Name: isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Xiao-Rong Peng ve Stefan Hallen'e kaynak sağladıkları ve adiposit izolasyonlarını optimize edildikleri için, teknik yardım için Martin Uhrbom'a ve daniel Olausson ve Malin Lönn'e insan yağlarını koordine edip sağladıkları için teşekkür ederiz.

İsveç'in Göteborg kentindeki Sahlgrenska Üniversitesi Hastanesi'nde elektif cerrahi uygulanan kadın hastaların karın bölgesinden isimsiz yağ dokusu örnekleri alındı. Tüm çalışma konuları doku kullanımı için yazılı bilgi vermeden önce yazılı ve sözlü bilgi aldı. Çalışmalar Göteborg, İsveç Bölgesel Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir.
1. Tamponların Hazırlanması, Doku Kültürü Medyası ve Kültür Plakaları
<ol><li>35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4ve 900 mL suda 1,48 g MgSO4·7H2O çözünerek 5x Krebbs Ringer (KR) stoğunu hazırlayın. 1,84 g CaCl2·2H2O ekleyin ve su ekleyerek hacmi 1 L'ye ayarlayın. Steril filtre 0,22 μm filtre ile ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>5x KR stoğundan, 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glukoz ve %2 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 1 L tampon hazırlayın (bundan sonra yıkama tamponu olarak anılacaktır). pH'ı 7.4 olarak ayarlayın.</li>
	<li>1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, %2 BSA ve 450 mL su içeren 500 mL kollajenaz tampon hazırlayın (bundan sonra sindirim tamponu olarak anılacaktır). NOT: Kollajenaz, yağ dokusu adım 2.2 tartıldıktan sonra sindirim tamponuna eklenmemelidir.</li>
	<li>Orta 199'un pH'ını 7,4'e ayarlayın.</li>
	<li>Steril filtre hem tamponlar hem de orta 199 0,22 μm filtre şişesi ve 37 °C sıcak. NOT: Zaman kazanmak için doku kültürü ortamı hazırlanabilir ve yağ dokusu işlemeden önce plakalara eklenebilir. 24 kuyulu plaka formatı için(Şekil 1A),0.5−1 mL/iyi Dulbecco's modifiye Eagle's orta / Ham besin karışımı F12 (DMEM / F12), 10% fetal sığır serumu (FBS), 1% penisilin-streptomisin (penn / strep) ve 20 nM insülin kullanın. Küçük moleküller ve diğer kararlı farmakolojik ajanlar da istenilen düzende medyaya şu anda eklenebilir. Plakaları bir doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin (37 °C, %5 CO2).</li>
</ol>2. İnsan Subkutan Yağ DokusuDisedi
NOT: Biyolojik bir güvenlik kabini içinde çalışın ve izolasyon süreci boyunca steril tekniğin yanı sıra otoklavlı ve steril ekipmanların özel kullanımını kullanın.
<ol><li>15 cm petri çanak insan yağ dokusu yerleştirin ve diseksiyon sırasında nemlendirilmiş tutmak için orta 199 küçük bir hacim ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık bir golf topu büyüklüğünde yağ parçaları ile çalışma, cımbız ile büyük fibrotik kapları kavramak ve yavaşça kapalı makas arka ile yağ kazıyarak adipositler serbest. Fibrotik doku büyük parçaları atın. Kesilmiş yağı tartın.</li>
</ol>3. Kollajenaz Tedavisi
<ol><li>1 mg/mL konsantrasyonunda sindirim tamponuna kollajenaz ekleyin (bkz. adım 1.3). Çözeltiyi 0,22 m steril filtre kullanarak steril filtreleyin. NOT: Yağ gram başına sindirim tampon üç mL tavsiye edilir (yani, yağ 100 g için, tip 300 mg ile sindirim tampon 300 mL hazırlamak 2 kollajenaz). DİkKAT: Tip 2 Kollajenaz gözler, cilt için tehlikelidir ve solunum tahrişine neden olabilir. Eldiven, göz koruması ve kollajenaz ile çalışırken havalandırılan bir başlık içinde çalışmak giyin.</li>
	<li>Yaklaşık 10 g yağ dokusunu 15 cm petri kabına taşıyın ve yumuşak homojen bir karışım alanıncaya kadar bir çift kavisli makas kullanarak yağı dikkatlice dolayın ve büyük yağ parçaları kalmadan elde edin. Tüm yağ işlenene kadar işlemi tekrarlayın. NOT: Her tur yaklaşık 2 dakika sürmelidir ve yağ parçaları geniş delikli pipet ucu kullanılarak boru haline ülecek kadar küçük olmalıdır. Bu adım yüksek kaliteli adipositler verim için çok önemlidir. Parçalar çok büyükse, sindirim süreleri uzatılmalı ve hücre viabilty'den ödün vermek gerekir.</li>
	<li>Bir kaşık kullanarak 50 mL konik tüpler içine kıyılmış yağ aktarın. Her tüpe 10 mL kıyma ve 30 mL sindirim tamponu ekleyin. 10 mL'den az kıyılmış yağ varsa uygun hacimlere küçültün.</li>
	<li>30−45 dakika boyunca 150 rpm sürekli ajitasyon ile sallayarak bir inkübatör 37 °C'de doku sindirin. 30 dk sonra, aşırı sindirim önlemek için her 5 dakikada bir süreci kontrol edin. NOT: Yağ çözeltisi büyük parçalar olmadan homojen olduğunda ve kayısı rengine sahip olduğunda sindirim tamamlanır.</li>
</ol>4. Hücre Süspansiyonunun Filtrasyonu ve Olgun Adipositlerin Saflaştırılması
<ol><li>1 L steril şişenin üzerine bir huni yerleştirin ve huninin içine steril 250 m mesh filtresi yerleştirin. Sindirilmemiş doku kaldırmak için filtre içine sindirilmiş yağ çözeltisi dökün.</li>
	<li>Tüm adiposit süspansiyon filtre geçti, yavaşça adipositlerin verimini artırmak için kafes filtresi sıkmak. Yaklaşık 50−100 mL yıkama tamponu dökün, durulayıp filtreyi tekrar sıkın.</li>
	<li>Bir ayırma hunisi içine şişeden izole adiposit süspansiyon dökün ve huni neredeyse tamamen dolana kadar yıkama tampon ekleyin. Adiposit süspansiyonu tamponla karıştırmak için huniyi birkaç kez hafifçe ters çevirin.</li>
	<li>Olgun adipositler ve serbest lipid ve tampon ve yağ stroma vasküler fraksiyonu (SVF) içeren bir alt tabaka içeren bir üst sarı tabaka ile 2 kat(Şekil 1B)ayrı bir ayrım olana kadar süspansiyon 2−3 dk bekletin.</li>
	<li>Ayırma hunisi üzerindeki nozulu açın ve alt çözeltiyi steril bir şişeye yavaşça verin (SVF'den hücreler 200 x g'de 7 dk için santrifüjden sonra peletlenebilir ve toplanabilir). Ayırma hunisi olgun adipositler ile üst tabaka tutun.</li>
	<li>Olgun adipositleri iyice yıkamak ve kollajenazın tamamını çıkarmak için yıkama işlemini 4.3−4.5 adımlarında üç kez tekrarlayın.</li>
</ol>5. Olgun Adipositlerin Paketlenmesi
<ol><li>Nozulu açın ve saflaştırılmış olgun adiposit süspansiyonu 50 mL konik tüpler halinde toplayın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 50 x g tüpleri döndürerek olgun adipositleri hafifçe paketleyin.</li>
	<li>Adiposit süspansiyonunun altındaki kalan yıkama tamponu çıkarmak için 18 G iğne ve şırınga kullanın.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak olgun adipositlerin üzerine yüzen serbest lipid tabakasını (izolasyon işlemi sırasında kırıyan adipositlerin küçük bir kısmından yağ) çıkarın. NOT: Adipositlerin 6.5 adımda membranlardan damlama riskini azaltmak için, olgun adipositler membranlara tohumlandığında lipid tabakasının ve tüm yıkama tamponlarının çıkarılması önemlidir. Bu nedenle 3 tüp halinde adiposittoplamak. En son toplanan numuneler en fazla taşıma lipidine sahip olacak ve bu nedenle en düşük kalitede olacaktır. Ancak dikkatli pipetleme ile bu numuneler kullanılabilir.</li>
</ol>6. Olgun Adipositlerin Tohumlanması
<ol><li>Geçirimli membran kesici uçlar(Malzeme Tablosu)içeren paketi açın ve membran bileşenini çıkarın. Ters çevirin ve steril bir yüzeye yerleştirin, böylece membranlar tavana bak.</li>
	<li>Pipet 30 μL paketlenmiş olgun adipositlerin her bir membranüzerine(Şekil 1C). Ucu ile membran dokunmadan kaçının. Hücreleri tohumlamak için geniş delikli pipet uçları kullanın veya daha geniş yapmak için pipet ucu küçük bir parça kesmek için makas kullanın.</li>
	<li>Farklı boyutlarda ki adipositlerin eşit dağılımını sağlamak için, tohumlama işlemi boyunca paketlenmiş adipositlerle birlikte 50 mL'lik tüpleri yavaşça ters çevirin.</li>
	<li>Kuvözden ortam içeren hazırlanmış çok kuyulu plakaları biyogüvenlik kabinine getirin ve kapakları çıkarın. Adipositlerle tohumlanmış zarları alın ve 6.5 adımda ters çevrilebilsin diye alttan tutun.</li>
	<li>Bir düzgün hareketle, tohumlu adipositlerin aşağı bakacak şekilde üstteki adipositlerle membranları ters çevirin(Şekil 1D). Adipositlerle plakayı ortam içeren kuyulara indirin (Şekil 1E).</li>
	<li>Plaka kapağını koyun ve dikkatlice bir doku kültürü kuluçka içine plaka aktarın. Adipositler başlangıçta kolayca yerinden çıkarılabilir, çünkü plakanın hızlı hareket kaçının. NOT: Hücrelerin zara daha sıkı yapışması birkaç gün sürer.</li>
</ol>7. Analiz için Adipositlerin Bakımı ve Hasat
<ol><li>En az 7 günde bir medyayı değiştirin. Her membran kesici uçtaki kesme deliği aracılığıyla ortamı çıkarın ve ekleyin. Ortamı çıkarmak için şırınga ve iğne, aspire değnek veya p200 uçlu bir pipet kullanın. Medya eklemek için, adipositleri rahatsız etmemek için duvarın kenarındaki kuyulara bir pipet ve yavaş yavaş pipet yeni ortam kullanın. NOT: Adipositler 7 gün sonra bir medya değişikliği ile 2 hafta boyunca kültürlü edilmiştir. Ancak, farklı yağ kökeni ve deneysel sorular artan medya değişikliklerinden yararlanabilir.</li>
	<li>RNA hasat etmek için, adım 7.1'de açıklandığı gibi ortamı çıkarın ve hücreleri lyse lemek için doğrudan kuyulara 500 μL likis tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin. Görüntüleme için hücreleri düzeltmek için, % 1'lik son konsantrasyonla doğrudan kuyuya formaldehit ekleyin. NOT: Hücreler daha sonra 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance.">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li><li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis.">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li><li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression.">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li><li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue.">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li><li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments:+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling.">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).</li><li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy.">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li><li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+fat+cells:+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues.">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity,+Function,+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes.">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipocyte+differentiation.">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity:+A+Review.">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).</li><li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape,+cytoskeletal+tension,+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment.">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li><li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease.">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li><li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+View+of+Immunometabolism.">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) taze izole olgun adipositlerin uzun vadeli kültür için yeni bir yöntemdir. MAAC'ın kurulmasında, protokolde olgun adipositlerin verimini, kalitesini ve uygulanabilirliğini büyük ölçüde etkileyen birkaç kritik adım vardır. Bu adım doğrudan adipositler kollajenaz maruz kalan zaman miktarını etkiler beri çok çaba adım 3.2 yağ kıyma koymak gerekir. Yağ parçaları çok büyükse, sindirim süresi nin uzatılması gerekir ve bu da hücrelerin canlılığını olumsuz etkiler. Tersine, doku makasla çok ince işlenirse, canlılık da etkilenebilir. MAAC olarak olgun adipositlerin başarılı bir kültür için, aşağıdaki adımlara özel dikkat vermelidir: membranlar üzerine adipositlerin başarılı tohumlanması için, serbest lipid ve taşıma yıkama tampon olgun adipositler kaldırılır çok önemlidir adım 5.3 ve 5.4. Kalan lipid veya yıkama tamponu adipositlerin yüzey gerilimini azaltacak ve adipositlerin ters çevrildiğinde membranlardan damlama riskini artıracaktır. Adipositler tohumlu ve ortamda olduğunda, hücreler öncelikle yüzdürme yoluyla membran ile temas halinde kalır, böylece hücreleri kaybetmemek için ortam değiştirirken yavaş ve nazik bir teknik önerilir. Adım 7.1'de açıklandığı gibi kuyuların altındaki ortamı çıkarın ve medyayı duvarların kenarlarından yavaşça borulayarak ortam ekleyin. Son olarak, zaman tasarrufu önerisi adiposit izolasyon işlemi önce medya ve tedaviler ile plakaları hazırlamaktır. Özellikle karmaşık deneysel tasarımlar için, plakaların önceden hazırlanması çok zaman kazandırır ve adipositlerin izole edilir yayılmaz tedavileri ile ortama yerleştirilmesini sağlar.
Maac kullanarak preadipocytes ayırt karşılaştırıldığında bir yararı kullanılan MAAC medya çok basit ve fizyolojik olmayan bir hormon kokteyl gerektirmez. Burada glikoz açısından zengin medya (DMEM/F12), %10 FBS, %1 penn/strep ve 20 nM insülin ile kültürlenmiş MAAC'a sahibiz. Daha da önemlisi, insülin kesinlikle UCP110rosiglitazone / pioglitazone tahrik indüksiyon için gerekli olduğunu bulduk. İnsülin, ancak, hücrelerin adipojenik fenotip korumak için gerekli değildir. Böylece, deneysel soruya bağlı olarak, insülin dahil edilebilir veya atlanabilir.
Yukarıda ayrıntılı prosedür izolasyon ve insan adipositkültürü için optimize edilmiştir. Ancak, fare, ve muhtemelen diğer organizmanın adipositler, aynı zamanda MAAC olarak kültürlü olabilir. Fare adipositleri MAAC olarak kültürlenecekse, akılda tutulması gereken ek hususlar ve önlemler vardır. Farelerden gelen olgun adipositlerin insanlardan çok daha kırılgan olduğunu bulduk. Sonuç olarak, sindirim süresi hücre canlılığını artırmak için mutlak bir minimumkısaltılmalıdır. Ayrıca genç farelerden gelen adipositlerin (8 haftalık ve genç) en sağlam ve tekrarlanabilir sonuçları sağladığını bulduk. Son olarak, fare MAAC bir haftaya kadar kültürlenebilir, ancak adipojenik fenotiplerinin insanlardan daha az kararlı göründüğü göz önüne alındığında (en az iki hafta boyunca kültürlenebilir) fare MAAC'ı ele almak için gereken en az süre için kültüre almanızı öneririz. deneysel sorular.
MAAC modeli geçirimli membranlar kullanılarak dayandığıiçin, bu tekniğin bir avantajı diğer hücre tipleri ile birlikte olgun adipositler kültüre olasılığıdır. Daha önce maac10kullanımı ile crosstalk olgun adipositler ve makrofajlar yeteneğini göstermiştir. Bu daha fazla obezite arasındaki bağlantıyı keşfetmek için fırsatlar açılır, insülin direnci, ve bağışıklık yanıtları15,16,17. Gelecekteki deneyler, MAAC modelinin karmaşıklığını ve çevirisel alaka düzeyini daha da artırmak ve birden fazla hücre tipi arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için hepatositler, preadipocytes, endotel hücreleri veya pankreas hücreleri gibi diğer hücre türlerini de dahil edebilir.
MAAC'ın diğer adiposit in vitro modellere göre adipositlerin işlevselliğini ve kimliğini korumada üstün olduğu gösterilmiş olsa da, dikkate alınması gereken sınırlamalar da vardır. Öncül hücrelerden farklı olan adipositlerin kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, MAAC daha zahmetli ve zaman alan bir modeldir. Membranlı plakalar da normal hücre kültürü plakalarına göre daha pahalıdır. Daha da önemlisi, olgun adipositler tohumlama üzerine her zaman taze izole edilmesi gerekir ve genişletilemez veya öncül hücreler gibi stoklar içine dondurulmuş. Böylece, bu taze beyaz yağ dokusu örnekleri ne erişim gerektirir, ama aynı zamanda donör varyasyonları donör kaynaklanan karmaşıklık düzeyi ekler.
Burada insan olgun adipositler izole ve MAAC kurma için ayrıntılı bir protokol sunduk. MAAC olarak kültürlenmiş adipositlerin iki hafta boyunca canlı kaldıklarını, adipojenik gen izlerinin korunduğunu ve çeşitli farmakolojik agonizme yanıt verdiklerini gösterdik. MAAC kullanarak çapraz konuşma betweeen adipositler ve diğer hücre tipleri çalışma ve farklı uyaranlara yanıt olarak olgun adipositlerin uzun vadeli fenotibik değişikliklerin değerlendirilmesi için izin verir.

Obezite ve obeziteile ilgili eşlik eden hastalıklardaki dünya çapındaki artış yeni tedavi olanaklarının geliştirilmesini gerektirmektedir. Beyaz yağ dokusu (WAT) tüm vücut metabolizmasının önemli bir düzenleyici, enerji homeostaz, ve insülin direnci ve tip 2 diyabet gelişiminde merkezi bir oyuncu (T2D)1,2. Kronik aşırı kalori tüketimi sırasında, adipositler enerji fazlalığı işlemek için büyütmek. Ancak, adiposit lipid depolama kapasitesi aşılabilir, yağ asitleri dolaşım düzeylerinin bir yükseklik ve periferik non-adipoz dokularda artan depolama ve lipotoksite yol açan3,4.
Yüksek çevirisel alaka ile adiposit in vitro modellerin eksikliği obezite ve T2D için yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir sorundur. Ex vivo eksplant modeli, yağ dokusunun küçük parçaları kültürlü olduğu, hipoksi ve inflamasyon tarafından yönlendirilen adipojenik gen ekspresyonunda hızlı değişiklikler ile ilişkilidir5,6. Tavan kültürleri (CCs) olgun adipositler yüzer ve medya dolu şişelerin üst yapışır, hızla lipideksikliğifibroblast benzeri hücrelere farklılaşmak7 ,8,9,10. En sık kullanılan model, in vitro olarak işlenen öncüllerden ayırt edilen adipositlerdir. Ayırt edici hücreler, ancak, morfolojik olarak erişkin olgun adipositlerden farklıdır, çünkü boyutları çok daha küçüktür ve tekiloküler lipid damlacığı ndan yoksundur. Bu model ile diğer sınırlamalar farklılaşma sürücü için bir kimyasal kokteyl fizyolojik ihtiyacı yanı sıra faktörlerin bir dizi etkilenebilir farklılaşma verimliliği değişkenlik içerir11,12,13,14.
Biz son zamanlarda membran olgun adiposit agrega kültür geliştirdik (MAAC), taze izole olgun adipositler uzun vadeli kültür için bir yöntem, adipositler geçirimli membranlar altında kültürlü10. RNA dizilimi verilerinin tarafsız analizi, yağ dokusu eksektiflerine ve in vitro-didipositlere göre MAAC'ın yeni izole edilmiş adipositlere en çok benzediğini göstermiştir. MAAC hem deri altı hem de visseral yağ dokusundan izole edilmiş olgun adipositlerin yanı sıra hem obez hem de yağsız deneklerin adipositlerini kültüre almak için kullanılabilir. Bu metodoloji uzun vadeli adiposit fenotipik değişikliklerin incelenmesine izin verir ve diğer hücre tipleri ile adipositlerin ortak kültürünü kolaylaştırır. Burada insan yağ dokusundan olgun adipositlerin izolasyonu ve MAAC sisteminin nasıl kurulması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclaved scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved spoons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79216</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4020</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter flask 0.2 &#181;m pore size, 75 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>158-0020</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Actrapid Penfill)</td>
			<td>Novo Nordisk A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10012-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter (250 &#181;M)</td>
			<td>Sintab AB</td>
			<td>6111-025043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 18G, 1.20x40 mm</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>613-2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 150x21 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>168381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0008</td>
			<td>For large scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>527-0005</td>
			<td>For small scale preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL</td>
			<td>Omnifix</td>
			<td>612-2892</td>
			<td>100 st</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwells, 24-well (6,5 mm)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3397</td>
			<td>Permeable membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (maac)

Beyaz yağ dokusu (WAT) disregülasyonu insülin direnci ve tip 2 diyabet (T2D) gelişiminde merkezi bir rol oynar. T2D için yeni tedaviler geliştirmek için, daha fizyolojik olarak ilgili in vitro adiposit modelleri gereklidir. Bu çalışma, insan adipositlerini izole etmek ve kültür emzetmek için yeni bir tekniği tanımlar. Bu yöntem MAAC (membran olgun adiposit agrega kültürü) olarak adlandırılır ve diğer adiposit in vitro modelleri ile karşılaştırıldığında, MAAC taze izole olgun adipositlere en yakın adipojenik gen imzasına sahiptir. MAAC kullanılarak, adipositler yalın ve obez hastalardan, farklı yağ depolarından, farklı hücre tipleriyle birlikte kültüre alınabilir ve daha da önemlisi 2 hafta boyunca kültürde tutulabilir. Fonksiyonel deneyler de glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz de dahil olmak üzere MAAC yapılabilir. Ayrıca, MAAC çeşitli farmakolojik agonizme sağlam yanıt ve kahverengi gibi yağ hücrelerine beyaz adipositlerin transdifferentiation dahil olmak üzere adiposit fenotipik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.

MAAC olarak kültürlü olgun adipositler işlevlerini korur, fenotip, ve çeşitli farmakolojik tedavilere adiposit yanıtları çalışma için kullanılabilir. Deri altı yağ dokusundan izole edilen 1 haftalık kültürden sonra sadece olgun adipositlerde bulunan karakteristik tekloküler lipid damlacıklarını korurlar (Şekil 2A). MAAC 1 hafta boyunca ya PPARγ agonistleri rosiglitazone (Rosi) ve pioglitazone (Pio) veya glukokortikoid reseptörü (GR) agonist deksametazon (Dex) ile tedavi edilirken farklı nükleer hormon reseptörü (NHR) agonistleri sürücü MAAC hedef genlerde değişiklikler tahmin belirlemek için kültürlü oldu. Rosi ve Pio PPARγ duyarlı genlerin ekspresyonunu sırasıyla 4 ve 2−3 kat artırmış, deksametazon ise hiçbir etkisi olmamıştır(Şekil 2B). Benzer şekilde, deksametazon gr hedef genleri APOD ve FKBP5 genekspresyonunu sırasıyla 13 ve 55 kat yönlendirirken, PPARγ agonistlerinin önemli bir etkisi olmadı. Daha önce taze izole insan olgun beyaz adipositler Rosi10ile tedavi edildiğinde MAAC bir kahverengi benzeri fenotip içine transfarklılık olduğunu göstermiştir. Rosi veya Pio ile 7 günlük bir tedavi güçlü kahverengi yağ özgü gen UCP1 gen ekspresyonunu indüklenen 44-65 kat, yanı sıra kahverengi yağ marker PDK4 12-18 kat ekspresyonu arttı(Şekil 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> Şekil 1: MAAC kurulumunun görsel diyagramı. (A) Orta hazırlanması. (B) Olgun adipositlerin izolasyonu ve ambalajı. (C) Olgun adipositleri membranlara tohumlamak. (D) Adipositleri bağlı tutarken membranları ters çevirin. (E) Membranları ortama indirgin ve ortayı değiştirerek. Bu rakam Harms ve ark.10'dandeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> Şekil 2: MAAC bir hafta boyunca tekloküler görünümü korur ve çeşitli farmakolojik agonizme yanıt verir. (A) Temsili 4x ve 10x parlak alan görüntüleri MAAC kültür bir hafta sonra. Büyük tekiloküler lipid damlacıkları ile ortalama çapı 100 μm olan adipositler kolayca ayırt edilebilir. (B) PPARγ hedef genlerinin mRNA düzeyleri ve glukokortikoid reseptörü (GR) araç (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) veya deksametazon (Deks) ile tedavi 7 gün sonra MAAC hedef genleri. Rosi, Pio ve Dex, araç (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) veya deksametazon (Deks) ile 7 günlük tedaviden sonra MAAC'de kahverengi yağla zenginleştirilmiş genlerin 10 μM. (C)mRNA seviyelerinde son konsantrasyonda kullanıldı. Rosi, Pio ve Dex 10 μM'lik son konsantrasyonda kullanıldı. Tüm gen ekspresyonu verileri için, TATA bağlayıcı protein (TBP) iç normalleştirme kontrolü olarak kullanılmıştır. İstatistikler Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır. (ortalama ± SD, n = 3, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Yağ biyolojisi alanındaki zorluklardan biri de kültürde olgun adipositi korumakolmuştur. Biz büyük değişiklikler boyunca uzun vadeli adiposit çalışma sağlayan yeni bir yöntem geliştirdik. Bizim adiposit kültür tekniği hücre etkileşimleri çalışma sağlar ve umarım diyabet ve obezite için yeni tedavilerin geliştirilmesi için yararlı olacaktır.Olgun adipositlerin gen kalitesini ve canlılığını büyük ölçüde etkileyen bazı kritik adımlar olduğundan protokolü dikkatle takip etmek önemlidir. Örneğin, kaplama önce tüm serbest lipid ve yıkama tampon kaldırıldı emin olun aksi takdirde lipocytes ekler ters olduğunda rip off olabilir. İnsan deri altı yağ dokusu örneği aldıktan sonra, 15 santimetre Petri çanak steril bir biyolojik güvenlik kabininde doku yerleştirin.Çanak orta 199 küçük bir hacim. Doku içinde büyük fibrotik damarları kavramak için cımbız kullanın ve yavaşça adipositler serbest bırakmak için damar boyunca yağ hurda makas kapalı bir çift ucunun arka kullanın. Tüm hücreler toplandığında fibrotik doku büyük parçaları atın ve kesilmiş yağ tartmak.Daha fazla yağ dokusu hücreleri serbest bırakmak için, yeni bir 15 santimetre Petri çanak içine yağ dokusu nun 10 gram aktarın ve yağ dikkatlice yağ kıyma kullanabilirsiniz yağ büyük parçalar ile pürüzsüz bir homojen karışım haline gelene kadar. Tüm yağ işlendiğinde, tek tek 50 mililitre tüpler içine kıyma doku 10 mililitre aktarmak için bir kaşık kullanın ve her tüp için sindirim tampon 30 mililitre ekleyin. Daha sonra tüpleri 37 santigrat derecede sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin ve 30 ila 35 dakika boyunca dakikada 150 dönüş yerleştirin.Yağ çözeltisi homojen, kayısı renkli ve büyük parçalar olmadığında sindirim tamamlanır. Sindirim sonunda, steril bir litre likat içine ayarlanmış bir huni içinde 250 mikrometre örgü filtre içine sindirilmiş yağ çözeltisi decant. Adiposit süspansiyonunun tüm hacmi atlatıldığında, adipositlerin verimini artırmak için kafes filtresini hafifçe sıkın ve filtreyi tekrar sıkmadan önce 50 ila 100 mililitre yıkama tamponuyla yıkayın.İzole edilmiş adiposit çözeltisini bir ayırma hunisine aktarın ve huni neredeyse tamamen dolana kadar yıkama tamponu ekleyin. Adiposit süspansiyonu tamponla karıştırmak için huniyi birkaç kez hafifçe ters çevirin ve katmanların ayrı bir ayrımı olana kadar süspansiyonun 2-3 dakika bekletin. Katmanlar ayrıldığında, huniüzerindeki nozulu açın ve alt çözeltiyi yavaşça steril bir şişeye dönüştürün.Tüm kollajenaz çıkarıldığında, 50 mililitrekonik tüpler saflaştırılmış olgun adiposit çözeltisi toplamak ve hafifçe santrifüj ile hücreleri paketi. Daha sonra, adiposit süspansiyon altında kalan yıkama tampon kaldırmak için bir 18 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mililitreşü kullanın ve olgun adipositler üzerinde yüzen serbest lipid tabakası kaldırmak için bir pipet kullanın. Olgun adipositlerin tohumlanması için, geçirimli membran kesici bileşeni steril bir yüzeye ters yerleştirin ve hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için paketlenmiş adiposittüplerini birkaç kez hafifçe ters çevirin.Geniş delikli pipet ucu kullanarak, her membran üzerine paketlenmiş olgun adipositler 30 mikrolitre ekleyin. Seri uç panelini tek bir düzgün hareketle ters çevirin, böylece tohumlu adipositler kesici uçların alt kısmında dır. Eklerin panelini kuyu başına 500 ila 1,000 mikrolitre tam 37 derece santigrat orta içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.Sonra, plaka kapağı ve dikkatle bir doku kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin. Kültürün her yedi gün, her eklemek kesme deliği ile orta değiştirin. Bir haftalık kültürden sonra, deri altı yağ dokusundan izole edilen olgun adiposit agregaları sadece olgun adipositlerde gözlenen karakteristik tekiloküler lipid damlacık morfolojisini korurlar.PPAR-GAMMA agonistleri pioglitazone ve rosiglitazone ile tedavi PPAR-GAMMA duyarlı genlerde artan bir ekspresyon ile sonuçlanır, glukokortikoid reseptör agonist deksamet azminde tedavi bu genler üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Benzer şekilde, glukokortikoid reseptör agonistsağlam glukokortikoid reseptör hedef genlerin gen ekspresyonunu sürücüler, PPAR-GAMMA agonistleri bu genler üzerinde önemli bir etkisi yok iken. Buna ek olarak, PPAR-GAMMA agonistleri ile yedi günlük tedavi sağlam kahverengi yağ özgü gen gen ekspresyonu indükler, UCP1.Yeni adiposit in vitro modelimiz, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz gibi olgun adipositlerde fonksiyonel çalışmalarda kullanılabilir. Bu yeni adiposit kültür tekniği ile insan olgun beyaz adipositlerin kahverengi benzeri adipositlere dönüşebileceğini gösterdik.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...