Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Vi tackar Xiao-Rong Peng och Stefan Hallen för att de har resurser och optimerat isoleringen, Martin Uhrbom för teknisk assistans och Daniel Olausson och Malin Lönn för att de koordinerade och tillhandahåller den mänskliga adiposen.

Anonyma prover av fettvävnad samlades in från bukregionen av kvinnliga patienter som genomgår elektiv kirurgi vid Sahlgrenska universitetssjukhuset i Göteborg. Alla försökspersoner fick skriftlig och muntlig information innan de gav skriftligt informerat samtycke för användning av vävnaden. Studierna godkändes av Regionetisk prövningsnämnd i Göteborg.
EN ÖVERSIKT ÖVER metoden finns i figur 1.
1. Beredning av buffertar, vävnadskultur media och kulturplattor
<ol><li>Förbered en 5x Krebbs Ringer (KR) lager genom upplösning 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4, och 1,48 g MgSO4·7H2O i 900 ml vatten. Tillsätt 1,84 g CaCl2·2H2O och justera volymen till 1 L genom att tillsätta vatten. Sterilt filter genom ett 0,22 μm filter och förvaras vid 4 °C.</li>
	<li>Från 5x KR-lagret, förbereda 1 L buffert som innehåller 1x kr, 25 mM HEPES, 2 mM glukos och 2% bovin serum albumin (BSA) (nedan kallad tvättbuffert). Justera pH till 7,4.</li>
	<li>Förbered 500 ml kollagenbuffert som innehåller 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% BSA och 450 ml vatten (kallas matsmältningsbuffert). OBS: Kollagen bör inte läggas till matsmältningsbufferten förrän efter fettvävnaden har vägts i steg 2.2.</li>
	<li>Justera pH-värdet på Medel 199 till 7,4.</li>
	<li>Sterilt filtrera både buffertar och medium 199 genom en 0,22 μm filterkolv och värm till 37 °C. OBS: För att spara tid, vävnadskultur media kan förberedas och läggas till plattor innan bearbetning av fettvävnad. För en 24-brunn tallrik format(figur 1A), använd 0,5−1 ml/well av Dulbecco modifierade Eagle's medium / Hams näringsblandning F12 (DMEM/F12), 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (penn / strep) och 20 nM insulin. Små molekyler och andra stabila farmakologiska medel kan också läggas till vid denna tid till media i önskad layout. Placera plattorna i en vävnadskulturinkubator (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>2. Dissekering av human subkutan fettvävnad
OBS: Arbeta inom ett biologiskt säkerhetsskåp och använd steril teknik under hela isoleringsprocessen, samt exklusiv användning av autoklaverad och steril utrustning.
<ol><li>Placera den mänskliga fettvävnaden i en 15 cm petriskål och tillsätt en liten volym medium 199 för att hålla den återfuktad under dissekering.</li>
	<li>Arbeta med bitar av fett ungefär lika stor som en golfboll, ta tag i stora fibrotiska kärl med pincett och försiktigt släppa adipocyter genom att skrapa fettet med baksidan av slutna saxar. Kasta de stora bitar av fibrotisk vävnad. Väg det trimmade fettet.</li>
</ol>3. Kollagen Behandling
<ol><li>Tillsätt kollagen till matsmältningsbufferten (se steg 1.3) vid en koncentration av 1 mg/ml. Sterilt filtrera lösningen med ett sterilt filter på 0,22 μm. OBS: Tre ml matsmältningsbuffert per gram fett rekommenderas (dvs. för 100 g fett, förbereda 300 ml matsmältningsbuffert med 300 mg typ 2 kollagen). VARNING: Typ 2 Kollagen är farligt för ögon, hud och kan orsaka irritation i luftvägarna. Använd handskar, ögonskydd och arbeta i en ventilerad huva vid hantering av kollagen.</li>
	<li>Flytta ca 10 g fettvävnad till en 15 cm petriskål och hacka fettet försiktigt med hjälp av ett par böjdsax tills det blir en slät homogen blandning och det finns inga stora bitar av fett kvar. Upprepa processen tills allt fett har bearbetats. OBS: Varje runda bör ta ca 2 min och fettbitarna bör vara tillräckligt små så att de kan pipetted med hjälp av en bred bar pipett spets. Detta steg är avgörande för att ge högkvalitativa adipocyter. Om bitarna är för stora, matsmältningstider måste förlängas, kompromissa cell viabilty.</li>
	<li>Överför det malet fettet till 50 ml koniska rör med hjälp av en sked. Tillsätt 10 ml malet vävnad och 30 ml matsmältningsbuffert till varje rör. Skala ner till lämpliga volymer om mindre än 10 ml malet fett finns tillgängligt.</li>
	<li>Smält vävnaden vid 37 °C i en skakningsinkubator med konstant agitation vid 150 rpm i 30−45 min. Efter 30 min, kontrollera processen var 5 min för att undvika över-matsmältningen. OBS: Matsmältningen är klar när fettlösningen är homogen utan några stora bitar och har en aprikosfärg.</li>
</ol>4. Filtrering av cellfjädring och rening av mogna Adipocyter
<ol><li>Placera en tratt ovanpå en 1 L steril kolv och placera ett sterilt 250 μm meshfilter inuti tratten. Häll den smälta fettlösningen i filtret för att ta bort den osmälta vävnaden.</li>
	<li>När alla adipocyte fjädring har passerat genom filtret, försiktigt pressa nätfiltret för att öka avkastningen av adipocyter. Häll ca 50−100 ml tvättbuffert i filtret för att skölja det och pressa filtret igen.</li>
	<li>Häll den isolerade adipocytsuspensionen från kolven i en separationstratt och tillsätt tvättbuffert tills tratten nästan är helt fylld. Vänd försiktigt in tratten några gånger för att blanda adipocyte suspensionen med bufferten.</li>
	<li>Låt fjädringen stå i 2−3 min tills det finns en distinkt separation av 2 lager(figur 1B), med ett toppgult lager som innehåller mogna adipocyter och fri lipid och ett bottenskikt som innehåller bufferten och fettstromavaskulär fraktion (SVF).</li>
	<li>Öppna munstycket på separationstatta och häll långsamt den nedre lösningen i en steril kolv (celler från SVF kan pelleteras och samlas in efter centrifugering vid 200 x g i 7 min). Håll det översta lagret med mogna adipocyter i separationstratt.</li>
	<li>Upprepa tvättprocessen i steg 4.3−4.5 tre gånger för att noggrant tvätta de mogna adipocyterna och ta bort alla kollagen.</li>
</ol>5. Förpackning av mogna Adipocytes
<ol><li>Öppna munstycket och samla in den renade mogna adipocytfjädringen i 50 ml koniska rör.</li>
	<li>Packa lätt de mogna adipocyterna genom att snurra rören på 50 x g i 3 min.</li>
	<li>Använd en 18 G nål och en spruta för att ta bort den återstående tvättbufferten under adipocytsuspensionen.</li>
	<li>Ta bort det fria lipidskiktet (olja från den lilla delen av adipocyter som bröt under isoleringsproceduren) som flyter ovanpå de mogna adipocyterna med hjälp av en pipett. OBS: För att minska risken för att adipocyter kommer att droppa av membranen i steg 6.5, är det viktigt att lipidskiktet och alla tvättbuffert har tagits bort när de mogna adipocyterna är seedade på membran. Av denna anledning samla adipocyter i 3 rör. De prover som samlas in sist kommer att ha mest överföring lipid och kommer därför att vara av lägsta kvalitet. Men med noggrann rörledningar dessa prover kan användas.</li>
</ol>6. Sådd av mogna Adipocytes
<ol><li>Öppna förpackningen som innehåller permebara membranskär(Materials table)och ta ut membrankomponenten. Vänd den upp och ner och placera på en steril yta så att membranen vetter mot taket.</li>
	<li>Pipett 30 μl förpackade mogna adipocyter på vart och ett av membranen(figur 1C). Undvik att vidröra membranet med spetsen. Använd wide-bore pipett spetsar för att så cellerna, eller använda sax för att skära av en liten bit av en pipett spets för att göra det bredare.</li>
	<li>Vänd försiktigt in 50 ml-rören med packade adipocyter flera gånger under hela såddprocessen för att säkerställa en jämn fördelning av adipocyter med olika storlekar.</li>
	<li>Ta med de beredda multiwellplattorna som innehåller mediet från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet och ta bort locken. Plocka upp membranen seedade med adipocyter och ta tag i den från botten så att den kan inverteras i steg 6.5.</li>
	<li>I en slät rörelse invertera membranen med adipocyter på toppen så att de seedade adipocyter nu vänd nedåt(figur 1D). Sänk plattan med adipocyter i brunnarna som innehåller media(figur 1E).</li>
	<li>Sätt locket på plattan och försiktigt överföra plattan till en vävnadskultur inkubator. Undvik snabb rörelse av plattan eftersom adipocyter lätt kan rubbas initialt. OBS: Det tar några dagar för cellerna att hålla sig fastare vid membranet.</li>
</ol>7. Underhåll av Adipocytes och skörd för analys
<ol><li>Ändra media minst var 7:e dag. Ta bort och tillsätt media via utskärningshålet i varje membraninsats. För att ta bort mediet, använd en spruta och en nål, en aspirating trollstav, eller en pipett med en p200 spets. För att lägga till media, använd en pipett och långsamt pipett nya medier i brunnarna längs sidan av väggen för att undvika att störa adipocyter. OBS: Adipocytes har odlats i 2 veckor med en media förändring efter 7 dagar. Olika fettursprung och experimentella frågor kan dock dra nytta av ökade medieförändringar.</li>
	<li>För att skörda RNA, ta bort mediet enligt beskrivningen i steg 7.1 och tillsätt 500 μl lysbuffert(Materialtabell)direkt i brunnarna för att lyse cellerna. För att fixa cellerna för bildbehandling, tillsätt formaldehyd direkt till brunnen vid en slutlig koncentration på 1%. OBS: Cellerna kan sedan lagras vid 4 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Membran mogen adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för den långsiktiga kulturen av nyisolerade mogna adipocyter. Vid inrättandet maac finns det några kritiska steg i protokollet som i hög grad påverkar avkastning, kvalitet och lönsamhet av de mogna adipocyter. Mycket arbete bör läggas på att malet fett i steg 3,2 eftersom detta steg direkt påverkar den tid adipocyter utsätts för kollagen. Om delar av fettär för stora, måste matsmältningstiden förlängas vilket negativt påverkar cellernas livskraft. Omvänt, om vävnaden bearbetas för fint med sax, kan livskraften påverkas också. För framgångsrik kultur av mogna adipocyter som MAAC, bör man ägna särskild uppmärksamhet åt följande steg: för framgångsrik sådd av adipocyter på membranen, är det viktigt att fri lipid och överföring tvätta buffert tas bort från mogna adipocyter i steg 5.3 och 5.4. Återstående lipid eller tvätt buffert kommer att minska ytspänningen i adipocyter och öka risken för adipocyter droppande-off membranen när de vänds. När adipocyterna är seedade och i media, cellerna förblir i kontakt med membranet främst genom flytkraft, alltså en långsam och mild teknik rekommenderas när du byter media för att inte förlora celler. Ta bort media från botten av brunnarna som beskrivs i steg 7.1 och lägg till media genom att långsamt pipetting media ner sidorna av väggarna. Slutligen är ett tidsbesparande förslag att förbereda plattorna med media och behandlingar innan adipocyte isoleringsprocessen. Särskilt för komplexa experimentella mönster, pre-förbereda plattorna kan spara mycket tid och säkerställer att adipocyter placeras i media med sina behandlingar så snart de är isolerade.
En fördel med att använda MAAC jämfört med att skilja preadipocytes är att MAAC media används är mycket enkel och inte kräver en ofysiologisk hormon cocktail. Här har vi odlade MAAC i glukos-rika medier (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, och 20 nM insulin. Viktigt, Vi har funnit att insulin absolut krävs för rosiglitazone/pioglitazone driven induktion av UCP110. Insulin, dock, krävs inte för att upprätthålla cellernas adipogena fenotyp. Beroende på den experimentella frågan kan insulin därför inkluderas eller utelämnas.
Förfarandet ovan har optimerats för isolering och kultur av mänskliga adipocyter. Men mus, och eventuellt andra organismers adipocyter, kan också odlas som MAAC. Om mus adipocyter ska odlas som MAAC finns det ytterligare överväganden och försiktighetsåtgärder som bör hållas i åtanke. Vi har funnit att mogna adipocyter från möss är mycket bräckligare än de från människor. Som ett resultat bör matsmältningstiden förkortas till ett absolut minimum för att öka celllönsamheten. Vi fann också att adipocyter från unga möss (8 veckor gamla och yngre) gav de mest robusta och reproducerbara resultaten. Slutligen kan musen MAAC odlas i upp till en vecka, men med tanke på att deras adipogenic fenotyp verkar mindre stabil än människor (som kan odlas genom minst två veckor) rekommenderar vi odling mus MAAC för minsta nödvändiga tid att ta itu med experimentella frågor.
Eftersom MAAC-modellen är baserad på att använda genomsläppliga membran, är en fördel med denna teknik möjligheten att sammogna mogna adipocyter med andra celltyper. Vi har tidigare visat förmågan hos mogna adipocyter och makrofager att övergå med hjälp av MAAC10. Detta öppnar möjligheter att ytterligare utforska kopplingen mellan fetma, insulinresistens och immunsvar15,16,17. Framtida experiment skulle kunna innehålla andra celltyper såsom hepatocyter, preadipocytes, endotelceller eller bukspottskörteln celler för att ytterligare öka komplexiteten och translationella relevansen av MAAC-modellen och undersöka tvärkort mellan flera celltyper.
Även om MAAC har visat sig vara överlägsen upprätthålla funktionalitet och identitet adipocyter i förhållande till andra adipocyte in vitro modeller, har det också begränsningar som måste beaktas. I jämförelse med att använda adipocyter differentierade från prekursorceller, maac är en mer mödosam och tidskrävande modell. Plattor med membran är också dyrare jämfört med vanliga cellodlingsplattor. Viktigt, mogna adipocyter måste nyligen isoleras varje gång på sådd och kan inte utvidgas eller frysas i bestånd som prekursorceller. Detta kräver således tillgång till färska vita fettvävnadsprover, men lägger också till en nivå av komplexitet som härrör från givare till givare variationer.
Här har vi lagt fram ett detaljerat protokoll för isolera nde mänskliga mogna adipocyter och inrätta MAAC. Vi har visat att adipocyter odlade som MAAC förblir livskraftig genom två veckor, deras adipogenic gen signatur bevaras, och de svarar på olika farmakologiska agonism. Med hjälp av MAAC möjliggör studier av cross-talk betweeen adipocytes och andra celltyper, och bedömningen av långsiktiga fenotypiska förändringar av mogna adipocyter som svar på olika stimuli.

Den globala ökningen av fetma och fetma-relaterade samsjuklighet kräver utveckling av nya therapeutics. Vit fettvävnad (WAT) är en viktig regulator av hela kroppenmetabolism, energi homeostas, och är en central aktör i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D)1,2. Under kronisk överskott kaloriförbrukning, adipocyter förstora för att hantera överskott av energi. Emellertid, adipocyte lipid lagringskapacitet kan bli överskriden, vilket resulterar i en höjd av cirkulerande nivåer av fettsyror och ökad lagring i perifera icke-fettvävnad och leder till lipotoxicitet3,4.
Bristen på adipocyte in vitro modeller med hög translationell relevans är en viktig utmaning i utvecklingen av nya behandlingar för fetma och T2D. Ex vivo explant modell, där små bitar av fettvävnad odlas, är associerad med snabba förändringar i adipogenic gen uttryck drivs av hypoxi och inflammation5,6. Takkulturer (CCs) där mogna adipocyter flyter och håller sig till toppen av mediefyllda kolvar, snabbt dedifferentiate i fibroblast-liknande celler saknar lipid7,8,9,10. Den vanligaste modellen är adipocyter differentierade in vitro från engagerade prekursorer. De differentierade cellerna är dock morfologiskt åtskilda från mogna adipocyter in vivo eftersom de är mycket mindre i storlek och saknar en unilocular lipid dropp. Andra begränsningar med denna modell inkluderar det ofysiologiska behovet av en kemisk cocktail för att driva differentiering, samt variationer i differentiering effektivitet som kan påverkas av ett antal faktorer11,12,13,14.
Vi har nyligen utvecklat membran mogna adipocyte samlad kultur (MAAC), en metod för långsiktig kultur av nyisolerade mogna adipocyter, där adipocyter odlas under genomsläppliga membran10. Opartisk analys av RNA sekvenseringdata har visat att i förhållande till fettvävnadsväxter och in vitro-differentierade adipocyter är MAAC mest lik nyisolerade adipocyter. MAAC kan användas för att odla mogna adipocyter isolerade från både subkutan och visceral fettvävnad, samt adipocyter från både feta och magra ämnen. Denna metod tillåter studiet av långsiktiga adipocyte fenotypiska förändringar och underlättar samodling av adipocyter med andra celltyper. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av mogna adipocyter från mänsklig fettvävnad och hur man ställer in MAAC-systemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

Vit fettvävnad (WAT) dysregulation spelar en central roll i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D). För att utveckla nya behandlingar för T2D krävs mer fysiologiskt relevanta in vitro adipocyte-modeller. Denna studie beskriver en ny teknik för att isolera och kultur mogna mänskliga adipocyter. Denna metod har rätt MAAC (membran mogen adipocyte aggregerad kultur), och jämfört med andra adipocyte in vitro modeller, maac har en adipogenic gen signatur som är närmast nyligen isolerade mogna adipocyter. Med hjälp av MAAC kan adipocyter odlas från magra och feta patienter, olika fettdepåer, samodlade med olika celltyper, och viktigast av allt, kan hållas i kultur i 2 veckor. Funktionella experiment kan också utföras på MAAC inklusive glukos upptag, lipogenesis, och lipolys. Dessutom svarar MAAC robust på olika farmakologiska agonism och kan användas för att studera adipocyte fenotypiska förändringar, inklusive transdifferentiering av vita adipocyter till brun-liknande fettceller.

Mogna adipocyter odlade som MAAC bevarar deras funktion, fenotyp, och kan användas för att studera adipocyte svar på olika farmakologiska behandlingar. Efter 1 vecka av kultur MAAC isolerade från subkutan fettvävnad upprätthålla den karakteristiska unilocular lipid dropp finns endast i mogna adipocyter(figur 2A). MAAC odlades i 1 vecka medan de behandlades med antingen PPARγ agonists rosiglitazone (Rosi) och pioglitazone (Pio), eller glukokortikooidreceptorn (GR) agonist dexametasone (Dex) för att avgöra om olika nukleära hormonreceptor (NHR) agonister köra förutspådde förändringar i nedströms mål gener i MAAC. Rosi och Pio ökade uttrycket för PPARγ responsiva gener FABP4 och LPL med 4 respektive 2−3 gånger, medan dexametason hade ingen effekt (figur 2B). På samma sätt drev dexametason robust genuttrycket för GR-målgenerna APOD och FKBP5 med 13 respektive 55 gånger, medan PPARγ-agonisterna inte hade några signifikanta effekter. Vi har tidigare visat att nyligen isolerade mänskliga mogna vita adipocyter kan transdifferentiate till en brun-liknande fenotyp i MAAC när de behandlas med Rosi10. En 7 dagars behandling med Rosi eller Pio inducerade robust genuttrycket för den bruna fettspecifika genen UCP1 med 44-65 gånger, samt ökat uttrycket av den bruna fettmarkören PDK4 12-18 gånger(figur 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Bild 1: Visuellt diagram över MAAC-inställningar. a)Beredning av medium. (B)Isolering och förpackning av mogna adipocyter. (C)Seedning mogna adipocyter på membran. (D)Invertera membran samtidigt som adipocyter fästs. (E)Sänka membranen i mediet och byta medium. Denna siffra har ändrats från Harms m.fl.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Figur 2: MAAC upprätthåller unilocular utseende genom en vecka och svara på olika farmakologiska vånda. (A)Representativa 4x och 10x ljusa fältbilder av MAAC efter en veckas kultur. Adipocyter som har en genomsnittlig diameter på 100 μm med stora unilocular lipiddroppar är lätt att urskilja. (B)mRNA-nivåer av PPARγ målgener och glukokortikooidreceptor (GR) målgener i MAAC efter 7 dagars behandling med fordon (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio), eller dexametason (Dex). Rosi, Pio och Dex användes alla vid en slutlig koncentration på 10 μM.(C)mRNA-nivåer av bruna fettberikade gener i MAAC efter 7 dagars behandling med fordon (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) eller dexametason (Dex). Rosi, Pio och Dex användes alla vid en slutlig koncentration på 10 μM. För alla genuttrycksdata användes TATA-bindande protein (TBP) som en intern normaliseringskontroll. Statistiken beräknades med enkelriktad ANOVA med Tukeys flera jämförelser test. (medelvärde ± SD, n = 3, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membran mogna adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för att kultur mogna mänskliga adipocyter. Här beskriver vi hur man isolerar adipocyter från mänsklig adipose och hur man ställer in MAAC.

Isolering och kultur av mänskliga mogna adipocyter med membran mogna Adipocyte aggregerade kulturer (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

En utmaning inom området fettbiologi har varit att upprätthålla mogen adipocyte i kultur. Vi har utvecklat en ny metod som möjliggör studier av långsiktiga adipocyter genom stora förändringar. Vår adipocyte kultur teknik möjliggör studier av cell interaktioner och kommer förhoppningsvis att vara användbar för utvecklingen av nya behandlingar för diabetes och fetma.Det är viktigt att följa protokollet noggrant eftersom det finns några kritiska steg som kraftigt påverkar genkvaliteten och livskraften hos de mogna adipocyterna. Till exempel, innan plätering se till att alla av de fria lipid och tvätt buffert har tagits bort annars lipocyterna kunde slita av när insatsen är inverterad. Efter att ha fått det mänskliga subkutana fettvävnadsprovet, placera vävnaden i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp i en 15 centimeter Petriskål.En liten volym av medium 199 till skålen. Använd pincett för att greppa stora fibrotiska kärl i vävnaden och använd baksidan av spetsen på en sluten sax för att försiktigt skrota fettet längs kärlet för att frigöra adipocyterna. När alla celler har samlats kasta de stora bitar av fibrotisk vävnad och väga trimmade fettet.För att ytterligare frigöra cellerna från fettvävnaden, överför 10 gram fettvävnad till en ny 15 centimeter Petriskål och använd böjd sax för att noggrant finhacka fettet tills det blir en slät homogen blandning utan stora bitar av fett. När allt fett har bearbetats, använd en sked för att överföra 10 milliliter hackad vävnad till enskilda 50 milliliter rör och tillsätt 30 milliliter matsmältningsbuffert till varje rör. Placera sedan rören i en skakande inkubator på 37 grader Celsius och 150 rotationer per minut i 30 till 35 minuter.Matsmältningen är klar när den fettlösning är homogen, aprikos färgade, och frånvarande av stora bitar. I slutet av matsmältningen, dekantera smält fett lösning i en 250 mikrometer mesh filter inuti en tratt som i steril en liter kolv. När hela volymen av adipocyte suspension har gäckats, varsam pressa nätfiltret för att öka avkastningen av adipocyter och tvätta filtret med 50 till 100 milliliter tvättbuffert innan klämma filtret igen.Överför den isolerade adipocytelösningen till en separationstratt och lägg till tvättbuffert tills tratten är nästan helt fylld. Ställ försiktigt in tratten några gånger för att blanda adipocyte suspensionen med bufferten och låt suspensionen stå i två till tre minuter tills det finns en distinkt separation av skikten. När skikten har separerat, öppna munstycket på tratten och långsamt gäcka bottenlösningen i en steril kolv.När alla kollagenas har tagits bort, samla den renade mogna adipocyte lösningen i 50 milliliter koniska rör och lätt packa cellerna genom centrifugeringen. Använd sedan en 10 milliliter spruta utrustad med en 18 gauge nål för att ta bort de återstående tvätt buffert under adipocyte suspensionen och använda en pipett för att ta bort den fria lipid lagret flyter ovanför de mogna adipocyterna. För sådd av de mogna adipocyterna, placera permeabel membraninsatskomponent upp och ner på en steril yta och försiktigt invertera rören av packade adipocyter några gånger för att säkerställa en jämn fördelning av celler.Med hjälp av en bred bore pipetter spets, tillsätt 30 mikroliter av packade mogna adipocyter på varje membran. Invertera insatsen panelen i en jämn rörelse så att de seedade adipocyterna finns på undersidan av skären. Placera panelen av insatser i en 24 brunnsplatta som innehåller 500 till 1, 000 mikroliter av komplett 37 grader Celsius medium per brunn.Sedan, täck plattan och försiktigt placera plattan i en vävnad kultur inkubator. Var sjunde dag av kultur, byt ut mediet via utskärningshålet i varje skär. Efter en vecka av kultur, mogna adipocyte aggregat isolerade från subkutan fettvävnad upprätthålla den karakteristiska unilocular lipid droplet morfologi observerats endast i mogna adipocyter.Behandling med PPAR-GAMMA-agonisterna pioglitazone och rosiglitazon resulterar i ett ökat uttryck i PPAR-GAMMA-responsiva gener, medan behandling med glukokortikoidoidreceptorenogenanologen dexametason inte har någon effekt på dessa gener. På samma sätt driver glukokortikoida receptor agonisten robust genuttrycket av glukokortikoida receptorns målgener, medan PPAR-GAMMA-agonisterna inte har några signifikanta effekter på dessa gener. Dessutom sju dagars behandling med PPAR-GAMMA-agonisterna inducerar robust genuttrycket av den bruna fettspecifika genen, UCP1.Vår nya adipocyte in vitro-modell kan användas för de funktionella studierna i mogna adipocyter, inklusive glukosupptag, lipogenes, och lipolys. Med denna nya adipocyte kultur teknik har vi kunnat visa att mänskliga mogna vita adipocyter kan transdifferentiera till brun-liknande adipocyter.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Beredning av Aggregate råtthjärna kulturer för Neuron och Glia utvecklingsstudier

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Mänskliga Pancreatic Islet Isolering: Del II: Rening och kultur för mänskliga Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Beredning av Aplysia Sensomotorisk Neuronal cellkulturer

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolering av mänskliga Atriella Myocyter för samtidiga mätningar av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter och Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detektering av RNA-bindande proteiner genom<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA List i fettceller kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Mätning av insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade mogna skelettmuskler från möss

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering och anrikning av humana lungepitelceller för organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...