Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

אנו מודים לדניאל ברגר, מרילין וודרוף, סימון קורראה, ורית'ה גייס לסיוע בתיאום לימוד. SEM בוצע על ידי אוניברסיטת מישיגן מיקרוסקופ & ניתוח תמונה מעבדה במחקר ביו רפואי מתקן ליבה. פרויקט זה נתמך על ידי NIH מענקים R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), ותיקי הצטיינות מענק הוקרה I01CX001811 (RWO), מענק פיילוט והיתכנות ממרכז מחקר סוכרת מישיגן (NIH גרנט P30-DK020572) (RWO), מינהל ותיקי ומרק 10 הניצוץ פיילוט הגרנט (RWO). סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני בביצוע מיקרוסקופ אוניברסיטת מישיגן & ניתוח תמונה מעבדה במחקר ביו רפואי מתקן ליבה. איור 4 של כתב יד זה פורסם במקור ב בייקר ואח ', J Clin אנדו Metab 2017; 1 במרס, 102 (3), 1032-1043. דוי: 10.1210/jc. 2016-2915, והוא שוחזר על ידי רשות העיתונות של אוניברסיטת אוקספורד [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. כדי לקבל הרשאה לשימוש חוזר בחומר זה, בקר בhttp://global.oup.com/academic/rights.

הרקמות של אדיפוז מושגו מנושאים אנושיים שעברו ניתוח בריאטרי באמצעות אישור מוסדי.
1. הכנה לבידוד ובידוד תרבות
<ol><li>הכינו 2% מהסרום (BSA) בתמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS). המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.</li>
	<li>הכנת קולגן סוג II: 2 מ"ג/mL ב 2% BSA ב-1x PBS. הכן מיד לפני השימוש.</li>
	<li>הכן תא דם אדום (rbc) ל?...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

מודל התרבות ECM-אדיפוט מספק כלי רב ערך לניתוח התפקידים הבודדים של ECM ותאים בכתיב פנוטיפים האולטימטיבי של רקמה. פרוטוקול הבידוד של ECM אינו ניתן לעיבוד, אך ייתכן שניתן יהיה לצפות בשינויים בתהליך הdecellularization. הצעד הטוב ביותר של יום 3 הוא נקודה קריטית בפרוטוקול. בסיומו של החילוץ לילה, מדליזציה של ה...

מטריצת החילוץ (ECM) לא רק מספקת פיגום מכני לרקמות, אלא גם עוסקת בוצלב מורכב עם תאים השוכנים בתוכו, ויסות תהליכים מגוונים הנחוצים למתן רקמות, כולל הפצת תאים, בידול, איתות, ומטבוליזם1. בעוד ECM בריא משחק תפקיד חיוני תחזוקה של תפקוד רקמות נורמלי, ECM תפקודית כבר מעורב מחלות מרובות2.
רקמת אדיפוז ממלאת תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות מטבולית. השמנת יתר קשורה מוגזמת adipocyte יפרטרופיה והיפוקסיה הסלולר, פגמים בחילוף החומרים הסלולר adipocyte, ו האדיפוז רקמות רשתית פלזמית ומתח חמצוני ודלקת. בעוד מובן מאליו, תהליכים מורכבים אלה זוממים לפגוע ביכולת האגירה התזונתיים של רקמת השומן, המובילה לגלישה מזינים מרקמת אדיפוז, רעילות ברקמות מרובות ומחלות מטבולית מערכתית3,4 ,5. רצף האירועים והמנגנונים הספציפיים העומדים בפני כשל רקמות השומן אינם מובנים בצורה מובנת, אך שינויים ברקמת האדיפוז של ECM היו מעורבים. הרכב ה-ECM משתנה בתוך רקמת השומן בהשמנה אנושית ומורתית, עם היתר מוגבר של חלבון ECM, יחד עם הבדלים ביוכימיים ומבניים איכותיים ברקמת השומן של ECM המזוהה עם מחלת חילוף החומרים האנושית, כולל סוכרת מסוג 2 ו-היפרליפידמיה6,7,8,9,10,11.
למרות התצפיות הללו, תפקידה של ECM רקמת האדיפוז בתפקוד לקוי של רקמת השומן אינו מוגדר היטב. זה חלק בשל חוסר של מודלים ניסיוניים מעקב המאפשרים ניתוח של התפקידים הספציפיים של ECM ו adipocytes בוויסות תפקוד השומן האולטימטיבי הרקמה. תרבות ECM-אדיפוטה מדמה את הסביבה הvivo של רקמת השומן הטבעית לפחות בשתי כבוד. ראשית, תרבות ECM מספקת סביבה מולקולרית דומה לרקמת האדיפוז הטבעית, כולל קולגוניה מקורית, אלאסטנים וחלבונים מטריצות אחרים הנעדרים בתרבות דו-ממדית. שנית, התרבות על פלסטיק 2D הוכח לשנות את חילוף החומרים adipocyte באמצעות אפקטים מכניים בשל אלסטיות ירד של המצע פלסטיק12, אשר ecm-תרבות מבטלת.
שיטות למהנדס פיגומים ביולוגיים על ידי בידוד של ecm מ decellularized אדיפוז ורקמות אחרות נחקרו בהקשר של משובי ורפואת שיחזור והנדסת רקמות13,14, .15,16,17,18 פרסמנו בעבר מתודולוגיה שבה הותאמו שיטות אלה כדי לפתח בדגם תלת-ממד של האדם התלת-ממדי של החברה ECM-adipote האנושית, באמצעות ECM ו-adipocyte בתאי גזע (preadipocytes) נגזר רקמות הקרביים האדם שפוז11. במאמר הנוכחי, אנו מתארים את השיטות האלה בפרוטרוט. ההליך הdecellularization לרקמת השומן האנושית הוא תהליך בן ארבעה ימים הכרוך בטיפולים מכניים ואנזימטיים להסרת תאים ושומנים בדם, תוך השארת פיגום ביולוגי השומר על מאפייני הרקמה שממנה היא נגזרת. Decellularized ECM תומך בבידול adipogenic של האדם preadipocytes, וכאשר מחדש עם adipogenic, שומר מיקרוארכיטקטורה ביוכימיים ומאפיינים ספציפיים למחלות של רקמת אדיפוז שלמים ועוסקת מטבולית פונקציות האופייניות לרקמת השומן הטבעית. ניתן ללמוד מטריצה זו לבדה או להתחמש עם תאים, ולאפשר לימוד של אינטראקציות והצלבות בין הרכיבים הסלולריים והסלולאריים של רקמת האדיפוז.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

מטריצת החילוץ (ECM) ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות הומאוסטזיס רקמות, העוסקים בפיצול תאים ובוויסות היבטים מרובים של הפונקציה התאית. ה-ECM ממלאת תפקיד חשוב במיוחד בתפקוד רקמת השומן בהשמנה, ושינויים בתצהיר ECM של רקמת השומן ובקומפוזיציה משויכים למחלות מטבוליות בעכברים ובבני אדם. Tractable מודלים בעלי מבחנה המאפשרים ניתוח של התפקידים של ECM ותאים בתרומה לפנוטיפים הרקמה הגלובלית דליל. אנו מתארים רומן 3D במודל מתורבת של תרבות ECM-adipote האנושית המאפשרת ללמוד את התפקידים הספציפיים של ECM ו adipocytes בוויסות שומן השומן רקמות מטבולית. רקמת השומן האנושית היא decellularized כדי לבודד ECM, אשר לאחר מכן מאוכלס מחדש עם preadipocytes כי הם הבדיל אז בתוך ECM לתוך adipocytes בוגרת. שיטה זו יוצרת מבנים ECM-adipote כי הם metabolically פעילים ולשמור מאפיינים של הרקמות והמטופלים שמהם הם נגזרים. השתמשנו במערכת זו כדי להדגים את הוצלב הספציפי למחלות ECM-adipote ברקמת השומן האנושית. מודל תרבות זה מספק כלי לניתוח התפקידים של ECM ו אדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ של רקמת השומן הגלובלית והיתרי הלימוד של התפקיד ECM בוויסות הומאוסטזיס של רקמת השומן.

הכנת הרקמה האדיתית ECM, זריעת עם preadipocytes, ובידול מחוץ גופית לתוך adipocytes בוגרת התוצאה ברורים שינויים רציפים מורפולוגיים ברקמה המאפשרת הערכה חזותית של התקדמות לאורך הפרוטוקול (איור 1) . החומצה הפרפוציטים המשמשת לזריעה את ה-ECM מבודדת באמצעות העיכול מדגימות מע מ ...

Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

אנו מתארים האדם 3D מטריקס-adipocyte מערכת תרבות מבחנה המאפשרת ניתוח של התפקידים של מטריקס ואדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ רקמה מטבולית של רקמת השומן.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

הפרוטוקול שלנו מדגים כי ה- ECM עשוי לקדם התברואה אדיפוגנית בהיעדר מתווכים אדיפוגניים קלאסיים והוא הראשון להדגים ויסות ספציפי למחלות של חילוף החומרים התאי על ידי ה- ECM. הטכניקה שלנו מספקת כלי לנתח את התפקידים של ECM ו adipocytes בחילוף החומרים של רקמת שומן ולהתיר מחקר של התפקיד של ECM בוויסות הומאוסטזיס רקמת שומן. בהשוואה לתרבות תאים דו-ממד סטנדרטית, מודל התלת-ממד שלנו מאפשר בדיקה חזקה יותר וניתוס של דיבור צולב בין אדיפוזיטים לרקמת שומן ECM בהקשר של סוכרת מסוג 2.אנו ממליצים להתחיל עם דגימות קטנות יותר כדי לאמוד כמה טוב זה תאית. זכור שיש שונות בין אשפוז כמה טוב התאים גדלים וכמה טוב הרקמה decellularizes. חשוב לבחון את הרקמה לפני ואחרי כל שלב כדי להבטיח את הרקמה הופכת decellularized ולהבין הבדלים פוטנציאליים בין דגימות.לאחר קבלת רקמת שומן הקרביים או מע"מ מניתוח, להכין אותו לאחסון על ידי הוספת 5-10 גרם של הרקמה ל 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ הקפאה בצינור חרוט 50 מיליליטר. טובלים לחלוטין את הדגימה ומאחסנים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לדקלולריזציה. לבידוד preadipocyte, מניחים שני גרם של מדגם טרי של מע מ שלם ב 20 מיליליטר של פתרון קולגנס מסוג II, ולאחר מכן להכניס מספריים סטריליים לתוך הצינור ביסודיות טחון הרקמה.לאחר טחון תרחיף בסדר, דגירה אותו בתסמת קולגן ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית במשך 60 דקות. לאחר הדגירה, לסנן את וכתוצאה מכך מתעכל דרך רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט טרי 50 מיליליטר. מתעכל צריך להיות נוזל צהוב כתום עם צמיגות מתונה כמות קטנה של גדילים שיורית של רקמה מעוכלת.צנטריפוגה המדגם ב 270 פעמים g במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של פתרון 1X RBC lysing עם פיפטה. דגירה הפתרון במשך דקה אחת ב 25 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של 15% FBS DMEM F12 צנטריפוגה זה 270 פעמים g במשך 10 דקות. כדי להכין את ECM, להקפיא / להפשיר את דגימת המע"מ שהוקפאה בעבר ל 37 מעלות צלזיוס על ידי דגירה אותו באמבט מים מחומם מראש במשך 20 דקות עם תסיסה ידנית עדינה תקופתית.לאחר הפשרה, להעביר את הרקמה בחזרה מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולחזור על תהליך ההקפאה / הפשרה שלוש פעמים שהסתיימו עם הפשרה. השתמש במדפים סטריליים כדי להעביר את דגימת המע"מ לצינור חרוט טרי של 50 מיליליטר המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון אנזימטי 1 כדי לוודא שהדגימה שקועה במלואה. ואז להדקר אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 130 סל"ד.ביום שלמחרת, לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ שטיפה, לשפוך את הפתרון לאחר כל לשטוף. מעבירים את הדגימה לצינור טרי של 50 מיליליטר עם 15-25 מיליליטר של פתרון אנזימטי 2 ודגירה אותו בן לילה. חזור על השטיפה עם פתרון חיץ השטיפה והעבר את הדגימה לצינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון מיצוי ממס קוטבי.הדגירה את הדגימה לילה תוך כדי רעידות. לאחר הדגירה עם פתרון ממס הקוטב, חשוב לבחון את המדגם להסרת השומנים. אם רוב השומנים אינם מוסרים, ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב זה.ניתן להשתמש בזמן דגירה קצר יותר. לאחר הדגירה, מעבירים את הדגימה לצינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון חיץ שטיפה ושוטפים את הדגימה שלוש פעמים על השייקר. לאחר מכן לשטוף את הדגימה שלוש פעמים עם 70% פתרון אתנול, לשפוך את האתנול לאחר כל לשטוף.לשטוף את המדגם פעם אחת עם פתרון אחסון, ולאחר מכן להשתמש מטליות סטריליות להעביר צינור טרי המכיל 15-25 מיליליטר של פתרון אחסון הקפדה לטבול אותו באופן מלא. לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד חודש. Isopropanol ואתנול הם דליקים חייב להיות בטמפרטורת החדר להיפטר פסולת דליקה.כל פסולת אנושית חייבת להיות מסולקת בנפרד מהפסולת הביולוגית הרגילה. העבר את שברי ECM המאוחסנים ל בארות בודדות של צלחת 24 בארות עם מדפים סטריליים הוספת שברים רבים כנדרש עבור המטענים במורד הזרם המתוכנן. לשטוף אותם שלוש פעמים עם 500 microliters של 70% אתנול על שייקר מסלולית, ולאחר מכן rehydrate אותם על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS.השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את ECM לרסיסים 100 מיליגרם. מניחים כל שבר לתוך באר אחת של צלחת 24 היטב דגירה את הצלחת ב 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר PBS עודף להתבלט מן השברים. ואז להסיר בזהירות כל שאריות PBS מן הבארים עם פיפטה.זרע כל שבר עם 20 microliters של השעיית תא preadipocyte על ידי צינורות התאים ישירות לתוך ECM. מניחים את קצה פיפטה ב- ECM ומסלקים אותו בעדינות למרכז המטריצה ומוודאים כי מתלי התא אינם גולשים ומסתיימות בתחתית הבאר. אם ההשעיה של התא גולשת מה- ECM, הסר את קצה הפיפסה ממיקום זה והוסף אותו למקום אחר ב- ECM.לאחר זריעת התא, הדגירה ECM במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מלאו כל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיית צמיחה כדי לכסות את שברי ה-ECM. תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות.לאחר 72 שעות, שאף בזהירות את תקשורת הצמיחה מבלי להפריע לרסיס ה-ECM. הוסף 500 microliters של מדיה התברואה ותרבות התאים במשך 14 ימים שינוי המדיה כל יומיים עד שלושה ימים. בדוק אם יש התבידול באמצעות מיקרוסקופיה קלה.תאים יצברו שומנים, יהפכו בצבע חום-צהוב ויהפכו כדוריים יותר ככל שהם מבדילים. הכנת ECM רקמת שומן, זריעה עם preadipocytes, בידול במבחנה לתוך adipocytes בוגרת היה במעקב עם סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים אשר חשף decellularization של ECM ו recapitulation לאחר מכן של שומנים המכילים adipocytes על reseeding והתמדה. קולגן 1 אימונוהיסטוכימיה ספציפית של ECM decellularized הראה תחזוקה של ארכיטקטורת מיקרו קולגן בעוד שמן אדום-O כתמים של מבנים חיים קבועים 3D ECM-adipocyte הראו שומנים המכילים adipocytes.האדיפוזיטים המובחנים ב- ECM הוסכו עבור גנים אדיפוגניים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת שהוכיח כי גנים אלה מוסדרים בתאים המובחנים ביחס לקדם-אדישות מובחנת בתרבות ב- ECM. ההבדל המלא ברמות התמליל מוצג. ארבעה שילובים של ECM ואדיפוזיטים מנבדקים סוכרתיים ולא סוכרתיים היו נתונים לפנוטיפים מטבוליים.ספיגת גלוקוז לקויה בתפקוד ליפוליטי התגלתה במבנונים מרקמות סוכרתיות. חשוב לציין, נמצא כי ECM לא סוכרתי מציל ספיגת גלוקוז מגורה אינסולין וקיבולת lipolytic בדיפוזיטים סוכרתיים. זיהום של preadipocytes מבודד, הרקמה decellularized, ו ECM reseeded אינו נדיר.סטריליות חייבת להישמר בחריצות לאורך כל הפרוטוקול.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...