Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

ダニエル・ベルガー、マリリン・ウッドラフ、シモーネ・コレア、レサ・ガイスの研究コーディネートに感謝します。SEMはミシガン大学顕微鏡・画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設によって行われました。このプロジェクトは、NIH助成金R01DK097449(RWO)、R01DK115190(RWO、CNL)、R01DK090262(CNL)、退役軍人功労助成金I01CX001811(RWO)、パイロットおよび実現可能性付与ミシガン糖尿病研究センター(NIH P30-D)から支援されました。退役軍人管理VISN 10スパークパイロットグラント(RWO)。ミシガン大学顕微鏡画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設による走査型電子顕微鏡この原稿の図4は、もともとベーカーら、Jクリン円doMetab 2017で出版されました。3月1;102 (3), 1032-1043.doi:10.1210/jc.2016-2915、オックスフォード大学出版局の許可により再現https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329。この資料の再利用の許可については、http://global.oup.com/academic/rightsをご覧ください。

脂肪組織は、制度的審査委員会の承認の下で選択的なバリヤード手術を受けているヒト被験者から調達される。
1. プレディポサイト単離と培養試薬調製
<ol><li>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製する。フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。</li>
	<li>II型コラゲラーゼを調製する: 2% BSA で 2 mg/mL 1x PBS.使用直前に準備してください。</li>
...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

ECM-脂肪細胞培養モデルは、ECMおよび細胞の個々の役割を究極の組織表現型のディクテーションで解剖するための貴重なツールを提供します。ECM分離プロトコルは非常に再現可能であるが、脱細胞化プロセスにおける変動性が観察され得る。3日目の脂質異常ステップは、プロトコルの重要なポイントです。一晩の抽出の完了時に、マトリックスの脱脂は、極性溶媒溶液が黄色に変わるように?...

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の機械的足場を提供するだけでなく、その中に存在する細胞との複雑なクロストークにも従事し、細胞増殖を含む組織恒常性に必要な多様なプロセスを調節し、分化、シグナル伝達、代謝1.健康なECMは正常組織機能の維持に不可欠な役割を果たしているが、機能不全ECMは多重疾患2に関与している。
脂肪組織は、代謝性疾患の病因において重要な役割を果たす。肥満は、過剰な脂肪細胞肥大および細胞低酸素症、脂肪細胞細胞代謝の欠陥、および脂肪組織小胞体および酸化ストレスおよび炎症に関連している。十分に理解されていないが、これらの複雑なプロセスは、脂肪組織の栄養緩衝能を損なう陰謀を引き起こし、脂肪組織からの栄養オーバーフロー、複数の組織における毒性、および全身代謝疾患3、4を引き起こす、5.脂肪組織の不全の根底にある一連の事象および特定のメカニズムは十分に理解されていないが、脂肪組織ECMの改変は関与している。ECM組成物は、ヒトおよびマウス肥満における脂肪組織内で改変され、ECMタンパク質の堆積と、ヒト代謝疾患に関連する脂肪組織ECMの定性的生化学的および構造的差異が増加した。2型糖尿病および高脂血症6、7、8、9、10、11.
これらの観察にもかかわらず、脂肪組織機能障害を媒媒を媒取する脂肪組織ECMの役割は十分に定義されていない。これは、ECMおよび脂肪細胞の特異的役割の解剖を可能にする、究極の脂肪組織機能の調節を可能にするトラクタブル実験モデルの欠如によるものである。ECM-脂肪細胞培養は、少なくとも2つの点において在来脂肪組織の生体内環境をより良くシミュレートする。まず、ECM培養は、天然のコラーゲン、エラスチン、および標準的な2D培養に存在しない他のマトリックスタンパク質を含む天然脂肪組織と同様の分子環境を提供する。第二に、2Dプラスチック上の培養は、ECM培養が排除するプラスチック基板12の弾性低下による機械的効果を介して脂肪細胞代謝を変化させることが示されている。
脱細胞化脂肪体および他の組織からのECMの単離によって生物学的足場を設計する方法は、再生・再建医学及び組織工学13、14の文脈で検討されている。 15、16、17、18.我々は、ヒト内臓脂肪組織11に由来するECMおよび脂肪細胞幹細胞(プレディポサイト)を用いて、ヒトECM-脂肪細胞培養のインビトロ3Dモデルを開発するためにこれらの方法を適応させた方法論をこれまでに公表した。本稿では、これらの方法について詳しく説明する。ヒト脂肪組織の脱細胞化手順は、細胞および脂質を除去するための機械的および酵素的処置を伴う4日間のプロセスであり、由来する組織の特性を維持する生物学的足場を残す。脱細胞化ECMは、ヒトのプレジポサイトの脂肪族分化をサポートし、脂肪細胞で再構成されると、マイクロアーキテクチャと生化学的および無傷の脂肪組織の疾患特異的特性を維持し、代謝に従事するネイティブ脂肪組織の特徴的な機能。このマトリックスは、単独で研究したり、細胞で再播種することができ、脂肪組織の細胞および細胞外の成分との間の相互作用およびクロストークの研究を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

細胞外マトリックス(ECM)は、組織恒常性を調節し、細胞とのクロストークに従事し、細胞機能の複数の側面を調節する上で中心的な役割を果たします。ECMは、肥満における脂肪組織機能において特に重要な役割を果たし、脂肪組織ECM堆積および組成物の変化は、マウスおよびヒトにおける代謝疾患と関連している。グローバル組織表現型に寄与するECMおよび細胞の役割の解剖を可能にするトラクティン可能なインビトロモデルはまばらである。我々は、脂肪組織代謝表現型を調節するECMおよび脂肪細胞の特定の役割の研究を可能にするヒトECM-脂肪細胞培養の新しい3D体外モデルを記述する。ヒト脂肪組織は、ECMを単離するために脱細胞化され、その後、ECM内で成熟脂肪細胞に分化するプレディポサイトで再設定される。この方法は、代謝活性であり、それらが由来する組織および患者の特性を保持するECM-脂肪細胞構築物を作成する。このシステムを用いて、ヒト脂肪組織における疾患特異的なECM-脂肪細胞クロストークを実証した。この培養モデルは、世界的な脂肪組織代謝表現型に寄与するECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。

脂肪組織ECMの調製、プレディポサイトによる播種、および成熟脂肪細胞への体外分化により、プロトコル全体の進行を視覚的に評価できる組織の明らかな逐次形態変化をもたらす(図1).ECMの播種に用いられるプレディポサイトは、別々のVATサンプルからのコラゲネアゼ消化を用いて単離される(図2)。処理の各段階におけるECM...

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A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in vitro培養システムを記述する。

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

我々のプロトコルは、ECMが古典的なアディポジェニックメディエーターの不在時に有数分化を促進する可能性があることを示し、ECMによる細胞代謝の疾患特異的調節を実証する最初の。我々の技術は、脂肪組織代謝におけるECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織の恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。標準的な2D細胞培養と比較して、当社の3Dモデルは、2型糖尿病の文脈における脂肪細胞と脂肪組織ECMの間のクロストークのより堅牢な検査と解剖を可能にします。小さいサンプルから始め、細胞化の度合いを測定することをお勧めします。細胞の成長の度合いと組織の脱細胞化には、患者間のばらつきがあることを覚えておいてください。各ステップの前後に組織を観察して、組織が脱細胞化されていることを確認し、サンプル間の潜在的な違いを理解することが重要です。手術から内臓脂肪組織またはVATを得た後、50ミリリットル円錐形チューブ内の凍結緩衝液の15〜25ミリリットルに組織の5〜10グラムを追加することによって貯蔵のためにそれを準備します。完全にサンプルを浸し、脱細胞化するまでマイナス80°Cで保存します。プリディポサイトの分離のために、コラゲターゼII型溶液の20ミリリットルに無傷のVATの新鮮なサンプルの2グラムを入れてから、チューブに滅菌ハサミを挿入し、組織を徹底的にミンチします。細かいスラリーにひき刻んだら、軌道シェーカーで37°Cのコラゲナーゼ溶液に60分間インキュベートします。インキュベーション後、100マイクロメートルのナイロンメッシュを通して消化した結果を、新鮮な50ミリリットルの円錐形チューブにフィルター処理します。消化されたのは、適度な粘度と未消化組織の残留鎖の少量を持つ黄色オレンジ色の液体である必要があります。サンプルを270回gで10分間遠心し、上清を取り除き、ピペットで1X RBC溶解溶液の2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。25°Cで1分間溶液をインキュベートし、15%FBS DMEM F12の10ミリリットルを加え、270回gで10分間遠心分離機を加えます。ECMを準備するには、定期的に穏やかな手動攪拌で20分間予熱水浴中でそれをインキュベートすることによって、以前に凍結したVATサンプルを摂氏37度に凍結/解凍します。解凍したら、組織をマイナス80度に20分間戻し、解凍で終わる凍結/解凍プロセスを3回繰り返します。滅菌鉗子を使用して、15〜25ミリリットルの酵素溶液1を含む新鮮な50ミリリットルの円錐チューブにVATサンプルを移し、サンプルが完全に浸漬されていることを確認します。その後、130 RPMで振りながら摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、15~25ミリリットルのリンスバッファー溶液でサンプルを3回洗浄し、洗浄後に溶液を注ぎます。サンプルを15~25ミリリットルの酵素溶液2で新鮮な50ミリリットルチューブに移し、一晩インキュベートします。リンスバッファー溶液でのこの溶液の化しを繰り返し、極性溶媒抽出液の15〜25ミリリットルを含む新鮮なチューブにサンプルを移します。振りながら一晩サンプルをインキュベートします。極性溶媒溶液でインキュベーションした後、脂質除去のためにサンプルを調べることが重要である。脂質の大部分が除去されない場合、この工程を繰り返す必要がある場合がある。より短いインキュベーション時間が使用されてもよい。インキュベーション後、15〜25ミリリットルのリンスバッファー溶液を含む新鮮なチューブにサンプルを移し、シェーカーでサンプルを3回洗浄します。その後、試料を70%エタノール溶液で3回洗浄し、各洗浄後にエタノールを注ぎ出す。サンプルを保存液で1回洗浄し、滅菌鉗子を使用して15〜25ミリリットルの貯蔵溶液を含む新鮮なチューブに移し、完全に浸漬してください。その後、サンプルは摂氏4度で最大1ヶ月間保存できます。イソプロパノールおよびエタノールは可燃性であり、室温で、可燃性廃棄物に廃棄されなければならない。人間の廃棄物は、通常のバイオハザード廃棄物とは別に処分する必要があります。保存されたECMフラグメントを、計画された下流アッセイに必要な数の断片を追加する無菌鉗子を備えた24ウェルプレートの個々の井戸に移します。軌道シェーカーで500マイクロリットルの70%エタノールで3回洗浄し、PBSで3回洗浄して水分補給します。100ミリグラムの断片にECMをカットするために滅菌はさみを使用してください。各断片を24ウェルプレートの1つの井戸に入れ、プレートを摂氏25度で15分間インキュベートし、余分なPBSが断片から押し出されるようにします。その後、慎重にピペットで井戸から残ったPBSを削除します。各断片に20マイクロリットルのプリディポサイト細胞懸濁液を播種し、細胞をECMに直接ピペット化します。ピペットチップをECMに入れ、マトリックスの中央にそっと出して、細胞懸濁液があふれないようにして、ウェルの底部に落とします。セル懸濁液が ECM からオーバーフローする場合は、その位置からピペットチップを取り外し、ECM 内の他の場所に挿入します。細胞播種後、摂氏37度で40分間ECMをインキュベートする。500マイクロリットルの成長培地を各ウェルに充填し、シードされたECMフラグメントをカバーします。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間培養します。72時間後、ECM断片を乱さずに成長培地を慎重に吸引する。500マイクロリットルの分化培地を加え、2~3日ごとに培地を交換して14日間細胞を培養します。光顕微鏡を使用して分化を確認します。細胞は脂質を蓄積し、色が茶色に変わり、分化するにつれてより球状になります。脂肪組織ECMの調製、前準備細胞による播種、および成熟脂肪細胞へのインビトロ分化を、ECMの脱細胞化及び再播種および分化時に脂肪細胞を含む脂質の再キャパライズを明らかにした走査型電子顕微鏡でモニタリングした。脱細胞化ECMのコラーゲン1特異的免疫細胞化学はコラーゲンマイクロアーキテクチャの維持を示し、一方で、生および固定された3D ECM-脂肪細胞構築物のオイルレッドO染色は脂肪細胞を含む脂質を示した。ECMで分化したアディポサイトを定量リアルタイムPCRを用いてアディポジェニック遺伝子についてスクリーニングし、これらの遺伝子がECMで培養された未分化前置細胞に対して分化細胞でアップレギュレートされていることを実証した。トランスクリプトレベルの全差が示される。糖尿病および非糖尿病の被験者からのECMおよびアディポサイトの4つの組み合わせが代謝型のフェノタイピングを行った。脂肪分解機能におけるグルコース取り込み障害は、糖尿病組織からの構築物で発見された。重要なことに、糖尿病性ECMは、糖尿病脂肪細胞におけるインスリン刺激グルコース取り込みおよび脂肪量を救うことが判明した。分離された前読細胞、脱細胞化組織、および再播種されたECMの汚染は珍しくない。無菌性は、プロトコル全体を通して熱心に維持されなければならない。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

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The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

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ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...