Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l'assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall'Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figura 4 di questo manoscritto è stata originariamente pubblicata in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, ed è stato riprodotto su autorizzazione della Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Per il permesso di riutilizzare questo materiale, si prega di visitare http://global.oup.com/academic/rights.

Tessuti adiposi sono acquistati da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica elettiva sotto l'approvazione del comitato di revisione istituzionale.
1. Isolamento dei preadipociti e preparazione del reagente culturale
<ol><li>Preparare il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x soluzione salina tamponata da fosfato (PBS). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare collagenasi di tipo II: 2 mg/mL nel 2% BSA in 1x PBS. Preparare immediatamente prima ...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell'ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell'estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, me...

La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l'omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l'ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l'ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.
Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L'obesità è associata a ipertrofia eccessiva adipocite e ipossidi cellulare, difetti nel metabolismo cellulare adipocitico, e reticolato endoplasmico del tessuto adiposo e stress ossidativo e infiammazione. Anche se poco compresi, questi processi complessi cospirano per compromettere la capacità di tamponamento dei nutrienti del tessuto adiposo, portando a overflow dei nutrienti dal tessuto adiposo, tossicità nei tessuti multipli e malattia metabolica sistemica3,4 ,5. La sequenza di eventi e meccanismi specifici che sono alla base dell'insufficienza del tessuto adiposo sono poco conosciuti, ma sono state implicate alterazioni nel tessuto adiposo ECM. La composizione ECM è alterata all'interno del tessuto adiposo nell'obesità umana e murina, con una maggiore deposizione di proteine ECM insieme a differenze biochimiche e strutturali qualitative nel tessuto adiposo associato alla malattia metabolica umana, tra cui diabete di tipo 2 e iperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Nonostante queste osservazioni, il ruolo del tessuto adiposo ECM nella mediazione della disfunzione del tessuto adiposo non è ben definito. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di modelli sperimentali trattabili che consentono la dissezione dei ruoli specifici dell'ECM e degli adipociti nella regolazione della funzione adiposa finale dei tessuti. La coltura ECM-adipocite simula meglio l'ambiente in vivo del tessuto nativo adiposo in almeno due aspetti. In primo luogo, la coltura ECM fornisce un ambiente molecolare simile al tessuto adiposo nativo, tra cui collageni nativi, elastine e altre proteine matriciali assenti nella coltura 2D standard. In secondo luogo, la coltura sulla plastica 2D ha dimostrato di alterare il metabolismo degli adipociti attraverso effetti meccanici a causa della diminuzione dell'elasticità del substratoplastico 12, che ECM-cultura elimina.
I metodi per progettare scaffold biologici isolando l'ECM dall'adiposi decellularizzato e da altri tessuti sono stati studiati nel contesto della medicina rigenerativa e ricostruttiva e dell'ingegneria tissutale13,14, 15,16,17,18. Abbiamo precedentemente pubblicato una metodologia in cui abbiamo adattato questi metodi per sviluppare un modello in vitro 3D di coltura umana ECM-adipocyte, utilizzando ECM e cellule staminali adipocite (preadipociti) derivate da tessuti adipose viscerali umani11. Nel presente articolo vengono descritti questi metodi in dettaglio. La procedura di decellularizzazione per il tessuto adiposo umano è un processo di quattro giorni che prevede trattamenti meccanici ed enzimatici per rimuovere cellule e lipidi, lasciando uno scaffold biologico che mantiene le caratteristiche del tessuto da cui è derivato. L'ECM decellularizzato supporta la differenziazione adipogenica dei preadipociti umani e, se ricostituita con adipociti, mantiene la microarchitettura e le caratteristiche biochimiche e specifiche della malattia del tessuto adiposo intatto e si impegna in funzioni caratteristiche del tessuto adiposo nativo. Questa matrice può essere studiata da sola o reseeded con le cellule, permettendo lo studio delle interazioni e crosstalk tra i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto adiposo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
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a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L'ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell'obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell'ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell'ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l'ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all'interno dell'ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti adisposti.

Preparazione del tessuto adiposo, semina con preadipociti e differenziazione in vitro in adipociti maturi provocano chiari cambiamenti morfologici sequenziali nel tessuto che consente la valutazione visiva del progresso in tutto il protocollo (Figura 1) . I preadipociti utilizzati per il seeding dell'ECM sono isolati utilizzando la digestione del collagene e da campioni separati di IVA (Figura 2). La microscopia elettronica a sca...

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A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Il nostro protocollo dimostra che l'ECM può promuovere la differenziazione adipogenica in assenza di classici mediatori adipogenici ed è il primo a dimostrare una regolazione specifica della malattia del metabolismo cellulare da parte dell'ECM. La nostra tecnica fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel metabolismo dei tessuti adiposi e consente lo studio del ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi del tessuto adiposo. Rispetto alla coltura cellulare 2D standard, il nostro modello 3D consente un esame e una dissezione più robusti del cross-talk tra adipociti e ECM del tessuto adiposo nel contesto del diabete di tipo 2.Si consiglia di iniziare con campioni più piccoli per valutare quanto bene è cellularizzato. Tieni presente che c'è variabilità interpaziale nel modo in cui le cellule crescono e in che bene il tessuto decellularizza. È importante osservare il tessuto prima e dopo ogni passaggio per garantire che il tessuto stia diventando decellularizzato e per comprendere le potenziali differenze tra i campioni.Dopo aver ottenuto il tessuto adiposo viscerale o l'IVA dall'intervento chirurgico, prepararlo per la conservazione aggiungendo 5-10 grammi del tessuto a 15-25 millilitri di soluzione tampone di congelamento in un tubo conico da 50 millilitri. Immergere completamente il campione e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino alla decellularizzazione. Per l'isolamento dei preadipocite, posizionare due grammi di un campione fresco di IVA intatta in 20 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo II, quindi inserire forbici sterili nel tubo e tritare accuratamente il tessuto.Una volta tritato in un liquame fine, incubarlo nella soluzione di collagenasi a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale per 60 minuti. Dopo l'incubazione, filtrare il risultante digerito attraverso una rete di nylon da 100 micrometri in un tubo conico fresco da 50 millilitri. Il digerito dovrebbe essere un liquido giallo-arancio con viscosità moderata e una piccola quantità di fili residui di tessuto non digerito.Centrifugare il campione a 270 volte g per 10 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in due millilitri di soluzione di lysing 1X RBC con una pipetta. Incubare la soluzione per un minuto a 25 gradi Celsius, quindi aggiungere 10 millilitri di 15%FBS DMEM F12 e centrifugarla a 270 volte g per 10 minuti. Per preparare l'ECM, congelare/scongelare il campione di IVA precedentemente congelato a 37 gradi Celsius incubandolo in un bagno d'acqua preriscaldato per 20 minuti con agitazione manuale delicata periodica.Una volta scongelato, trasferire il tessuto a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti e ripetere il processo di congelamento / scongelamento tre volte terminando con lo scongelamento. Utilizzare forcep sterili per trasferire il campione di IVA in un tubo conico fresco da 50 millilitri contenente 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 1 assicurandosi che il campione sia completamente immerso. Quindi incubarlo durante la notte a 37 gradi Celsius mentre trema a 130 giri/min.Il giorno successivo, lavare il campione tre volte con 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo, versando la soluzione dopo ogni lavaggio. Trasferire il campione in un tubo fresco da 50 millilitri con 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 2 e incubarlo durante la notte. Ripetere i lavaggi con la soluzione tampone di risciacquo e trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di estrazione del solvente polare.Incubare il campione durante la notte mentre si trema. Dopo l'incubazione con la soluzione di solvente polare, è importante esaminare il campione per la rimozione lipidica. Se la maggior parte dei lipidi non viene rimossa, potrebbe essere necessario ripetere questo passaggio.Può essere utilizzato un tempo di incubazione più breve. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo e lavare il campione tre volte sullo shaker. Quindi lavare il campione tre volte con una soluzione di etanolo al 70%, versando l'etanolo dopo ogni lavaggio.Lavare il campione una volta con soluzione di stoccaggio, quindi utilizzare forcep sterili per trasferirlo in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di stoccaggio assicurandosi di immergerlo completamente. Il campione può quindi essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. L'isopropanolo e l'etanolo sono infiammabili e devono essere a temperatura ambiente e smaltiti in rifiuti infiammabili.Tutti i rifiuti umani devono essere smaltiti separatamente dai normali rifiuti a rischio biologico. Trasferire i frammenti di ECM immagazzinati su singoli pozzi di una piastra a 24 pomp po' con forcep sterili aggiungendo tutti i frammenti necessari per i test a valle pianificati. Lavarli tre volte con 500 microlitri di 70%etanolo su uno shaker orbitale, quindi reidratarli lavandoli tre volte con PBS.Utilizzare forbici sterili per tagliare l'ECM in frammenti da 100 milligrammi. Posizionare ogni frammento in un pozzo di una piastra di 24 po 'e incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 15 minuti per consentire al PBS in eccesso di estrudere dai frammenti. Quindi rimuovere con cura qualsiasi PBS rimasto dai pozzali con una pipetta.Seme ogni frammento con 20 microlitri di sospensione cellulare preadipocite tubazionando le cellule direttamente nell'ECM. Posizionare la punta della pipetta nell'ECM ed espellerla delicatamente al centro della matrice assicurandosi che la sospensione cellulare non trabocca e finisca nella parte inferiore del pozzo. Se la sospensione della cella trabocca dall'ECM, rimuovere la punta della pipetta da tale posizione e inserirla altrove nell'ECM.Dopo la semina cellulare, incubare l'ECM per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Riempire ogni bene con 500 microlitri di mezzi di crescita per coprire i frammenti di ECM seminati. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore.Dopo 72 ore, aspirare attentamente il mezzo di crescita senza disturbare il frammento ECM. Aggiungere 500 microlitri di mezzi di differenziazione e coltura le cellule per 14 giorni cambiando il supporto ogni due o tre giorni. Verificare la differenziazione utilizzando la microscopia ottica.Le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore marrone-giallo e diventeranno più sferiche man mano che si differenziano. La preparazione dell'ECM del tessuto adiposo, la semina con preadipociti e la differenziazione in vitro in adipociti maturi sono state monitorate con microscopia elettronica a scansione che ha rivelato la decellularizzazione dell'ECM e la successiva ricapitolazione dei lipidi contenenti adipociti al momento del reseeding e della differenziazione. L'immunoistochimica specifica collagene 1 dell'ECM decellularizzato ha mostrato il mantenimento della micro architettura del collagene mentre la colorazione Oil Red-O di costrutti 3D ECM-adipociti vivi e fissi ha mostrato lipidi contenenti adipociti.Gli adipociti differenziati in ECM sono stati vengono Viene mostrata la differenza completa nei livelli di trascrizione. Quattro combinazioni di ECM e adipociti di soggetti diabetici e non diabetici sono state sottoposte a fenotipizzazione metabolica.L'assorbimento alterato del glucosio nella funzione litivitica è stato scoperto nei costrutti dei tessuti diabetici. È importante sottolineare che l'ECM nondiabetica salva l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e la capacità limolitica negli adipociti diabetici. La contaminazione dei preadipociti isolati, del tessuto decellularizzato e dell'ECM risigillato non è rara.La sterilità deve essere diligentemente mantenuta in tutto il protocollo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Ricerca

Bioingegneria

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Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

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A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

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Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

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It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

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