hasta que se convierta en una mezcla homogénea suave y no haya grandes trozos de adiposo a la izquierda. Repita el proceso hasta que se haya procesado toda la grasa. NOTA: Cada ronda debe tomar aproximadamente 2 minutos y las piezas adiposas deben ser lo suficientemente pequeñas como para que puedan ser pipeteadas usando una punta de pipeta de diámetro ancho. Este paso es crucial para producir adipocitos de alta calidad. Si las piezas son demasiado grandes, los tiempos de digestión tendrán que extenderse, comprometiendo la viabilidad celular.</li>
	<li>Transfiera la grasa picada en tubos cónicos de 50 ml con una cuchara. Añadir 10 ml de tejido picado y 30 ml de tampón de digestión a cada tubo. Reduzca la escala a volúmenes apropiados si hay menos de 10 ml de grasa picada disponible.</li>
	<li>Digerir el tejido a 37oC en una incubadora de agitación con agitación constante a 150 rpm durante 30 x 45 min. Después de 30 minutos, compruebe el proceso cada 5 minutos para evitar la digestión excesiva. NOTA: La digestión se completa cuando la solución adiposa es homogénea sin piezas grandes y tiene un color albaricoque.</li>
</ol>4. Filtración de la suspensión celular y purificación de los adipocitos maduros
<ol><li>Coloque un embudo encima de un matraz estéril de 1 L y coloque un filtro de malla estéril de 250 m dentro del embudo. Vierta la solución de grasa digerida en el filtro para eliminar el tejido no digerido.</li>
	<li>Cuando toda la suspensión de adipocitos ha pasado a través del filtro, apriete suavemente el filtro de malla para aumentar el rendimiento de los adipocitos. Vierta aproximadamente 50 x 100 ml de tampón de lavado en el filtro para enjuagarlo y apretar el filtro de nuevo.</li>
	<li>Vierta la suspensión aislada de adipocitos del matraz en un embudo de separación y agregue el tampón de lavado hasta que el embudo esté casi completamente lleno. Invierta suavemente el embudo unas cuantas veces para mezclar la suspensión de adipocitos con el tampón.</li>
	<li>Deje reposar la suspensión durante 2 x 3 minutos hasta que haya una separación distinta de 2 capas(Figura 1B),con una capa amarilla superior que contenga los adipocitos maduros y los lípidos libres y una capa inferior que contenga el tampón y la fracción vascular de la estroma adiposa (SVF).</li>
	<li>Abra la boquilla en el embudo de separación y eluda lentamente la solución inferior en un matraz estéril (las células del SVF se pueden peletizar y recoger después de la centrifugación a 200 x g durante 7 min). Mantenga la capa superior con los adipocitos maduros en el embudo de separación.</li>
	<li>Repita el proceso de lavado en los pasos 4.3 a 4.5 tres veces para lavar a fondo los adipocitos maduros y eliminar toda la colagenasa.</li>
</ol>5. Embalaje de los Adipocitos Maduros
<ol><li>Abra la boquilla y recoja la suspensión de adipocitos maduros purificados en tubos cónicos de 50 ml.</li>
	<li>Empaque ligeramente los adipocitos maduros girando los tubos a 50 x g durante 3 min.</li>
	<li>Utilice una aguja de 18 G y una jeringa para extraer el tampón de lavado restante debajo de la suspensión del adipocitos.</li>
	<li>Retire la capa lípido libre (aceite de la pequeña porción de adipocitos que se rompió durante el procedimiento de aislamiento) flotando en la parte superior de los adipocitos maduros mediante el uso de una pipeta. NOTA: Para reducir el riesgo de que los adipocitos goteen las membranas en el paso 6.5, es importante que la capa de lípidos y todo el tampón de lavado se hayan eliminado cuando los adipocitos maduros se siembren en las membranas. Por esta razón recoger los adipocitos en 3 tubos. Las muestras que se recogen en último lugar tendrán el mayor número de lípidos de arrastre y, por lo tanto, serán de la menor calidad. Sin embargo, con el pipeteo cuidadoso se pueden utilizar estas muestras.</li>
</ol>6. Sembrado de Adipocitos Maduros
<ol><li>Abra el envase que contiene los insertos de membrana permeables(Tabla de materiales)y saque el componente de membrana. Voltéalo al revés y colóquelo sobre una superficie estéril para que las membranas se enfrenten al techo.</li>
	<li>Pipeta 30 l de adipocitos maduros envasados en cada una de las membranas(Figura 1C). Evite tocar la membrana con la punta. Utilice puntas de pipeta de diámetro ancho para sembrar las células, o utilice tijeras para cortar un pequeño trozo de una punta de pipeta para hacerla más ancha.</li>
	<li>Invierta suavemente los tubos de 50 ml con adipocitos envasados varias veces a lo largo del proceso de sembración para garantizar una distribución uniforme de adipocitos con diferentes tamaños.</li>
	<li>Lleve las placas multipocillos preparadas que contienen los medios de la incubadora al gabinete de bioseguridad y retire las tapas. Recoger las membranas sembradas con adipocitos y agarrarlas desde la parte inferior para que pueda ser invertida en el paso 6.5.</li>
	<li>En un movimiento suave invertir las membranas con los adipocitos en la parte superior para que los adipocitos sembrados ahora están mirando hacia abajo(Figura 1D). Baje la placa con adipocitos en los pocillos que contienen medios(Figura 1E).</li>
	<li>Coloque la tapa en la placa y transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora de cultivodes tisulares. Evite el movimiento rápido de la placa ya que los adipocitos se pueden desalojar fácilmente inicialmente. NOTA: Las células tardan unos días en adherirse más firmemente a la membrana.</li>
</ol>7. Mantenimiento de Adipocitos y Cosecha para Análisis
<ol><li>Cambie los medios al menos cada 7 días. Retire y añada medios a través del orificio de corte en cada plaquita de membrana. Para extraer el medio, utilice una jeringa y una aguja, una varita aspiradora o una pipeta con una punta p200. Para añadir medios, utilice una pipeta y pipetee lentamente nuevos medios en los pozos a lo largo del lado de la pared para evitar molestar a los adipocitos. NOTA: Los adipocitos se han cultivado durante 2 semanas con un cambio de medios después de 7 días. Sin embargo, diferentes orígenes adicionales y preguntas experimentales pueden beneficiarse de un aumento de los cambios en los medios de comunicación.</li>
	<li>Para cosechar el ARN, retire el medio como se describe en el paso 7.1, y agregue 500 l de tampón de lisis(Tabla de materiales)directamente en los pozos para aplicar las células. Para fijar las células para la toma de imágenes, agregue formaldehído directamente al pozo a una concentración final del 1%. NOTA: Las celdas se pueden almacenar a 4 oC.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El cultivo agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC) es un nuevo método para el cultivo a largo plazo de adipocitos maduros recién aislados. Al configurar MAAC hay algunos pasos críticos en el protocolo que afectan en gran medida el rendimiento, la calidad y la viabilidad de los adipocitos maduros. Mucho esfuerzo se debe poner en picar la grasa en el paso 3.2 ya que este paso influye directamente en la cantidad de tiempo que los adipocitos están expuestos a la colagenasa. Si las piezas de adiposo son demasiado grandes, el tiempo de digestión tendrá que extenderse lo que afecta negativamente a la viabilidad de las células. Por el contrario, si el tejido se procesa demasiado finamente con tijeras, la viabilidad también puede verse afectada. Para un cultivo exitoso de adipocitos maduros como MAAC, uno debe prestar especial atención a los siguientes pasos: para la sembración exitosa de los adipocitos en las membranas, es crucial que el tampón de lavado libre de lípidos y arrastre se elimine de los adipocitos maduros en los pasos 5.3 y 5.4. El lípido restante o tampón de lavado reducirá la tensión superficial de los adipocitos y aumentará el riesgo de que los adipocitos goteen de las membranas cuando se volteen. Cuando los adipocitos son sembrados y en medios, las células permanecen en contacto con la membrana principalmente a través de la flotabilidad, por lo tanto se recomienda una técnica lenta y suave al cambiar los medios para no perder células. Retire los medios de la parte inferior de los pozos como se describe en el paso 7.1 y agregue los medios pipeteando lentamente los medios por los lados de las paredes. Por último, una sugerencia de ahorro de tiempo es preparar las placas con medios y tratamientos antes del proceso de aislamiento de adipocitos. Especialmente para diseños experimentales complejos, la pre-preparación de las placas puede ahorrar mucho tiempo y asegura que los adipocitos se colocan en medios con sus tratamientos tan pronto como se aíslan.
Una ventaja de usar MAAC en comparación con la diferenciación de preadipocitos es que los medios MAAC utilizados es muy simple y no requiere un cóctel hormonal no fisiológico. Aquí hemos cultivado MAAC en medios ricos en glucosa (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn/strep, y 20 nM insulina. Es importante destacar que hemos encontrado que la insulina es absolutamente necesaria para la inducción impulsada por rosiglitazona/pioglitazona de UCP110. La insulina, sin embargo, no es necesaria para mantener el fenotipo adipogénico de las células. Por lo tanto, dependiendo de la pregunta experimental, la insulina puede incluirse u omitirse.
El procedimiento detallado anteriormente se ha optimizado para el aislamiento y el cultivo de adipocitos humanos. Sin embargo, el ratón, y posiblemente los adipocitos de otros organismos, también se pueden cultivar como MAAC. Si los adipocitos de ratón deben ser cultivados como MAAC hay consideraciones adicionales y precauciones que deben tenerse en cuenta. Hemos descubierto que los adipocitos maduros de ratones son mucho más frágiles que los de los humanos. Como resultado, el tiempo de digestión debe acortarse a un mínimo absoluto para aumentar la viabilidad celular. También encontramos que los adipocitos de ratones jóvenes (de 8 semanas de edad y menores) proporcionaron los resultados más robustos y reproducibles. Por último, MAAC de ratón se puede cultivar hasta una semana, sin embargo, dado que su fenotipo adipogénico parece menos estable que los seres humanos (que se puede cultivar durante al menos dos semanas) recomendamos cultivar el ratón MAAC por el tiempo mínimo necesario para abordar preguntas experimentales.
Dado que el modelo MAAC se basa en el uso de membranas permeables, una ventaja de esta técnica es la posibilidad de co-cultivar adipocitos maduros con otros tipos de células. Hemos demostrado previamente la capacidad de los adipocitos maduros y macrófagos para hablar entre sí a través del uso de MAAC10. Esto abre oportunidades para explorar más a fondo el vínculo entre la obesidad, la resistencia a la insulina y las respuestas inmunitarias15,16,17. Los experimentos futuros podrían incorporar otros tipos de células como hepatocitos, preadipocitos, células endoteliales o células pancreáticas para aumentar aún más la complejidad y la relevancia traslacional del modelo MAAC e investigar la conversación cruzada entre varios tipos de células.
A pesar de que MAAC ha demostrado ser superior en el mantenimiento de la funcionalidad y la identidad de los adipocitos en relación con otros modelos in vitro de adipocitos, también tiene limitaciones que deben ser consideradas. En comparación con el uso de adipocitos diferenciados de las células precursoras, MAAC es un modelo más laborioso y lento. Las placas con membranas también son más caras en comparación con las placas de cultivo celular regulares. Es importante destacar que los adipocitos maduros deben estar recién aislados cada vez después de la siembra y no pueden expandirse o congelarse en poblaciones como células precursoras. Por lo tanto, esto requiere tener acceso a muestras frescas de tejido adiposo blanco, pero también añade un nivel de complejidad derivado de las variaciones del donante a donante.
Aquí hemos presentado un protocolo detallado para aislar adipocitos maduros humanos y la creación de MAAC. Hemos demostrado que los adipocitos cultivados como MAAC siguen siendo viables durante dos semanas, su firma genética adipogénica se conserva y responden a la diversa agonismo farmacológica. El uso de MAAC permite el estudio de adipocitos entre habla entre habla entre habla entre habla y otros tipos de células, y la evaluación de cambios fenotípicos a largo plazo de adipocitos maduros en respuesta a diferentes estímulos.

El aumento mundial de las comorbilidades relacionadas con la obesidad y la obesidad requiere el desarrollo de nuevas terapias. El tejido adiposo blanco (WAT) es un importante regulador del metabolismo de todo el cuerpo, homeostasis energética, y es un actor central en el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2 (T2D)1,2. Durante el consumo crónico de calorías, los adipocitos se agrandan para manejar el excedente de energía. Sin embargo, la capacidad de almacenamiento de lípidos de adipocitos puede ser superada, lo que resulta en una elevación de los niveles circulantes de ácidos grasos y un mayor almacenamiento en tejidos periféricos no adiposos y conduce a la lipotoxicidad3,4.
La falta de modelos in vitro de adipocitos con alta relevancia traslacional es un desafío clave en el desarrollo de nuevos tratamientos para la obesidad y la T2D. El modelo explant ex vivo, donde se cultivan pequeños trozos de tejido adiposo, se asocia con alteraciones rápidas en la expresión génica adipogénica impulsadas por la hipoxia y la inflamación5,6. Cultivos de techo (CC) donde los adipocitos maduros flotan y se adhieren a la parte superior de los matraces rellenos de medios, desdiferenciando rápidamente en células similares a fibroblastos que carecen de lípidos7,8,9,10. El modelo más utilizado son los adipocitos diferenciados in vitro de los precursores comprometidos. Las células diferenciadas son, sin embargo, morfológicamente distintas de los adipocitos maduros in vivo ya que son mucho más pequeñas en tamaño y carecen de una gota de lípido unilocular. Otras limitaciones con este modelo incluyen la necesidad no fisiológica de un cóctel químico para impulsar la diferenciación, así como la variabilidad en la eficiencia de diferenciación que puede verse afectada por una serie de factores11,12,13,14.
Recientemente hemos desarrollado el cultivo de agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC), un método para el cultivo a largo plazo de adipocitos maduros recién aislados, donde los adipocitos se cultivan bajo membranas permeables10. El análisis imparcial de los datos de secuenciación de ARN ha demostrado que en relación con los explantes de tejido adiposo y los adipocitos diferenciados in vitro, el MAAC es más similar a los adipocitos recién aislados. MAAC se puede utilizar para el cultivo de adipocitos maduros aislados de tejido adiposo subcutáneo y visceral, así como adipocitos de sujetos obesos y magros. Esta metodología permite el estudio de cambios fenotípicos de adipocitos a largo plazo y facilita el cocultivo de adipocitos con otros tipos de células. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de adipocitos maduros del tejido adiposo humano y cómo configurar el sistema MAAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

La desregulación del tejido adiposo blanco (WAT) desempeña un papel central en el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2 (T2D). Para desarrollar nuevos tratamientos para la T2D, se requieren modelos de adipocitos in vitro más relevantes fisiológicamente. Este estudio describe una nueva técnica para aislar y cultivar adipocitos humanos maduros. Este método se titula MAAC (cultivo de agregado de adipocitos maduros de membrana), y en comparación con otros modelos in vitro de adipocitos, MAAC posee una firma genética adipogénica que es la más cercana a los adipocitos recién maduros. Usando MAAC, los adipocitos se pueden cultivar de pacientes magros y obesos, diferentes depósitos de adipos, co-cultivados con diferentes tipos de células, y lo que es importante, se pueden mantener en cultivo durante 2 semanas. Experimentos funcionales también se pueden realizar en MAAC incluyendo la acumulación de glucosa, lipogénesis, y lipólisis. Por otra parte, MAAC responde robustamente a la diversa agonismo farmacológica y se puede utilizar para estudiar cambios fenotípicos de adipocitos, incluyendo la transdiferenciación de adipocitos blancos en células grasas de forma marrón.

Adipocitos maduros cultivados como MAAC preserva su función, fenotipo, y se pueden utilizar para estudiar las respuestas de adipocitos a varios tratamientos farmacológicos. Después de 1 semana de cultivo MAAC aislado de tejido adiposo subcutáneo mantener la característica gota de lípido unilocular que se encuentra sólo en adipocitos maduros (Figura 2A). El MAAC se cultivó durante 1 semana mientras se trataba con los agonistas PPAR rosiglitazona (Rosi) y pioglitazona (Pio), o con la dexametasona agonista del receptor de glucocorticoides (GR) (Dex) para determinar si los diferentes agonistas del receptor de hormona sión nuclear (NHR) impulsan cambios previstos en los genes diana aguas abajo en EL MAAC. Rosi y Pio aumentaron la expresión de los genes sensibles PPARó FABP4 y LPL en 4 y 2 x 3 veces, respectivamente, mientras que la dexametasona no tuvo ningún efecto(Figura 2B). Del mismo modo, la dexametasona impulsó robustamente la expresión génica de los genes diana GR APOD y FKBP5 en 13 y 55 veces respectivamente, mientras que los agonistas del PPAR no tuvieron efectos significativos. Hemos demostrado previamente que los adipocitos blancos maduros humanos recién aislados pueden transdiferenciaren en un fenotipo marrón en MAAC cuando se tratan con Rosi10. Un tratamiento de 7 días con Rosi o Pio indujo robustamente la expresión génica del gen específico de la grasa marrón UCP1 por 44-65 veces, así como aumentó la expresión del marcador de grasa marrón PDK4 12-18 veces(Figura 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Figura 1: Diagrama visual de la instalación de MAAC. (A) Preparación del medio. (B) Aislamiento y embalaje de adipocitos maduros. (C) Sembrar adipocitos maduros en membranas. (D) Invertir membranas manteniendo los adipocitos unidos. (E) Bajar las membranas en el medio y cambiar el medio. Esta cifra ha sido modificada de Harms et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Figura 2: MAAC mantiene la apariencia unilocular durante una semana y responde a la diversa agonismo farmacológica. (A) Representante 4x y 10x imágenes de campo brillante de MAAC después de una semana de cultivo. Los adipocitos que tienen un diámetro promedio de 100 m con grandes gotas de lípidos unioculares son fácilmente discernibles. (B) niveles de ARNm de los genes diana de PPAR y de los genes diana del receptor de glucocorticoides (GR) en MAAC después de 7 días de tratamiento con vehículo (Vehc), rosiglitazona (Rosi), pioglitazona (Pio) o dexametasona (Dex). Rosi, Pio y Dex se utilizaron a una concentración final de 10 m.(C)niveles de ARNm de genes enriquecidos con grasa marrón en MAAC después de 7 días de tratamiento con vehículo (Vehc), rosiglitazona (Rosi), pioglitazona (Pio) o dexametasona (Dex). Rosi, Pio y Dex se utilizaron a una concentración final de 10 m. Para todos los datos de expresión génica, la proteína de unión TATA (TBP) se utilizó como control de normalización interna. Las estadísticas se calcularon utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. (media: SD, n a 3, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

El cultivo agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC) es un nuevo método para el cultivo de adipocitos humanos maduros. Aquí detallamos cómo aislar adipocitos de adiposo humano y cómo configurar MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Un desafío en el campo de la biología adiposa ha sido mantener el adipocitos maduros en la cultura. Hemos desarrollado un nuevo método que permite el estudio del adipocitos a largo plazo a lo largo de grandes cambios. Nuestra técnica de cultivo de adipocitos permite el estudio de las interacciones celulares y con suerte será útil para el desarrollo de nuevos tratamientos para la diabetes y la obesidad.Es importante seguir el protocolo cuidadosamente, ya que hay algunos pasos críticos que afectan en gran medida la calidad del gen y la viabilidad de los adipocitos maduros. Por ejemplo, antes del enchapado asegúrese de que todos los lípidos libres y el tampón de lavado se han eliminado de lo contrario los lipocitos podrían arrancar cuando las inserciones están invertidas. Después de recibir la muestra de tejido adiposo subcutáneo humano, coloque el tejido en un gabinete de seguridad biológica estéril en una placa Petri de 15 centímetros.Un pequeño volumen de 199 medio al plato. Utilice pinzas para agarrar grandes vasos fibrosos dentro del tejido y utilice la parte posterior de la punta de un par de tijeras cerradas para raspar suavemente el adipose a lo largo del vaso para liberar los adipocitos. Cuando se hayan recogido todas las células, deseche las grandes piezas de tejido fibroso y pese la grasa recortada.Para liberar aún más las células del tejido graso, transfiera 10 gramos de tejido adiposo a una nueva placa Petri de 15 centímetros y utilice tijeras curvas para picar cuidadosamente la grasa hasta que se convierta en una mezcla homogénea lisa sin grandes trozos de adiposo. Cuando se haya procesado toda la grasa, utilice una cuchara para transferir 10 mililitros de tejido picado a tubos individuales de 50 mililitros y agregue 30 mililitros de tampón de digestión a cada tubo. A continuación, coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados y 150 rotaciones por minuto durante 30 a 35 minutos.La digestión se completa cuando la solución adiposa es homogénea, de color albaricoque y ausente de piezas grandes. Al final de la digestión, decantar la solución de grasa digerida en un filtro de malla de 250 micrómetros dentro de un embudo colocado en un matraz estéril de un litro. Cuando se haya eludido todo el volumen de suspensión de adipocitos, apriete suavemente el filtro de malla para aumentar el rendimiento de los adipocitos y lave el filtro con 50 a 100 mililitros de tampón de lavado antes de apretar el filtro de nuevo.Transfiera la solución de adipocitos aisladas a un embudo de separación y agregue el búfer de lavado hasta que el embudo esté casi completamente lleno. Invierta suavemente el embudo varias veces para mezclar la suspensión del adipocitos con el tampón y deje reposar la suspensión durante dos o tres minutos hasta que haya una separación distinta de las capas. Cuando las capas se hayan separado, abra la boquilla en el embudo y eluda lentamente la solución inferior en un matraz estéril.Cuando se haya eliminado toda la colagenasa, recoja la solución de adipocitos maduros purificados en tubos cónicos de 50 mililitros y empaque ligeramente las células por centrifugación. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para quitar el tampón de lavado restante debajo de la suspensión del adipocitos y utilice una pipeta para eliminar la capa de lípidos libres que flota por encima de los adipocitos maduros. Para la siembra de los adipocitos maduros, coloque el componente de inserción de membrana permeable boca abajo en una superficie estéril e invierta suavemente los tubos de adipocitos embalados varias veces para asegurar una distribución uniforme de las células.Usando una punta de pipeta de diámetro ancho, agregue 30 microlitros de adipocitos maduros envasados en cada membrana. Invierta el panel de inserción en un movimiento suave para que los adipocitos de semillas estén en la parte inferior de las plaquitas. Coloque el panel de plaquitas en una placa de 24 pozos que contenga 500 a 1.000 microlitros de medio celsius completo de 37 grados por pozo.A continuación, cubra el plato y coloque cuidadosamente el plato en una incubadora de cultivo de tejido. Cada siete días de cultivo, reemplace el medio a través del orificio de corte en cada plaquita. Después de una semana de cultivo, los agregados de adipocitos maduros aislados del tejido adiposo subcutáneo mantienen la morfología característica de las gotas lipídicas uniloculares observada sólo en adipocitos maduros.El tratamiento con los agonistas PPAR-GAMMA pioglitazona y rosiglitazona da como resultado un aumento de la expresión en los genes sensibles PPAR-GAMMA, mientras que el tratamiento con la dexametasona agonista agonista del receptor de glucocorticoides no tiene ningún efecto sobre estos genes. Del mismo modo, el agonista del receptor glucocorticoides impulsa robustamente la expresión génica de los genes diana del receptor de glucocorticoides, mientras que los agonistas PPAR-GAMMA no tienen efectos significativos en estos genes. Además, el tratamiento de siete días con los agonistas PPAR-GAMMA induce robustamente la expresión génica del gen específico de la grasa marrón, UCP1.Nuestro nuevo modelo in vitro de adipocitos se puede utilizar para los estudios funcionales en adipocitos maduros, incluyendo la absorción de glucosa, lipogénesis y lipólisis. Con esta nueva técnica de cultivo de adipocitos hemos sido capaces de mostrar que los adipocitos blancos maduros humanos pueden transdiferenciarse en adipocitos marrones.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Investigación

Biología

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

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El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

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La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...