Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

Vi takker Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa, og Retha Geiss for assistanse til studie koordinering. SEM ble utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Dette prosjektet ble støttet av NIH tilskudd R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot og gjennomførbarhet Grant fra Michigan diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteraner administrasjon VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektron mikroskopi utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Figur 4 av dette manuskriptet ble opprinnelig publisert i Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1. mars 102 (3), 1032-1043. Doi: 10.1210/JC. 2016-2915, og har blitt gjengitt med tillatelse fra Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. For tillatelse til å gjenbruke dette materialet, kan du gå http://global.oup.com/academic/rights.

Fettvev er anskaffet fra menneskelige gjennomgår valgfag BARIATRIC kirurgi under institusjonelle gjennomgang styret godkjenning.
1. Preadipocyte isolasjon og kultur reagens forberedelse
<ol><li>Forbered 2% storfe serum albumin (BSA) i 1x fosfat bufret saltvann oppløsning (PBS). Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c.</li>
	<li>Klargjør type II-kollagenase: 2 mg/mL i 2% BSA i 1x PBS. Forbered umiddelbart før bruk.</li>
	<li>Forbered røde blodlegemer (RBC) lysering løsning: 1,5 M...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

ECM-adipocyte kultur modell gir et verdifullt verktøy for å dissekere de enkelte rollene til ECM og celler i å diktere ultimate vev fenotype. ECM-isolasjons protokollen er ganske reproduserbar, men variasjon i decellularization prosessen kan observeres. Delipidation-trinnet i dag 3 er et kritisk punkt i protokollen. Ved fullføring av overnight utvinning, bør delipidation av matrisen være dokumentert av Polar løsemiddel løsning snu gult, mens matrisen bør overgangen fra en gul-oransje farge karakteristisk for int...

Ekstracellulære matrise (ECM) gir ikke bare et mekanisk stillas for vev, men også engasjerer seg i komplekse crosstalk med celler som ligger innenfor det, regulere ulike prosesser som er nødvendige for vev homeostase, inkludert celle spredning, differensiering, signalering, og metabolisme1. Mens sunn ECM spiller en viktig rolle opprettholdelsen av normal vev funksjon, dysfunksjonelle ECM har vært innblandet i flere sykdommer2.
Fettvev spiller en viktig rolle i patogenesen av metabolsk sykdom. Fedme er forbundet med overdreven adipocyte hypertrofi og cellulær hypoksi, defekter i adipocyte cellulær metabolisme, og fettvev endoplasmatiske retikulum og oksidativt stress og betennelser. Mens dårlig forstått, disse komplekse prosesser konspirerer å svekke fettvev nærings buffer bufring kapasitet, noe som fører til næringsstoff overflyt fra fettvev, toksisitet i flere vev, og systemisk metabolsk sykdom3,4 ,5. Sekvensen av hendelser og spesifikke mekanismer som ligger til grunn fettvev svikt er dårlig forstått, men endringer i fettvev ECM har vært innblandet. ECM-sammensetningen er endret i fettvev i humant og murine fedme, med økt deponering av ECM-protein sammen med kvalitative biokjemiske og strukturelle forskjeller i fettvev ECM forbundet med menneskelig metabolsk sykdom, inkludert type 2 diabetes og hyperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Til tross for disse observasjonene, er rollen av fettvev ECM i formidling fettvev dysfunksjon ikke veldefinert. Dette er delvis på grunn av mangel på medgjørlig eksperimentelle modeller som tillater Disseksjon av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i å regulere ultimate fettvev funksjon. ECM-adipocyte kultur simulerer bedre in vivo miljø av innfødte fettvev i minst to henseender. For det første gir ECM-kulturen et molekyl miljø som ligner på det innfødte fettvevet, inkludert innfødte kollagen, elastins og andre matrise proteiner fraværende i standard 2D-kultur. Dernest har kultur på 2D plast vist å endre adipocyte metabolisme via mekaniske effekter på grunn av redusert elastisitet av plast substrat12, som ECM-kultur eliminerer.
Metoder for å utvikle biologiske stillaser ved isolering av ECM fra decellularized fett og annet vev har blitt studert i sammenheng med regenererende og rekonstruktiv medisin og vev engineering13,14, 15,16,17,18. Vi har tidligere publisert metodikk der vi tilpasset disse metodene for å utvikle en in vitro 3D modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur, ved hjelp av ECM og adipocyte stamceller (preadipocytes) avledet fra menneskelige visceral fettvev11. I denne artikkelen beskriver vi disse metodene i detalj. Den decellularization prosedyre for menneskelig fettvev er en fire-dagers prosess som innebærer mekaniske og enzymatisk behandlinger for å fjerne celler og lipid, etterlot seg en biologisk stillas som opprettholder egenskapene til vevet som det er avledet. Decellularized ECM støtter adipogenic differensiering av menneskelig preadipocytes, og når tilberedt med adipocytter, opprettholder mikroarkitektur og biokjemiske og sykdoms-spesifikke karakteristikker av intakt fettvev og engasjerer seg i metabolske funksjoner karakteristisk for innfødte fettvev. Denne matrisen kan bli studert alene eller reseeded med celler, tillater studier av interaksjoner og crosstalk mellom cellulære og ekstracellulære komponenter av fettvev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

Den ekstracellulære matrise (ECM) spiller en sentral rolle i å regulere vev homeostase, engasjere seg i crosstalk med celler og regulere flere aspekter av cellulære funksjon. ECM spiller en spesielt viktig rolle i fettvev funksjon i fedme, og endringer i fettvev ECM avsetning og sammensetning er forbundet med metabolsk sykdom hos mus og mennesker. Medgjørlig in vitro modeller som tillater Disseksjon av rollene til ECM og celler i å bidra til global vev fenotype er sparsom. Vi beskriver en roman 3D in vitro modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur som tillater studier av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i regulering fettvev metabolsk fenotype. Humant fettvev er decellularized å isolere ECM, som senere repopulated med preadipocytes som deretter skilles innenfor ECM i modne adipocytter. Denne metoden skaper ECM-adipocyte konstruksjoner som er metabolically aktive og beholde egenskapene til vev og pasienter som de er avledet. Vi har brukt dette systemet til å demonstrere sykdoms spesifikk ECM-adipocyte crosstalk i humant fettvev. Denne kulturen modellen gir et verktøy for å dissekere rollene til ECM og adipocytter i å bidra til globale fettvev metabolske fenotype og tillatelser studie av rollen til ECM i regulering fettvev homeostase.

Utarbeidelse av fettvev ECM, seeding med preadipocytes, og in vitro differensiering inn modne adipocytter resultere i klare sekvensielle morfologiske endringer i vev som tillater visuell vurdering av fremgang gjennom protokollen (figur 1) . Preadipocytes som brukes til å frø ECM er isolert ved hjelp av kollagenase fordøyelse fra separate mva-prøver (figur 2). Scanning elektron mikroskopi av ECM-adipocyte konstruksjoner på hv...

Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Vi beskriver en 3D Human ekstracellulære Matrix-adipocyte in vitro kultur system som tillater Disseksjon av rollene til matrisen og adipocytter i å bidra til fettvev metabolske fenotype.

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Vår protokoll viser at ECM kan fremme adipogenic differensiering i fravær av klassiske adipogenic mediators og er den første til å demonstrere sykdomsspesifikk regulering av cellulær metabolisme av ECM. Vår teknikk gir et verktøy for å dissekere rollene til ECM og adipocytter i fettvevmetabolisme og tillate studie av ECM-rollen i å regulere fettvevs homeostase. Sammenlignet med standard 2D-cellekultur, gir vår 3D-modell mulighet for mer robust undersøkelse og disseksjon av krysssnakk mellom adipocytter og fettvev ECM i sammenheng med type 2 diabetes.Vi anbefaler at du begynner med mindre prøver for å måle hvor godt det er cellisert. Husk at det er interpatient variasjon i hvor godt cellene vokser og hvor godt vevet decellularizes. Det er viktig å observere vevet før og etter hvert trinn for å sikre at vevet blir decellularisert og for å forstå potensielle forskjeller mellom prøver.Etter å ha fått visceral fettvev eller moms fra kirurgi, forberede den for lagring ved å legge til 5-10 gram av vevet til 15-25 milliliter frysing buffer løsning i en 50 milliliter konisk rør. Dypp prøven helt og oppbevar den på minus 80 grader Celsius til decellularisering. For preadipocyttisolasjon, legg to gram av en fersk prøve av intakt mva i 20 milliliter collagenase type II-løsning, sett deretter steril saks inn i røret og hakke vevet grundig.Når hakket til en fin slurry, inkubere den i collagenaseløsningen ved 37 grader Celsius på en orbital shaker i 60 minutter. Etter inkubasjonen filtrerer du den resulterende fordøyd gjennom en 100 mikrometer nylon mesh inn i en frisk 50 milliliter konisk rør. Den fordøyde skal være en gul-oransje væske med moderat viskositet og en liten mengde gjenværende tråder av ufordøyd vev.Sentrifuger prøven på 270 ganger g i 10 minutter, fjern supernatanten og gjenoppuss cellepelleten i to milliliter 1X RBC lysing løsning med en pipette. Inkuber løsningen i ett minutt ved 25 grader Celsius, og legg deretter til 10 milliliter 15% FBS DMEM F12 og sentrifuge den på 270 ganger g i 10 minutter. For å forberede ECM, frys / tine den tidligere frosne mva-prøven til 37 grader Celsius ved å inkubere den i et forvarmet vannbad i 20 minutter med periodisk mild manuell agitasjon.Når tint, overføre vevet tilbake til minus 80 grader Celsius i 20 minutter og gjenta fryse / tine prosessen tre ganger slutter med tining. Bruk sterile tang til å overføre mva-prøven til et friskt konisk rør på 50 milliliter som inneholder 15-25 milliliter enzymatisk løsning 1, og pass på at prøven er fullstendig nedsenket. Deretter inkubere den over natten ved 37 grader Celsius mens du rister ved 130 RPM.På neste dag vasker du prøven tre ganger med 15-25 milliliter skyllebufferløsning, og heller av løsningen etter hver vask. Overfør prøven til et friskt 50 ml ml med 15-25 milliliter enzymatisk løsning 2 og inkuber den over natten. Gjenta vaskene med skyllebufferløsningen og overfør prøven til et friskt rør som inneholder 15-25 milliliter polar oppløsningsvæskeekstraksjonsløsning.Inkuber prøven over natten mens du rister. Etter inkubasjon med den polare løsningsmiddelløsningen er det viktig å undersøke prøven for lipidfjerning. Hvis det meste av lipiden ikke fjernes, kan det være nødvendig å gjenta dette trinnet.Kortere inkubasjonstid kan brukes. Etter inkubasjonen, overfør prøven til et friskt rør som inneholder 15-25 milliliter skyllebufferløsning og vask prøven tre ganger på shakeren. Vask deretter prøven tre ganger med 70% etanoloppløsning, helle av etanol etter hver vask.Vask prøven én gang med oppbevaringsløsning, og bruk deretter sterile tang til å overføre til et friskt rør som inneholder 15-25 milliliter oppbevaringsløsning, og sørg for å senke den helt ned. Prøven kan deretter lagres ved fire grader Celsius i opptil en måned. Isopropanol og etanol er brannfarlig og må være ved romtemperatur og kastes i brennbart avfall.Alt menneskelig avfall må kastes separat fra det vanlige biohazardavfallet. Overfør de lagrede ECM-fragmentene til individuelle brønner av en 24-brønns plate med sterile tang som legger til så mange fragmenter som kreves for de planlagte nedstrømsanalysene. Vask dem tre ganger med 500 mikroliter på 70% etanol på en orbital shaker, og rehydrere dem ved å vaske tre ganger med PBS.Bruk steril saks for å kutte ECM i 100 mg fragmenter. Plasser hvert fragment i en brønn av en 24-brønns plate og inkuber platen ved 25 grader Celsius i 15 minutter for å tillate overflødig PBS å ekstrudere fra fragmentene. Fjern deretter forsiktig eventuelle rester av PBS fra brønnene med en pipette.Seed hvert fragment med 20 mikroliter preadipocytt celle suspensjon ved å pipetting cellene direkte inn i ECM. Plasser pipettespissen i ECM og fjern den forsiktig inn i midten av matrisen og pass på at cellefjæringen ikke renner over og ender opp nederst på brønnen. Hvis cellefjæringen renner over fra ECM, fjerner du pipettespissen fra dette stedet og setter den inn andre steder i ECM.Etter cellesåing inkuber ECM i 40 minutter ved 37 grader Celsius. Fyll hver brønn med 500 mikroliter vekstmedier for å dekke de seedede ECM-fragmentene. Kultur cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 72 timer.Etter 72 timer, nøye aspirere vekstmediene uten å forstyrre ECM fragment. Legg til 500 mikroliter differensieringsmedier og kultur cellene i 14 dager som endrer mediene hver to til tre dager. Se etter differensiering ved hjelp av lett mikroskopi.Celler vil akkumulere lipider, bli brun-gul i farge og bli mer sfæriske som de differensiere. Fremstilling av fettvev ECM, såing med preadipocytter, og in vitro differensiering i modne adipocytter ble overvåket med skanning elektronmikroskopi som avslørte decellularisering av ECM og påfølgende rekapitulasjon av lipid som inneholder adipocytter ved reseeding og differensiering. Kollagen 1 spesifikk immunohistochemistry av decellularized ECM viste vedlikehold av kollagen mikro arkitektur mens Olje Rød-O farging av levende og fast 3D ECM-adipocyte konstruksjoner viste lipid som inneholder adipocytter.De adipocytter differensiert i ECM ble screenet for adipogenic gener ved hjelp av kvantitative sanntid PCR som viste at disse genene er oppregulert i de differensierte cellene i forhold til udifferensier dyrket i ECM. Den fullstendige forskjellen i transkripsjonsnivåer vises. Fire kombinasjoner av ECM og adipocytter fra diabetikere og ikke-diabetikere ble utsatt for metabolsk fenotyping.Nedsatt glukoseopptak i lipolytisk funksjon ble oppdaget i konstruksjoner fra diabetisk vev. Viktigere, Det ble funnet at ikke-diabetisk ECM redder insulin-stimulert glukoseopptak og lipolytisk kapasitet i diabetiske adipocytter. Kontaminering av de isolerte preadipocytter, decellularisert vev, og reseeded ECM er ikke uvanlig.Steriliteten må opprettholdes flittig gjennom hele protokollen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Et hormon-responsive 3D Culture Model of Human melkekjertlene Epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggingen av et flerlags Mesenchymal stamceller ark med en 3D dynamisk kultur-systemet

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Måling av Global mobilnettet matrise Metalloproteinase og metabolsk aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetode for å opprettholde quiescent humane hematopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...